李成龍 ,葉洲杰,杜生榮,
(1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福建 福州 350117;2.福建省婦幼保健院 福建醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,福建 福州 350117)
近年來(lái)隨著科學(xué)技術(shù)在臨床應(yīng)用中的進(jìn)步,越來(lái)越多的家庭,尤其是有家族遺傳病的夫妻開(kāi)始選擇體外受精-胚胎移植技術(shù)(in vitro fertilization&embryo transfer,IVF-ET)來(lái)避免后代出現(xiàn)先天缺陷的遺傳病。隨著體外受精-胚胎移植技術(shù)的不斷發(fā)展,對(duì)于胚胎基因的分析及質(zhì)量的評(píng)估已經(jīng)成為胚胎移植前重要的篩選參考。然而目前大部分胚胎移植主要以卵裂球數(shù)目、形態(tài)、胞漿顆粒、碎片數(shù)量等為參考依據(jù),單純的胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分只能從表觀上預(yù)測(cè)胚胎的發(fā)育潛能,無(wú)法檢測(cè)胚胎是否帶有異?;蚧蛉旧w病等。
據(jù)目前國(guó)內(nèi)的數(shù)據(jù),輔助生殖臨床妊娠率為50%~60%之間,抱嬰率只有35%左右,而多數(shù)胚胎由于染色體異常導(dǎo)致早期妊娠丟失及流產(chǎn)。胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(preimplantation genetic diagnosis,PGD)是目前對(duì)體外受精胚胎的染色體結(jié)構(gòu)和基因遺傳病檢測(cè)的常用方法,借助二代測(cè)序技術(shù),從細(xì)胞分子水平檢測(cè)胚胎的核型,篩選出優(yōu)質(zhì)的胚胎進(jìn)行移植,可以有效地提高抱嬰率。囊胚中主要有內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass,ICM)和滋養(yǎng)層細(xì)胞(tropheetoderm cell,TE)。目前,對(duì)處于囊胚期的胚胎進(jìn)行囊胚活檢是最常用的方法,囊胚活檢主要是收集滋養(yǎng)層細(xì)胞,通過(guò)對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞的基因及染色體分析來(lái)檢測(cè)胚胎是否正常,但是囊胚中的滋養(yǎng)層細(xì)胞的分布范圍較大,有的靠近內(nèi)細(xì)胞團(tuán)稱(chēng)為ICM鄰側(cè)細(xì)胞,有的遠(yuǎn)離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)稱(chēng)為ICM對(duì)側(cè)細(xì)胞,不同位置的滋養(yǎng)層細(xì)胞分子核型與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)有無(wú)相關(guān)性?是否會(huì)影響胚胎診斷結(jié)果?本研究通過(guò)對(duì)囊胚不同位置的滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢后進(jìn)行染色體分析,更深入地了解植入前胚胎嵌合的發(fā)生,并更精準(zhǔn)地服務(wù)臨床。
收集不適宜移植、評(píng)分差的囊胚,且夫妻雙方染色體均正常。此項(xiàng)研究患者知情同意并經(jīng)院倫理委員會(huì)同意。
1.2.1 囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)活檢
用激光在透明帶打個(gè)小孔,通過(guò)顯微操作系統(tǒng),從不同位置活檢囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞,活檢后的細(xì)胞裝入PCR管,用于細(xì)胞全基因擴(kuò)增。
1.2.2 細(xì)胞裂解
細(xì)胞裂解緩沖液(Cell Lysis Buffer)5 μL 與細(xì)胞裂解酶(Cell Lysis Enzyme)0.1 μL充分混勻,2.5 μL單細(xì)胞懸液加入其中,預(yù)熱PCR儀,孵育樣本。
孵育條件:50 ℃,50 min;80 ℃,10 min;4 ℃,長(zhǎng)時(shí)間。
1.2.3 MALBAC預(yù)擴(kuò)增
前擴(kuò)增緩沖液(Pre-Amp Buffer)30 μL和前擴(kuò)增酶(Pre-Amp Enzyme Mix)1 μL混合均勻,7.5 μL gDNA加入其中,短暫離心,充分混勻。
PCR 反應(yīng)條件:94 ℃,3 min,1個(gè)循環(huán);20 ℃、40 s,30 ℃、40 s,40 ℃、30 s,50 ℃、30 s,60℃、30 s,70℃、4 min,95℃、20 s,58 ℃、10 s,8個(gè)循環(huán);4 ℃、長(zhǎng)時(shí)間。
1.2.4 MALBAC擴(kuò)增
擴(kuò)增緩沖液(Amplification Buffer)30 μL和擴(kuò)增酶(Amp Enzyme Mix)0.8 μL混勻,向37.5μL DNA中加入30 μL MALBAC擴(kuò)增混合液,離心混勻。
PCR 反應(yīng)條件:94 ℃、30 s,1個(gè)循環(huán);94 ℃、20 s,58 ℃、30 s,72 ℃、3 min,20個(gè)循環(huán);4 ℃,長(zhǎng)時(shí)間。
采用Genomic DNA Clean&Concentrator試劑盒純化WGA產(chǎn)物,純化產(chǎn)物-20 ℃保存待用。
1.2.5 段化-連接反應(yīng)
x μL WGA產(chǎn)物(50 ng),5X Buffer H 2 μL,Buffer EB( 7.6 μL-x μL),F(xiàn)L-2酶0.4 μL,反應(yīng)體系共10 μL,孵育條件:55 ℃,10 min,孵育完畢后加入150 μL Buffer PB終止反應(yīng),并加入20 μL Buffer EB至180 μL。
1.2.6 文庫(kù)擴(kuò)增
擴(kuò)增反應(yīng)體系:片段化-連接產(chǎn)物33.8 μL,5X KAPA2G Robust Buffer A 10 μL,2.5 mM dNTPs 4 μL,Index Primer Mix 2 μL,KAPA2G Robust DNA Polymerase 0.2 μL;擴(kuò)增反應(yīng)條件:72 ℃ 3 min,1個(gè)循環(huán);95 ℃ 2 min,1個(gè)循環(huán);95 ℃ 30 s,62 ℃30 s,72 ℃ 3 min,14個(gè)循環(huán);4 ℃,長(zhǎng)時(shí)間。Qingen純化試劑盒純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
1.2.7 測(cè)序數(shù)據(jù)分析
將細(xì)胞中提取后擴(kuò)增的全基因送億康基因測(cè)序分析。
1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用spss25.0軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以例和百分?jǐn)?shù)表示(%)。
體外受精的胚胎經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)后進(jìn)入囊胚期,主要分為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞(圖1 A),用激光在透明帶區(qū)打個(gè)小洞,顯微操作儀在囊胚中不同部位分別吸取細(xì)胞,然后進(jìn)行核型分析。根據(jù)分析結(jié)果(圖1 B,C)可知,滋養(yǎng)層細(xì)胞TE1和TE2與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)ICM測(cè)序結(jié)果一致,為46,XN。
圖1 人廢棄囊胚不同部位滋養(yǎng)層細(xì)胞(鄰ICM)測(cè)序結(jié)果
圖2人廢棄囊胚不同部位滋養(yǎng)層細(xì)胞(鄰ICM及對(duì)側(cè))測(cè)序結(jié)果
使用顯微操作儀對(duì)第二個(gè)囊胚上的不同部位吸取細(xì)胞(圖2 A),分析結(jié)果表明,TE2細(xì)胞的核型為46,XN -21(mos~30%),而TE1、TE3以及ICM的核型結(jié)果一致為46,XN。
使用同樣的方法對(duì)第三個(gè)胚胎不同部位(圖3 A)進(jìn)行檢測(cè)分析,分析結(jié)果(圖3 B)表明TE1的核型為46,XN,+16p(mos~40%),其余細(xì)胞的核型與ICM一致為46,XN。
圖3 人廢棄囊胚多個(gè)位點(diǎn)滋養(yǎng)層細(xì)胞(鄰ICM及對(duì)側(cè)多處)測(cè)序結(jié)果
對(duì)所有囊胚活檢細(xì)胞與對(duì)應(yīng)ICM細(xì)胞的檢測(cè)匯總發(fā)現(xiàn),不同位置的滋養(yǎng)層細(xì)胞與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的分子核型存在差異,ICM對(duì)側(cè)滋養(yǎng)層細(xì)胞20個(gè)中,有18個(gè)細(xì)胞分子核型與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)ICM一致,一致率為90%,而鄰側(cè)滋養(yǎng)層細(xì)胞28個(gè)中,有24個(gè)細(xì)胞與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)ICM一致,為86%。可見(jiàn),滋養(yǎng)層細(xì)胞的分子核型不完全與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)一致。
表1 囊胚活檢細(xì)胞基因型與ICM比較
受精卵發(fā)育成囊胚過(guò)程中,受精卵內(nèi)的細(xì)胞由于分布位置不同,分化成兩種細(xì)胞,一類(lèi)是內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Inner cell mass,ICM),未來(lái)發(fā)育成完整的個(gè)體;另一類(lèi)是滋養(yǎng)層細(xì)胞(Tropheetoderm cell,TE),發(fā)育成胎盤(pán)。而胚胎植入前遺傳學(xué)診斷技術(shù)的應(yīng)用,是通過(guò)活檢滋養(yǎng)層細(xì)胞代替內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞來(lái)檢測(cè)胚胎染色體是否正常,從而減少對(duì)胎兒個(gè)體發(fā)育的干預(yù)。但是由于滋養(yǎng)層細(xì)胞存在染色體嵌合現(xiàn)象,判讀滋養(yǎng)層細(xì)胞異常核型或正常的核型與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞實(shí)際的分子核型不相符,誤診率大約4.3%[1]。
如何降低誤診率的發(fā)生也是目前國(guó)際難解決的問(wèn)題,本研究檢測(cè)囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞不同位置的分子核型,以期提高胚胎的準(zhǔn)確診斷率?;顧z遠(yuǎn)離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或者靠近內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)不同位置的分子核型有的與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞不相符,有的相符,因此活檢滋養(yǎng)層細(xì)胞的位置不能間接提高內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分子核型的診斷準(zhǔn)確性。Colls P等人研究卵裂期胚胎嵌合比率,至少兩個(gè)卵裂球是異常的,染色體的嵌合比率為30%[2]。而Capalbo A等人用FISH技術(shù)重新分析內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞的分子核型,嵌合比率低于卵裂期[3]。因此可以通過(guò)卵裂期繼續(xù)培養(yǎng)囊胚來(lái)降低嵌合比率的發(fā)生,提高診斷的準(zhǔn)確率。但是通過(guò)活檢不同位置的滋養(yǎng)層細(xì)胞,并不能提高囊胚診斷準(zhǔn)確率,滋養(yǎng)層細(xì)胞分子核型是隨機(jī)分布的,靠近內(nèi)細(xì)胞團(tuán)兩側(cè)細(xì)胞同樣有不同的分子核型。趙亮等人研究了人植入前囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞的空間表達(dá),極滋養(yǎng)層細(xì)胞中306個(gè)基因上調(diào)而壁滋養(yǎng)層細(xì)胞只有75個(gè)基因上調(diào),兩者基因表達(dá)存在差異性[4]。Munne S等人用FISH方法研究嵌合胚胎的發(fā)生機(jī)制,發(fā)現(xiàn)5%的非整倍體嵌合是由于有絲分裂后期延遲[5]。這意味著囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞就會(huì)出現(xiàn)正常的、單體型的、三體型的分子核型。根據(jù)Garrisi J等的分割實(shí)驗(yàn),嵌合體囊胚可以分割成不同的細(xì)胞系,即單體細(xì)胞系和三體細(xì)胞系[6]。由于滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢是隨機(jī)的,不同位置的滋養(yǎng)層細(xì)胞分子核型與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的分子核型沒(méi)有一致性,檢測(cè)結(jié)果不能反映胚胎的分子核型,但這樣的胚胎在臨床上仍有應(yīng)用價(jià)值。Bolton H等人以染色體嵌合老鼠為模型,發(fā)現(xiàn)非整倍體細(xì)胞通過(guò)凋亡模式消失,發(fā)育胎盤(pán)的細(xì)胞系有嚴(yán)重的增殖缺陷現(xiàn)象,但只要有充足的整倍體細(xì)胞,嵌合的胚胎仍然具有發(fā)育潛能[7],2015年Greco E等人嘗試把無(wú)整倍體胚胎的18名患者,移植了嵌合比率為35%~50%的胚胎,結(jié)果誕生了6名染色體正常的嬰兒[8],所以本研究認(rèn)為滋養(yǎng)層細(xì)胞的分子核型并不能完全反應(yīng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的分子核型,滋養(yǎng)層沒(méi)有出現(xiàn)位置效應(yīng),在臨床實(shí)踐中,如有嵌合型的胚胎,嵌合比率低,仍然建議移植,增加胚胎的利用率。很多醫(yī)院還會(huì)增加一項(xiàng)產(chǎn)前診斷的檢查,通過(guò)對(duì)羊水中胎兒脫落細(xì)胞的收集分析來(lái)進(jìn)一步確定胎兒的發(fā)育情況以及基因是否正常。
目前胚胎植入前遺傳學(xué)診斷篩查技術(shù)的應(yīng)用,可以提高胚胎的種植率、妊娠率,但是對(duì)于假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)還缺乏有效解決方法,本研究活檢不同位置的滋養(yǎng)層細(xì)胞,分子核型結(jié)果與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)比較未見(jiàn)相關(guān)性,因此無(wú)法通過(guò)篩選滋養(yǎng)層細(xì)胞的活檢位置,來(lái)提高胚胎分子核型診斷的準(zhǔn)確性,仍然需要多中心、多個(gè)測(cè)序平臺(tái)來(lái)提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性,更好地服務(wù)不孕不育夫婦。