熊喜成,王一平,王剛,張?zhí)穑披?,迪娜·艾尼瓦爾,孫湛,2△
《中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告2020概要》表明,2018年心血管疾病死亡占我國(guó)城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位[1]。隨著老齡化的加劇,心血管疾病發(fā)生率明顯增加[2]?;贚ogistic 回歸模型對(duì)心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)顯示,隨著年齡的增長(zhǎng),心血管疾病死亡風(fēng)險(xiǎn)迅速上升[3]。因此,以心臟衰老作為心血管疾病突破口具有重要意義。D-半乳糖(D-gal)是常用的模擬衰老藥物。研究表明,D-gal可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[4]、自噬[5]、炎癥反應(yīng)[6]。最近有研究發(fā)現(xiàn),緩解鐵死亡可能會(huì)部分逆轉(zhuǎn)D-gal 誘導(dǎo)的聽(tīng)覺(jué)皮層神經(jīng)變性[7],但D-gal誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞衰老是否發(fā)生鐵死亡尚不明確。Ferrostatin-1是一種鐵死亡抑制劑,可抑制心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷而發(fā)揮抗氧化功能[8]。研究表明Ferrostatin-1 可抑制心肌缺血再灌注損傷、心肌肥大、心力衰竭、心肌病等多種心血管疾?。?]。此外,炎癥反應(yīng)可以促進(jìn)心肌衰老[10],而鐵死亡與炎癥反應(yīng)密切相關(guān),受外部微生物影響的細(xì)胞釋放損傷相關(guān)的分子模式,細(xì)胞死亡被放大,并促進(jìn)一系列與炎癥相關(guān)的反應(yīng),使用鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1可以抑制感染性和無(wú)菌性炎癥反應(yīng)[11]。因此,推測(cè)Ferrostatin-1能夠改善心肌衰老。本研究旨在探討抑制鐵死亡是否可延緩D-gal 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞衰老。
1.1 材料 H9C2心肌細(xì)胞(2-1,Procell CL-0089)購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。D-gal、β-半乳糖苷酶(β-GAL)活性檢測(cè)試劑盒、還原型谷胱甘肽(GSH)含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自廣州賽國(guó)生物科技有限公司;Ferrostatin-1購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;兔抗鼠溶質(zhì)載體家族7成員11(SLC7A11)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(GPx4)單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;兔抗鼠P53、GAPDH 多克隆抗體及山羊抗兔二抗購(gòu)自武漢三鷹公司;培養(yǎng)基、血清、1%青霉素和鏈霉素雙抗、PBS均購(gòu)自以色列Biological Industries 公司;活性氧(ROS)測(cè)試盒、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific 公司;倒置顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司;熒光倒置顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司;化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)FluorChem E購(gòu)自美國(guó)ProteinSimple公司;超聲破細(xì)胞粉碎機(jī)購(gòu)自寧波新藝超聲設(shè)備有限公司。
1.2 方法
1.2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 將H9C2心肌細(xì)胞種植培養(yǎng)于96 孔板中,每孔鋪板細(xì)胞為5 000 個(gè)。使用0、5、10、20、40、80、100 g/L的D-gal處理細(xì)胞24 h,誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞損傷,制備心臟衰老模型。棄去培養(yǎng)液,96孔板每孔加入90 μL不含血清的培養(yǎng)基和10 μL MTT 溶液(5 g/L,即0.5%MTT),培養(yǎng)箱孵育4 h后棄去培養(yǎng)基,每孔加入100 μL二甲基亞砜于37 ℃溫箱孵育10 min 后用490 nm 酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度(OD)值,確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用的D-gal質(zhì)量濃度。
1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 H9C2細(xì)胞復(fù)蘇后,在裝有完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素雙抗和89%高糖DMEM)的培養(yǎng)瓶中于37 ℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2心肌細(xì)胞,Control組完全培養(yǎng)基處理24 h,Dgal組用20 g/L D-gal(D-gal溶于完全培養(yǎng)基中)處理24 h;Fer-1組在應(yīng)用20 g/L D-gal的基礎(chǔ)上再用10 μmol/L Ferrostatin-1處理24 h。分組后檢測(cè)各組細(xì)胞活力,方法同1.2.1。
1.2.3 DCFH-DA 法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平 各組H9C2 細(xì)胞以5×104個(gè)/孔種植于六孔板,經(jīng)過(guò)相應(yīng)處理后棄培養(yǎng)基,加入含DCFH-DA探針的無(wú)血清培養(yǎng)基(DCFH-DA為5 μmol/L,稀釋于無(wú)血清培養(yǎng)基)后37 ℃孵育細(xì)胞20 min,吸去培養(yǎng)基,PBS洗滌2次后加入1 mL PBS于熒光倒置顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度。
1.2.4 微板法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GSH含量 收集不少于1×106個(gè)細(xì)胞,首先用PBS 清洗細(xì)胞2 次(PBS 重懸細(xì)胞,600 r/min 離心10 min),加入試劑一重懸細(xì)胞,反復(fù)凍融2~3 次,8 000 r/min離心10 min,收集上清液,按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作后于412 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD 值,根據(jù)標(biāo)曲線(xiàn)計(jì)算出樣本濃度。按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算GSH含量(μg/106cell)=樣本濃度÷細(xì)胞數(shù)量。
1.2.5 硫代巴比妥酸(TBA)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MDA 含量 超聲破碎的細(xì)胞樣本放置測(cè)定管中,與空白管、標(biāo)準(zhǔn)管在95 ℃水浴40 min后取出冷卻,然后3 500~4 000 r/min離心10 min,取200 μL 上清液于96 孔板,532 nm 處測(cè)各管OD 值。MDA 含量=(測(cè)定OD 值-空白OD 值)÷(標(biāo)準(zhǔn)OD 值-空白OD 值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度÷待測(cè)樣本蛋白濃度。
1.2.6 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SLC7A11、GPx4、P53 蛋白表達(dá) 加蛋白酶抑制劑和裂解液以1∶100 的比例裂解細(xì)胞,BCA 檢測(cè)細(xì)胞蛋白水平。以1 g/L 的蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜,5%的BSA 常溫封閉2 h,4 ℃一抗SLC7A11(1∶10 000)、GPx4(1∶10 000)、P53(1∶3 000)、GAPDH(1∶5 000)孵育條帶過(guò)夜。第2 天TBST 洗膜3 次,每次10 min,二抗(1∶3 000)常溫孵育1 h,TBST洗膜3次(10 min/次),ECL顯色。通過(guò)Image J軟件分析各個(gè)條帶吸光度后進(jìn)行相對(duì)定量。
1.2.7 微量法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)β-GAL 活性 收集細(xì)胞后棄上清液,按照每5×106個(gè)細(xì)胞加入1 mL提取液,超聲波破碎細(xì)胞(冰浴,功率200 W,超聲3 s,間隔10 s,重復(fù)30次),15 000 r/min,4 ℃,離心20 min,取上清液后酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值。按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算β-GAL 活力(U/104cell)=(y×V反總)÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.028×y(y:樣本生成的產(chǎn)物量;V反總:反應(yīng)體系總體積;V樣:加入反應(yīng)體系中樣本體積;V樣總:加入提取液體積;T:反應(yīng)時(shí)間)。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間多重比較采用LSD-t法。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 D-gal處理對(duì)H9C2細(xì)胞活力的影響 0、5、10、20、40、80、100 g/L D-gal 處理細(xì)胞活力(%)分別為100.00、82.36±2.44、79.09±1.34、72.92±1.61、56.37±0.89、16.37±0.46、5.19±0.75,細(xì)胞活力隨D-gal質(zhì)量濃度升高而降低(n=3,F(xiàn)=2 215.514,P<0.05)。20 g/L D-gal 可使細(xì)胞活力降低至70%左右,D-gal 質(zhì)量濃度≥40 g/L 時(shí),細(xì)胞活力明顯下降,后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用20 g/L D-gal作用24 h處理細(xì)胞。
2.2 Ferrostatin-1 對(duì)D-gal 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活力影響 Control 組、D-gal 組和Fer-1 組的細(xì)胞活力(%)分別為100.00、74.06±2.17、84.29±1.85,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=4,F(xiàn)=251.415,P<0.05)。與Control 組比較,D-gal 組的細(xì)胞活力降低;與D-gal組相比,F(xiàn)er-1組的細(xì)胞活力增加(P<0.05)。
2.3 D-gal和Ferrostatin-1對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA和GSH 的影響 與Control 組相比,D-gal 組ROS、MDA 含量升高,GSH 含量降低(P<0.05);與D-gal組相比,F(xiàn)er-1 組ROS、MDA 含量降低,GSH 含量升高(P<0.05),見(jiàn)圖1、表1。
Fig.1 The effect of D-gal and Fer-1 on ROS of H9C2 cells(×100)圖1 D-gal和Fer-1對(duì)H9C2細(xì)胞內(nèi)ROS的影響(×100)
Tab.1 Comparison of ROS,GSH and MDA contents between the three groups表1 各組ROS、GSH、MDA含量比較(n=3,±s)
Tab.1 Comparison of ROS,GSH and MDA contents between the three groups表1 各組ROS、GSH、MDA含量比較(n=3,±s)
*P<0.05;**P<0.01;a 與Control 組比較;b 與D-gal 組比較,P<0.05;表2同。
組別Control組D-gal組Fer-1組F ROS 15.24±1.65 39.90±4.83a 26.50±2.66b 41.345**GSH(μg/106 cell)86.01±5.73 63.06±10.98a 82.59±3.28b 8.408*MDA(nmol/mg prot)0.58±0.05 1.46±0.15a 0.94±0.05b 67.163**
2.4 D-gal 和Ferrostatin-1 對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)SLC7A11、P53、GPx4 蛋白水平的影響 相比Control 組,D-gal組SLC7A11、GPx4蛋白表達(dá)水平降低,P53蛋白表達(dá)水平升高;與D-gal 組相比,F(xiàn)er-1 組的SLC7A11、GPx4 蛋白表達(dá)水平升高,P53 蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05),見(jiàn)圖2、表2。
Fig.2 The effects of D-gal and Fer-1 on protein expression levels ofSLC7A11,GPx4 and P53 in H9C2 cells圖2 D-gal和Fer-1對(duì)H9C2細(xì)胞內(nèi)P53、SLC7A11、GPx4蛋白表達(dá)的影響
2.5 D-gal 和Ferrostatin-1 對(duì)心肌細(xì)胞中β-GAL 活性影響 Control組、D-gal組和Fer-1組的β-GAL活性(U/104cell)分別為0.78±0.01、0.98±0.01 和0.90±0.01,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=3,F(xiàn)=460.667,P<0.05)。與Control 組相比,D-gal 組β-GAL 活性增強(qiáng);與D-gal 組相比,F(xiàn)er-1 組中β-GAL 活性減弱(P<0.05)。
Tab.2 Comparison of protein expression levels of P53,SLC7A11 and GPx4 between the three groups表2 各組的P53、SLC7A11、GPx4蛋白表達(dá)水平比較(n=3,±s)
Tab.2 Comparison of protein expression levels of P53,SLC7A11 and GPx4 between the three groups表2 各組的P53、SLC7A11、GPx4蛋白表達(dá)水平比較(n=3,±s)
組別Control組D-gal組Fer-1組F SLC7A11 1.04±0.18 0.48±0.09a 0.79±0.12b 12.706**GPx4 1.03±0.18 0.67±0.12a 0.98±0.07b 6.730*P53 0.69±0.35 1.13±0.05a 0.88±0.04b 92.479**
氧化應(yīng)激損傷被認(rèn)為是心肌衰老過(guò)程中的重要機(jī)制。細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷時(shí),細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS和脂質(zhì)過(guò)氧化物破壞線(xiàn)粒體DNA,損傷的線(xiàn)粒體和線(xiàn)粒體功能障礙加速心肌細(xì)胞衰老[12]。另一方面,心肌細(xì)胞內(nèi)過(guò)度的ROS可以阻斷自噬,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)有缺陷的線(xiàn)粒體和脂褐素累積[13],自噬減少會(huì)加速心肌細(xì)胞衰老過(guò)程,增強(qiáng)的自噬可以減少心肌細(xì)胞衰老并延長(zhǎng)壽命[14]。心肌細(xì)胞衰老是年齡相關(guān)性心血管疾病重要危險(xiǎn)因素[15]。人體衰老過(guò)程中,心肌肥厚、進(jìn)行性心肌纖維化、左心室壁增厚、心臟收縮和舒張異常、心臟重塑等因素導(dǎo)致心功能下降[16]。在心力衰竭、心肌肥厚和動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病中,心肌細(xì)胞衰老呈現(xiàn)增加趨勢(shì)[17-18]。通過(guò)延緩心肌細(xì)胞衰老來(lái)達(dá)到改善心血管疾病的目的具有重要意義。
D-gal是一種常用的誘導(dǎo)心肌細(xì)胞衰老的藥物。D-gal 既能通過(guò)增加心肌細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平和破壞線(xiàn)粒體完整性加速心肌細(xì)胞衰老[19],也能通過(guò)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡途徑和促炎作用導(dǎo)致心肌細(xì)胞發(fā)生損傷。本研究通過(guò)給予不同劑量的D-gal 作用24 h,篩選出20 g/L D-gal 誘導(dǎo)心肌衰老模型,結(jié)果表明,D-gal 作用H9C2 細(xì)胞24 h 后,H9C2 細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷,表現(xiàn)為細(xì)胞活力降低,ROS 和MDA產(chǎn)生增加。β-GAL活性和P53水平可間接反映細(xì)胞衰老狀態(tài),P53 的激活會(huì)導(dǎo)致線(xiàn)粒體損傷[20]。本研究中,D-gal作用H9C2細(xì)胞24 h后,H9C2細(xì)胞內(nèi)β-GAL活性增強(qiáng)和P53蛋白表達(dá)水平增加,提示D-gal誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞衰老模型構(gòu)建成功。
鐵死亡是一種細(xì)胞內(nèi)ROS 誘導(dǎo)的、細(xì)胞膜上磷脂成分發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)從而破壞細(xì)胞膜最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡的一種新型細(xì)胞死亡形式,這一概念首先由Dixon 等[21]提出。鐵死亡在生物化學(xué)上主要表現(xiàn)為脂質(zhì)過(guò)氧化物堆積及抗過(guò)氧化物質(zhì)減少,如ROS 產(chǎn)生增加和GSH、GPx4 減少等[22]。GPx4 以GSH 為底物使脂質(zhì)過(guò)氧化中間體脂質(zhì)氫過(guò)氧化物轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)醇,從而抑制過(guò)氧化物的堆積。研究表明,GSH減少引起的脂質(zhì)過(guò)氧化可以導(dǎo)致鐵死亡,GPx4和GSH在脂質(zhì)過(guò)氧化和鐵死亡中發(fā)揮重要作用[23-24]。SLC7A11是胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體中的輕鏈,主要發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)胱氨酸的作用,進(jìn)入胞內(nèi)的胱氨酸通過(guò)一系列反應(yīng)合成GSH,受SLC7A11 調(diào)控的GPx4 以GSH為底物清除過(guò)氧化物從而影響細(xì)胞鐵死亡的進(jìn)程,研究表明Ferrostatin-1 通過(guò)促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞中SLC7A11 的表達(dá)和增強(qiáng)GPx4 的活性從而抑制鐵死亡的發(fā)生[25]。因此,SLC7A11和GPx4可以作為鐵死亡蛋白標(biāo)志物。本研究中D-gal 的應(yīng)用使心肌細(xì)胞中GSH含量減少,ROS和MDA產(chǎn)生增多,SLC7A11、GPx4表達(dá)降低,表明D-gal可以誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。通過(guò)使用Ferrostatin-1 對(duì)H9C2 細(xì)胞處理進(jìn)一步探索D-gal 誘導(dǎo)的鐵死亡及心肌細(xì)胞衰老機(jī)制。研究結(jié)果顯示,F(xiàn)errostatin-1 可以增強(qiáng)因D-gal而降低的細(xì)胞活力,增加細(xì)胞內(nèi)GSH的含量和SLC7A11、GPx4蛋白水平,減少ROS和MDA的含量。已有研究顯示,D-gal 可以誘導(dǎo)PC12 神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡,而鐵螯合劑DFO 可以抑制D-gal 誘導(dǎo)的鐵死亡和延緩神經(jīng)退行性改變[7],與本研究D-gal誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡結(jié)果相似。
抑制鐵死亡可作為抗衰老治療靶點(diǎn)[26]。既往研究表明,GSH 耗竭和鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin 可阻止視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞早衰[23],通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化或限制鐵潴留來(lái)阻斷鐵死亡,可以減輕與年齡相關(guān)的腸細(xì)胞死亡,延長(zhǎng)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的壽命[27]。鐵死亡已被發(fā)現(xiàn)參與與年齡相關(guān)的心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病[28],而SLC7A11 過(guò)表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)肺成纖維細(xì)胞衰老相關(guān)表型[29]。本研究發(fā)現(xiàn),鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1 可以降低因D-gal 而增強(qiáng)的β-GAL活性和P53蛋白水平,表明Ferrostatin-1可以延緩D-gal誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞衰老。
綜上,本研究表明鐵死亡參與了D-gal 誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞衰老,而Ferrostatin-1 可以抑制鐵死亡從而延緩D-gal 誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞衰老,本研究為心肌衰老機(jī)制及治療提供了另一視角。