王海嬌，何紅美，祁麟，崔玉嬌，肖春輝，王毅△

人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞來自胚胎外滋養(yǎng)層，具有滋養(yǎng)功能，調(diào)節(jié)胚胎形成、植入，對順利妊娠具有重要作用［1-2］。滋養(yǎng)層細(xì)胞異常凋亡、侵襲可引起胎兒生長受限、流產(chǎn)［3］、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥［4］、子癇［5］等疾病。研究滋養(yǎng)層細(xì)胞的行為學(xué)功能對于探究上述疾病的發(fā)病機制及治療具有重要意義。T-鈣黏蛋白（T-cadherin）是附著在細(xì)胞膜上的非經(jīng)典黏附因子，通過調(diào)節(jié)鈣介導(dǎo)的細(xì)胞極性、細(xì)胞黏附等方式參與細(xì)胞間信號傳導(dǎo)及識別，與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移聯(lián)系密切［6］。T-cadherin在人胃癌、宮頸癌細(xì)胞中低表達，T-cadherin 過表達可顯著抑制癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移［7-8］。因此推測T-cadherin 的表達可能與人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、遷移等存在關(guān)聯(lián)。氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）是低密度脂蛋白中大量不飽和脂肪酸在氧化作用下生成的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，在子癇前期患者體內(nèi)呈現(xiàn)高表達［9］。研究發(fā)現(xiàn)ox-LDL可致人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、侵襲能力受損，細(xì)胞異常凋亡等，與子癇等疾病密切相關(guān)［10-11］。本研究通過分析T-cadherin 對ox-LDL 誘導(dǎo)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、凋亡等異常生物學(xué)行為的影響，為保證胎盤正常功能和胎兒正常生長發(fā)育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo（批號CL-0599）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。T-cadherin 小干擾RNA（siRNA）、T-cadherin siRNA 陰性對照由武漢益普生物科技有限公司設(shè)計并合成；Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）凋亡檢測試劑盒、BCA 蛋白試劑盒、SYBR 實時熒光定量PCR（qPCR）試劑盒均購自美國Invitrogen公司；RPMI 1640培養(yǎng)液、RNA提取試劑盒、四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒、RIPA裂解液均購自北京索萊寶科技有限公司；結(jié)晶紫染液、蛋白提取試劑盒均購自上海碧云天公司；兔源胱天蛋白酶-3（Caspase-3）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、GAPDH 抗體、羊抗兔二抗均購自英國Abcam 公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、qPCR儀、酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀均購自上海百典儀器設(shè)備有限公司；細(xì)胞計數(shù)器、凝膠成像儀均購自萊普特科學(xué)儀器（北京）有限公司；倒置顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HTR-8/SVneo 細(xì)胞株于37 ℃恒溫水浴鍋中復(fù)蘇后轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，反復(fù)吹打細(xì)胞，待其充分懸浮后接種在培養(yǎng)瓶中，用RPMI 1640培養(yǎng)液（含1%的青鏈霉素混合液、10%胎牛血清）在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每2 d 更換1 次培養(yǎng)液；待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶后利用0．25%胰蛋白酶進行消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞分組 取對數(shù)生長期HTR-8/SVneo 細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為4×106個/mL，取2 mL 接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)24 h，將細(xì)胞隨機分為空白對照組（用RPMI 1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞）、ox-LDL組（用RPMI 1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)的基礎(chǔ)上給予100 mg/L ox-LDL［11］處理48 h 誘導(dǎo)細(xì)胞）、T-cadherin siRNA 陰性對照組和T-cadherin siRNA 組。T-cadherin siRNA 陰性對照組和T-cadherin siRNA 組先通過Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒分別轉(zhuǎn)染T-cadherin siRNA陰性對照、T-cadherin siRNA，然后給予100 mg/L ox-LDL 處理48 h誘導(dǎo)細(xì)胞。收集各組HTR-8/SVneo細(xì)胞進行后續(xù)實驗，每組均重復(fù)6次。

1.2.3 qPCR 法檢測HTR-8/SVneo 細(xì)胞中T-cadherin mRNA表達 提取各組細(xì)胞的總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒要求得到cDNA，然后按照qPCR 試劑盒說明書進行反應(yīng)。以U6 作為內(nèi)參。T-cadherin 引物序列：上游5'-TTCAGCAGAAAGTGTTCCATAT-3'，下游5'-GTGCATGGACGAACAGAGT-3'；U6 引物序列：上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。反應(yīng)體系：ddH2O 8 μL，SYBR qPCR mix 10 μL，上下游引物各0．5 μL，cDNA 模板1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，然后進行40 個循環(huán)（95 ℃變性10 s、60 ℃退火延伸20 s，72 ℃延伸10 s）。根據(jù)2-ΔΔCt法進行T-cadherin mRNA表達水平分析。

1.2.4 MTT 法檢測HTR-8/SVneo 細(xì)胞增殖情況 收集各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個/孔并接種于96 孔板，培養(yǎng)細(xì)胞48 h后加入10 μL MTT 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心去除上清液，加入110 μL Formazan溶解液并搖勻，于酶標(biāo)儀490 nm波長處測定各孔吸光度值，計算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率=（1-各處理組吸光度值/空白對照組吸光度值）×100%。

1.2.5 平板克隆形成實驗檢測HTR-8/SVneo 細(xì)胞克隆形成情況 取各組細(xì)胞，按照200 個/孔的細(xì)胞密度接種在24 孔板中，于CO2培養(yǎng)箱（37 ℃、5%）中培養(yǎng)14 d。期間每3 d更換1 次培養(yǎng)液，采用4%的多聚甲醛固定，1%的結(jié)晶紫進行染色，經(jīng)PBS沖洗干凈后進行拍照。根據(jù)公式計算克隆形成率（克隆形成率=克隆細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%）。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測HTR-8/SVneo 細(xì)胞凋亡情況 各組細(xì)胞用胰蛋白酶進行消化后經(jīng)完全培養(yǎng)基終止消化，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/mL 并轉(zhuǎn)移至1 mL 無菌離心管中，用PBS清洗2 次后離心去除上清液，加入70%的乙醇溶液（4 ℃）固定過夜，經(jīng)PBS溶液清洗后將細(xì)胞重懸，一次加入2 μL RNA酶（去除內(nèi)源性RNA）、5 μL Annexin V-FITC（標(biāo)記細(xì)胞），靜置45 min后再加入2 μL PI 溶液避光染色1 h，于流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7 Transwell 實驗檢測HTR-8/SVneo 細(xì)胞侵襲能力 收集各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至2×105個/mL，取200 μL細(xì)胞液加入預(yù)鋪設(shè)好的Transwell小室的上室，用RPMI 1640培養(yǎng)液補至1 mL，下室僅加入600 μL完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后輕輕拭去未過膜的細(xì)胞，將小室置于4%多聚甲醛中固定20 min后室溫條件下風(fēng)干，用結(jié)晶紫染液（1%）浸染20 min 后室溫條件下風(fēng)干，在光學(xué)顯微鏡下觀察HTR-8/SVneo 細(xì)胞侵襲情況。隨機讀取6個視野，計算侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.8 劃痕實驗檢測HTR-8/SVneo 細(xì)胞遷移能力 收集各組HTR-8/SVneo 細(xì)胞置于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2）中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿板內(nèi)85%左右時，用200 μL 槍頭垂直于6 孔板底部做直線劃痕，之后細(xì)胞繼續(xù)置于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2）中培養(yǎng)24 h，于倒置光學(xué)顯微鏡下拍照觀察，利用Image J軟件測量劃痕區(qū)域?qū)挾龋⒂嬎慵?xì)胞劃痕愈合率，劃痕愈合率=［1-（24 h時劃痕寬度/0 h時劃痕寬度）］×100%。

1.2.9 蛋白免疫印跡實驗檢測HTR-8/SVneo 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2 和侵襲遷移相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9表達情況 取各組細(xì)胞，調(diào)整密度為3×106個/mL，接種于24孔板中，加入RIPA 裂解液，裂解30 min 后離心，取上清液至無菌離心管中，根據(jù)BCA蛋白試劑盒操作步驟測定蛋白質(zhì)含量。電泳分離等量蛋白質(zhì)，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，加入封閉液封閉1 h，4 ℃下添加兔源Caspase-3、Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、內(nèi)參GAPDH 一抗（均為1∶500）孵育過夜；用TBST緩沖液洗滌3 次，添加羊抗兔二抗（1∶1 000），常溫孵育2 h，經(jīng)凝膠成像儀對蛋白相對表達水平進行分析（目的蛋白/內(nèi)參蛋白）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25．0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較進行單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HTR-8/SVneo 細(xì)胞T-cadherin mRNA 表達水平比較 空白對照組、ox-LDL 組、T-cadherin siRNA 陰性對照組和T-cadherin siRNA 組Tcadherin mRNA 表達水平分別為1．02±0．17、1．56±0．23、1．51±0．19 和1．09±0．05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=15．555，P＜0．01）；與空白對照組相比，ox-LDL 組和T-cadherin siRNA 陰性對照組T-cadherin mRNA 表達水平升高（P＜0．05）；與ox-LDL 組相比，Tcadherin siRNA 陰性對照組T-cadherin mRNA 表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，T-cadherin siRNA 組Tcadherin mRNA 表達水平降低（P＜0．05）；與Tcadherin siRNA 陰性對照組相比，T-cadherin siRNA組T-cadherin mRNA表達水平顯著降低（P＜0．05）。

2.2 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖抑制率、克隆形成率比較 與空白對照組相比，ox-LDL 組和Tcadherin siRNA陰性對照組增殖抑制率升高，克隆形成率降低（P＜0．05）；與ox-LDL 組相比，T-cadherin siRNA陰性對照組增殖抑制率和克隆形成率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，T-cadherin siRNA 組增殖抑制率降低，克隆形成率升高（P＜0．05）；與T-cadherin siRNA 陰性對照組相比，T-cadherin siRNA 組增殖抑制率降低，克隆形成率升高（P＜0．05）。見表1，圖1。

Tab.1 Comparison of proliferation inhibition rate and clone formation rate between the four groups of HTR-8/SVneo cells表1 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖抑制率、克隆形成率比較（n=6，%，±s）

Tab.1 Comparison of proliferation inhibition rate and clone formation rate between the four groups of HTR-8/SVneo cells表1 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖抑制率、克隆形成率比較（n=6，%，±s）

＊＊P＜0．01；a 與空白對照組相比，b 與ox-LDL 組相比，c 與Tcadherin siRNA陰性對照組相比，P＜0．05。

組別空白對照組ox-LDL組T-cadherin siRNA陰性對照組T-cadherin siRNA組F細(xì)胞增殖抑制率10．96±1．68 32．64±4．11a 31．23±3．97a 20．60±3．06bc 55．031＊＊細(xì)胞克隆形成率39．26±4．35 15．42±2．37a 16．85±2．16a 28．08±3．18bc 75．487＊＊

2.3 各組HTR-8/SVneo 細(xì)胞凋亡情況比較 空白對照組、ox-LDL 組、T-cadherin siRNA 陰性對照組、T-cadherin siRNA 組細(xì)胞凋亡率（%）分別為10．69±2．98、32．47±5．20、33．04±5．13 和21．06±3．98，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=34．721，P＜0．05）。與空白對照組相比，ox-LDL 組和T-cadherin siRNA 陰性對照組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0．05）；與ox-LDL 組相比，Tcadherin siRNA 陰性對照組凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，T-cadherin siRNA 組凋亡率降低（P＜0．05）；與T-cadherin siRNA 陰性對照組相比，T-cadherin siRNA組凋亡率降低（P＜0．05）。見圖2。

Fig．1 Morphological observation of HTR-8/SVneo cell clone formation in each group(crystal violet staining,×40）圖1 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞克隆形成形態(tài)學(xué)觀察（結(jié)晶紫染色，×40）

2.4 各組HTR-8/SVneo 細(xì)胞侵襲和遷移能力比較 與空白對照組相比，ox-LDL 組和T-cadherin siRNA 陰性對照組侵襲細(xì)胞數(shù)、劃痕愈合率降低（P＜0．05）；與ox-LDL 組相比，T-cadherin siRNA 陰性對照組細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)、劃痕愈合率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，T-cadherin siRNA 組侵襲細(xì)胞數(shù)、劃痕愈合率升高（P＜0．05）；與T-cadherin siRNA 陰性對照組相比，T-cadherin siRNA 組侵襲細(xì)胞數(shù)、劃痕愈合率升高（P＜0．05）。見表2，圖3、4。

2.5 各組HTR-8/SVneo 細(xì)胞Caspase-3、Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平比較 與空白對照組相比，ox-LDL 組和T-cadherin siRNA 陰性對照組Caspase-3、Bax 蛋白表達水平升高，Bcl-2、MMP-2、MMP-9 蛋白表達水平降低（P＜0．05）；與ox-LDL 組相比，T-cadherin siRNA陰性對照組Caspase-3、Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，T-cadherin siRNA 組Caspase-3、Bax 蛋白表達水平降低，Bcl-2、MMP-2、MMP-9 蛋白表達水平升高（P＜0．05）；與T-cadherin siRNA陰性對照組相比，T-cadherin siRNA 組Caspase-3、Bax 蛋白表達水平降低，Bcl-2、MMP-2、MMP-9 蛋白表達水平升高（P＜0．05）。見圖5，表3。

Tab.2 Comparison of the number of invasive cells and scratch healing rate of HTR-8/SVneo cells between the four groups表2 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)和劃痕愈合率比較（n=6，±s）

Tab.2 Comparison of the number of invasive cells and scratch healing rate of HTR-8/SVneo cells between the four groups表2 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)和劃痕愈合率比較（n=6，±s）

＊＊P＜0．01；a 與空白對照組相比，b 與ox-LDL 組相比，c 與Tcadherin siRNA陰性對照組相比，P＜0．05。

組別空白對照組ox-LDL組T-cadherin siRNA陰性對照組T-cadherin siRNA組F侵襲細(xì)胞數(shù)（個/視野）140．22±22．95 65．47±8．04a 66．06±8．06a 98．53±10．03bc 39．563＊＊劃痕愈合率（%）25．66±4．30 9．08±1．09a 9．12±1．13a 20．11±3．77bc 46．731＊＊

Fig．2 Apoptosis of HTR-8/SVneo cells in each group圖2 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞凋亡情況

Fig．3 Invasion of HTR-8/SVneo cells in each group(crystal violet staining,×200)圖3 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲情況（結(jié)晶紫染色，×200）

Fig．4 Migration of HTR-8/SVneo cells in each group(×100)圖4 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移情況（×100）

Fig．5 Western blot results of Caspase-3,Bax,Bcl-2,MMP-2 and MMP-9 protein of HTR-8/SVneo cells in each group圖5 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞Caspase-3、Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白印跡圖

3 討論

ox-LDL是被氧化修飾后的低密度脂蛋白，具有極強的細(xì)胞毒性，是造成血管內(nèi)皮損傷的關(guān)鍵。ox-LDL可增加細(xì)胞對低密度脂蛋白的通透性，進而損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12-13］。研究表明ox-LDL同樣可誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡，并促進滋養(yǎng)層細(xì)胞中凋亡相關(guān)因子Caspase-3 等的表達［10］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過ox-LDL誘導(dǎo)的HTR-8/SVneo細(xì)胞克隆形成能力、細(xì)胞侵襲及遷移能力顯著下降，增殖抑制率、凋亡率顯著升高，表明ox-LDL 具有誘導(dǎo)HTR-8/SVneo細(xì)胞凋亡，降低其侵襲能力的作用。

滋養(yǎng)層細(xì)胞具有類似腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移等能力，與胚胎著床及胚胎植入密切相關(guān)［14］。妊娠早期，滋養(yǎng)層細(xì)胞生長迅速，并可侵襲子宮內(nèi)膜、螺旋小動脈、肌層等，使正常基質(zhì)層減少，血管內(nèi)皮細(xì)胞增加，血管阻力降低，形成高氧分壓的血管網(wǎng)，并擔(dān)負(fù)著母胎之間營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)、氣體交換等重任［15-16］。胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞分化、侵襲、黏附能力不足會導(dǎo)致胚胎血管生理性重鑄障礙、胚胎淺著床、胎盤供血供氧不足等，引發(fā)局部氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)及毒性因子，引發(fā)胎兒血管內(nèi)皮損傷、多系統(tǒng)受累等，最終導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的發(fā)生［17］。周小波等［18］研究發(fā)現(xiàn)子癇前期患者胎盤組織中滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡水平顯著高于正常孕婦，其凋亡的發(fā)生與線粒體自噬密切相關(guān)。T-cadherin 是細(xì)胞黏附分子家族成員，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、聚集、遷移、識別及信號傳遞等作用［19-20］。研究顯示T-cadherin 是一種抑癌基因，在卵巢癌中表達降低，低表達的T-cadherin可促進卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移等能力［21］。但關(guān)于T-cadherin 與人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的研究較少。本研究通過對HTR-8/SVneo 細(xì)胞轉(zhuǎn)染T-cadherin siRNA，結(jié)果顯示，與ox-LDL 組相比，T-cadherin siRNA 組HTR-8/SVneo 細(xì)胞中T-cadherin mRNA 表達水平顯著降低，表明T-cadherin siRNA 轉(zhuǎn)染效率較好，可進行后續(xù)實驗。

細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2 的表達可側(cè)面反映細(xì)胞凋亡情況［22］，侵襲遷移相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9表達水平與細(xì)胞的浸潤程度密切相關(guān)，MMP-2、MMP-9 表達水平越高表明細(xì)胞侵襲能力越強［23］。本研究結(jié)果顯示，與ox-LDL 組相比，Tcadherin siRNA組HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率、Caspase-3、Bax 蛋白表達水平顯著降低，克隆形成率、侵襲、遷移能力、Bcl-2、MMP-2、MMP-9 蛋白表達水平顯著升高，提示低表達T-cadherin 可顯著抑制由ox-LDL 誘導(dǎo)的HTR-8/SVneo 細(xì)胞異常凋亡，對于治療妊娠期間HTR-8/SVneo 細(xì)胞異常凋亡引發(fā)的疾病具有一定的幫助。

綜上所述，本研究初步明確沉默T-cadherin 可顯著抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的HTR-8/SVneo 細(xì)胞異常凋亡，并促進細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力，但HTR-8/SVneo 細(xì)胞異常凋亡的機制復(fù)雜，關(guān)于維持HTR-8/SVneo細(xì)胞正常功能方面仍需深入研究。

Tab.3 Comparison of expression levels of Caspase-3,Bax,Bcl-2,MMP-2 and MMP-9 protein in HTR-8/SVneo cells between the four groups表3 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞Caspase-3、Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平比較 （n=6，±s）

Tab.3 Comparison of expression levels of Caspase-3,Bax,Bcl-2,MMP-2 and MMP-9 protein in HTR-8/SVneo cells between the four groups表3 各組HTR-8/SVneo細(xì)胞Caspase-3、Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0．01；a與空白對照組相比，b與ox-LDL組相比，c與T-cadherin siRNA陰性對照組相比，P＜0．05。

組別空白對照組ox-LDL組T-cadherin siRNA陰性對照組T-cadherin siRNA組F Caspase-3 0．96±0．09 1．65±0．18a 1．62±0．17a 1．17±0．14bc 31．227＊＊Bax 1．01±0．10 1．70±0．18a 1．72±0．19a 1．35±0．13bc 28．419＊＊Bcl-2 1．03±0．09 0．21±0．02a 0．18±0．03a 0．66±0．07bc 274．909＊＊MMP-2 1．02±0．11 0．26±0．04a 0．28±0．04a 0．73±0．08bc 150．516＊＊MMP-9 0．97±0．12 0．31±0．04a 0．29±0．03a 0．72±0．07bc 120．541＊＊