劉媛，魯芙愛，王樂，楊有國(guó)，李小芬，肖運(yùn)平

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種以關(guān)節(jié)侵蝕破壞為主要特征的系統(tǒng)性自身免疫病，間質(zhì)性肺疾?。↖LD）是RA最常見的系統(tǒng)受累表現(xiàn)，也是導(dǎo)致RA患者死亡的主要原因［1］。普通型間質(zhì)性肺炎（UIP）是RAILD 常見的病理類型之一，以肺組織結(jié)構(gòu)明顯破壞和廣泛纖維化為特征，與特發(fā)性肺纖維化的表現(xiàn)和預(yù)后相似，是RA-ILD預(yù)后較差的病理類型［2］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是長(zhǎng)度大于200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，參與細(xì)胞分化、免疫調(diào)控、組織纖維化等重要的生物學(xué)功能，從多層面調(diào)控基因的表達(dá)，參與疾病發(fā)生發(fā)展，為近年來的研究熱點(diǎn)。lncRNA的表達(dá)或功能障礙與遺傳性疾病、自身免疫性疾病及腫瘤密切相關(guān)［3-4］。lncRNA 在多種纖維化組織中存在特異性的表達(dá)譜，被認(rèn)為是纖維化的功能調(diào)節(jié)器，某些差異表達(dá)的lncRNA 在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控功能［5］。然而，lncRNA 在RA-UIP發(fā)病中的具體作用及機(jī)制尚不清楚。本研究通過基因芯片篩選RA-UIP 患者全血中表達(dá)上調(diào)的lncRNA，并采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測(cè)驗(yàn)證，同時(shí)從細(xì)胞水平驗(yàn)證目標(biāo)lncRNA與肺纖維化的關(guān)系，在肺纖維化進(jìn)程中的作用及調(diào)控的靶基因，探討其在RA-UIP發(fā)病中的作用。

1 對(duì)象及方法

1.1 研究對(duì)象及分組 選取2019年1—12月就診于包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院的RA 患者8 例，按是否合并UIP 分為RA肺纖維化組（4例），平均（59．25±1．26）歲；RA對(duì)照組（4例），平均（59．75±0．96）歲，2組年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0．298，P＞0．05），男女比例均為1∶3。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）RA 診斷滿足2010年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟提出的RA 分類標(biāo)準(zhǔn)。（2）合并UIP 的患者滿足2011 美國(guó)胸科學(xué)會(huì)和歐洲呼吸學(xué)會(huì)提出的UIP 分級(jí)診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有慢性疾病史。（2）合并其他結(jié)締組織病。（3）非初次治療的RA。（4）合并除肺臟外的其他重要臟器系統(tǒng)損害。（5）行肺組織活檢。本研究通過包頭醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審批并獲得研究對(duì)象知情同意。

1.2 材料 RNA 提取試劑盒購自德國(guó)Qiagen 公司；體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國(guó)Ambion 公司；基因片段和標(biāo)記試劑盒購自美國(guó)Affymetrix 公司；SYBR Green 熒光定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TAKARA 公司；人腎上皮細(xì)胞系（293T）購自美國(guó)ATCC；人胚肺成纖維細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、細(xì)胞凍存液及胰酶-乙二胺四乙酸（EDTA）購自美國(guó)Gibico；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑購自美國(guó)Invitrogen 公司；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1 重組蛋白購自美國(guó)Selleck 公司；CCK-8 試劑盒購自廣州賽國(guó)生物科技有限公司；小鼠抗人α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）一抗及羊抗鼠二抗購自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；Affymetrix Clariom D 基因芯片檢測(cè)和引物設(shè)計(jì)委托南寧友田生物科技有限公司；lnc-NONHSAT074080短發(fā)卡RNA（shRNA）慢病毒載體構(gòu)建由南京臨度醫(yī)療科技有限公司構(gòu)建；Ⅰ型膠原和纖連蛋白酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒購自廈門侖昌碩生物科技有限公司。Affymetrix雜交爐、GeneChip Scanner 3000激光掃描儀和Affymetrix Fluidics Station 450 洗脫站均購自美國(guó)Affymetrix公司；qPCR儀7500購自美國(guó)ABI公司；二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國(guó)Thermo公司；低溫冷凍離心機(jī)購自德國(guó)HERMLE公司；酶標(biāo)儀購自美國(guó)Molecular Devices 公司；流式細(xì)胞儀購自美國(guó)BD公司。

1.3 方法

1.3.1 Affymetrix Clariom D 基因芯片檢測(cè)差異基因及生物信息學(xué)分析 在確診后未開始治療前，收集研究對(duì)象的全血樣本3 mL。提取全血總RNA 并質(zhì)檢（保證RNA 的起始質(zhì)量濃度達(dá)到17 mg/L，且RNA無明顯降解和樣本污染）。取質(zhì)檢合格的250 ng 總RNA 用配套的體外轉(zhuǎn)錄試劑盒制備生物素標(biāo)記的cDNA 樣品，將5．5 μg cDNA 樣品于雜交爐中45 ℃條件下滾動(dòng)雜交16 h，Affymetrix Fluidics Station 450 將芯片進(jìn)行洗脫、染色后采用GeneChip Scanner 3000 掃描儀進(jìn)行掃描，然后由Affymetrix GeneChip Command Console（AGCC）讀取其數(shù)據(jù)，采用Gene Spring軟件（安捷倫科技有限公司）進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.3.2 qPCR檢測(cè)上調(diào)lncRNA的表達(dá) 選取2組基因芯片比較分析中基因表達(dá)差異倍數(shù)＞2的10個(gè)lncRNA，設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列見表1。采用Trizol-RNA 提取試劑盒提取患者全血中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板采用SYBR Green 相對(duì)定量法進(jìn)行qPCR 驗(yàn)證，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃10 s，55 ℃15 s，72 ℃15 s，共40 個(gè)循環(huán)。選擇qPCR 驗(yàn)證后，RA 肺纖維化組lncRNA 的表達(dá)高于RA 對(duì)照組，且在生物信息學(xué)分析中發(fā)現(xiàn)的與肺纖維化進(jìn)程相關(guān)的lncRNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 熒光素酶標(biāo)記實(shí)驗(yàn) 將lnc-NONHSAT074080結(jié)合序列克隆到表達(dá)載體pcDNA3．1 上，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒；靶基因ARL6IP4 的mRNA 3'-UTR 的片段插入到報(bào)告載體psiCHECK2，構(gòu)建報(bào)告質(zhì)粒。將空載體、lnc-NONHSAT074080表達(dá)質(zhì)粒和ARL6IP4報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人腎上皮細(xì)胞系細(xì)胞，分為空載體對(duì)照組、pCDNA3．1+ARL6IP4-psiCHECK2 負(fù)對(duì)照組，pCDNA3．1-NONHSAT074080+psiCHECK2 組及pCDNA3．1-NONHSAT074080+ARL6IP4-psiCHECK2組。各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液，按照熒光素酶檢測(cè)試劑盒的操作說明分別加入各檢測(cè)試劑，使用酶標(biāo)儀讀取各組細(xì)胞海腎和螢火蟲熒光強(qiáng)度，以海腎熒光值作為內(nèi)參，計(jì)算各組細(xì)胞熒光素酶活性的比值。

Tab.1 Primer sequence of lncRNA表1 長(zhǎng)鏈非編碼RNA的引物序列

1.3.4 人胚肺成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及處理 人胚肺成纖維細(xì)胞系復(fù)蘇培養(yǎng)后以3×106個(gè)/mL的密度接種于培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后換液，除去未貼壁的細(xì)胞及細(xì)胞碎片，每2～3 d換液1次。待細(xì)胞匯合成片后，傳代及鑒定。

1.3.5 lnc-NONHSAT074080 shRNA 質(zhì)粒載體的構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 針對(duì)NONHSAT074080 基因的cDNA 序列設(shè)計(jì)shRNA，并構(gòu)建NONHSAT074080 shRNA慢病毒載體，轉(zhuǎn)染人胚肺成纖維細(xì)胞，熒光顯微鏡鑒定轉(zhuǎn)染效率，qPCR 檢測(cè)NONHSAT074080 的基因表達(dá)。lnc-NONHSAT074080 shRNA 轉(zhuǎn)染效率和沉默效果驗(yàn)證后，將人胚肺成纖維細(xì)胞分為空白對(duì)照組（未處理）、TGF-β1 組（細(xì)胞饑餓24 h，給予5 μg/L TGF-β1）、TGF-β1+NONHSAT074080 shRNA組（5 μg/L TGF-β1處理后給予lnc-NONHSAT074080 shRNA轉(zhuǎn)染48 h），收集細(xì)胞及上清液。

1.3.6 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 將人胚肺成纖維細(xì)胞以3×103個(gè)/孔的密度接種在96 孔板中，每孔100 μL，每組3個(gè)復(fù)孔，置于常規(guī)培養(yǎng)箱孵育，細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，根據(jù)1.3.5分組進(jìn)行干預(yù)，在干預(yù)0、24、48、72及96 h后，每孔加入10 μL CCK-8 試劑后繼續(xù)孵育細(xì)胞2 h，在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其光密度值，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖水平。

1.3.7 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)α-SMA的表達(dá) 將人胚肺成纖維細(xì)胞以1×104個(gè)/孔密度轉(zhuǎn)移至6 孔板制成細(xì)胞爬片，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到約50%時(shí)，除去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液清洗后加入1 mL 預(yù)冷的95%乙醇置于-20 ℃固定；吸除乙醇，每孔加入1 mL 5%胎牛血清蛋室溫封閉20 min；加α-SMA一抗室溫孵育60 min；PBS 清洗后加入含標(biāo)記的羊抗小鼠二抗，5%BSA-PBS室溫避光孵育2 h；PBS清洗3次；避光環(huán)境下加入適量6-聯(lián)脒-2'-苯基吲哚（DAPI）染色1 min；甘油封片，共聚焦熒光顯微鏡下觀察α-SMA的表達(dá)。

1.3.8 qPCR 檢測(cè)lnc-NONHSAT074080 及ARL6IP4 的mRNA表達(dá) 根據(jù)1.3.5分組對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，收集細(xì)胞，Trizol-RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞的總RNA，參照1.3.2 中的qPCR 檢測(cè)方法檢測(cè)lnc-NONHSAT074080 及ARL6IP4 的mRNA 表達(dá)水平。lnc-NONHSAT074080 及ARL6IP4的引物序列見表1。

1.3.9 ELISA 測(cè)定Ⅰ型膠原及纖連蛋白的表達(dá) 將各組人胚肺成纖維細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種于6 孔板中，細(xì)胞貼壁后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，1 000 r/min 離心10 min，取各組細(xì)胞上清液。在Ⅰ型膠原及纖連蛋白抗體預(yù)包被的酶標(biāo)板反應(yīng)孔中依次加入標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品和樣品（50 μL/孔），室溫孵育2 h；加100 μL 酶結(jié)合物工作液，室溫避光孵育20 min；加入50 μL 終止液終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在450 nm 測(cè)定光密度值，計(jì)算Ⅰ型膠原及纖連蛋白的蛋白表達(dá)水平。每組重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17．0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組間的比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較時(shí)若方差齊采用LSD-t法，方差不齊采用Tamhane法；不同時(shí)間點(diǎn)的多組比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RA-UIP 疾病相關(guān)lncRNA 的篩選和生物信息學(xué)分析 基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與RA對(duì)照組相比，RA肺纖維化組患者存在192 個(gè)上調(diào)表達(dá)的lncRNA（差異倍數(shù)＞1．1，P＜0．05），見圖1。

Fig．1 Upregulated lncRNA in whole blood in the two groups圖1 2組患者全血中表達(dá)上調(diào)的lncRNA

2.2 qPCR 驗(yàn)證差異lncRNA 與RA 對(duì)照組相比，RA 肺纖維化組lncRNA NONHSAT074080、NONHSAT071210、NONHSAT047350、NONHSAT101272、DPYD-IT1 及NONHSAT082317 的mRNA 表達(dá)明顯升高（P＜0．05），而RP11-158I9．5．1-2：1、RP11-326I11．5、TMEM140-1：1及NONHSAT115197在2組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

2.3 lnc-NONHSAT074080 的生物信息學(xué)分析 對(duì)上述結(jié)果中qPCR驗(yàn)證的6個(gè)在RA肺纖維化組高表達(dá)的lncRNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與纖維化生物學(xué)功能相關(guān)的為lnc-NONHSAT074080，見圖2；lnc-NONHSAT074080 可能作用的靶基因包括ARL6IP4，且為上調(diào)靶基因，見圖3；lnc-NONHSAT074080 可能通過分裂原激活蛋白激酶（MAPK）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和激活因子（STAT）等信號(hào)通路發(fā)揮作用，見圖4。

Fig．2 Bioinformatics analysis showing biological function of lnc-NONHSAT074080圖2 生物信息學(xué)分析lnc-NONHSAT074080的生物學(xué)功能

2.4 lnc-NONHSAT074080 對(duì)靶基因ARL6IP4 的調(diào)控作用 熒光素酶基因報(bào)告顯示，空載體對(duì)照組、pCDNA3．1+ARL6IP4-psiCHECK2 負(fù)對(duì)照組、pCDNA 3．1-NONHSAT074080+psiCHECK2 組 和 pCDNA 3．1-NONHSAT074080+ARL6IP4-psiCHECK2 組ARL6IP4 的熒光表達(dá)量分別為1．491±0．066、0．931±0．027、1．493±0．009 和1．149±0．039，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=172．570，P＜0．05）。與空載體對(duì)照組相比，pCDNA3．1+ARL6IP4-psiCHECK2 負(fù)對(duì)照組ARL6IP4 的熒光表達(dá)量明顯降低（P＜0．05）；pCDNA3．1-NONHSAT074080+psiCHECK2組ARL6IP4 的熒光表達(dá)量較pCDNA3．1+ARL6IP4-psiCHECK2負(fù)對(duì)照組升高（P＜0．05）。

Tab.2 Comparison of upregelated lncRNA expressions in whole blood between the two groups of patients表2 2組患者全血中上調(diào)表達(dá)的lncRNA表達(dá)水平比較（n=4，±s）

Tab.2 Comparison of upregelated lncRNA expressions in whole blood between the two groups of patients表2 2組患者全血中上調(diào)表達(dá)的lncRNA表達(dá)水平比較（n=4，±s）

＊P＜0．05，＊＊P＜0．01。

組別RA對(duì)照組RA肺纖維化組t NONHSAT074080 1．000±0．002 6．108±2．180 2．343＊NONHSAT071210 1．000±0．317 2．447±0．212 6．097＊＊RP11-158I9．5．1-2:1 1．000±0．054 0．637±0．162 2．239 NONHSAT047350 1．000±0．253 3．868±0．728 3．911＊＊NONHSAT101272 1．000±0．002 2．885±0．517 3．646＊＊組別RA對(duì)照組RA肺纖維化組t RP11-326I11．5 1．000±0．003 3．396±1．487 1．611 DPYD-IT1 1．000±0．006 2．418±0．447 3．172＊TMEM140-1：1 1．000±0．065 3．453±1．300 1．886 NONHSAT115197 1．000±0．012 1．341±0．207 1．649 NONHSAT082317 1．000±0．004 2．099±0．237 4．643＊＊

2.5 lnc-NONHSAT074080 對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖的影響 與空白對(duì)照組相比，TGF-β1組細(xì)胞增殖水平在干預(yù)24、48、72 和96 h 后升高（P＜0．05）；與TGF-β1 組相比，TGF-β1+NONHSAT074080 shRNA組細(xì)胞增殖能力在干預(yù)48、72 及96 h 后明顯下降（P＜0．05），見表3。

2.6 lnc-NONHSAT074080 對(duì)α-SMA 表達(dá)的影響 免疫熒光結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，TGFβ1 組α-SMA 的熒光表達(dá)升高；但TGF-β1+NONHSAT074080 shRNA 組與TGF-β1 組相比，α-SMA的熒光表達(dá)明顯減少，見圖5。

2.7 lnc-NONHSAT074080 及ARL6IP4 與纖維化的關(guān)系 與空白對(duì)照組相比，TGF-β1組的人胚肺成纖維細(xì)胞中l(wèi)nc-NONHSAT074080 及ARL6IP4 mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0．05）；TGF- β1+NONHSAT074080 shRNA 組lnc-NONHSAT074080和ARL6IP4 mRNA 表達(dá)水平較TGF-β1 組明顯降低（P＜0．05），見表4。

2.8 lnc-NONHSAT074080 對(duì)纖維化進(jìn)程相關(guān)因子表達(dá)的影響 ELISA結(jié)果顯示，TGF-β1組Ⅰ型膠原

Fig．3 bioinformatics analysis showing possible target gene of lnc-NONHSAT074080圖3 生物信息學(xué)分析lnc-NONHSAT074080可能調(diào)控的靶基因

Fig．4 Boinformatics analysis showing signal pathways of lnc-NONHSAT074080圖4 生物信息學(xué)分析lnc-NONHSAT074080作用相關(guān)的信號(hào)通路

Tab.3 The proliferation of different interventions in human embryonic lung fibroblasts at different time points表3 不同處理組人胚肺成纖維細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)的增殖水平（n=3，±s）

Tab.3 The proliferation of different interventions in human embryonic lung fibroblasts at different time points表3 不同處理組人胚肺成纖維細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)的增殖水平（n=3，±s）

＊P＜0．05，＊＊P＜0．01；a與空白對(duì)照組比較，b與TGF-β1組比較，P＜0．05；F時(shí)間=915．877＊，F(xiàn)組間=60．625＊，F(xiàn)交互=27．388＊。

組別空白對(duì)照組TGF-β1組TGF-β1+NONHSAT074080 shRNA組F 0 h 0．063±0．009 0．061±0．006 0．059±0．005 0．524 24 h 0．496±0．034 0．689±0．010a 0．804±0．018 51．234＊＊48 h 0．844±0．040 0．975±0．012a 0．739±0．113b 63．895＊＊72 h 1．088±0．019 1．336±0．016a 1．065±0．025b 39．174＊＊96 h 1．183±0．091 1．528±0．055a 1．098±0．025b 28．110＊＊

Fig．5 The expression of α-SMA in human embryonic lung fibroblasts treated with different interventions(×400,rhodamine dying）圖5 不同處理組人胚肺成纖維細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)（×400，四乙基羅丹明染色）

和纖連蛋白的表達(dá)高于空白對(duì)照組（P＜0．05）；與TGF-β1 組比較，TGF-β1+NONHSAT074080 shRNA組Ⅰ型膠原和纖連蛋白明顯降低（P＜0．05），見表5。

Tab.4 Comparison of lnc-NONHSAT074080 and ARL6IP4 gene expression between the three groups表4 各組lnc-NONHSAT074080及ARL6IP4基因表達(dá)水平（n=3，±s）

Tab.4 Comparison of lnc-NONHSAT074080 and ARL6IP4 gene expression between the three groups表4 各組lnc-NONHSAT074080及ARL6IP4基因表達(dá)水平（n=3，±s）

＊P＜0．05，＊＊P＜0．01；a與空白對(duì)照組比較，b與TGF-β1 組比較，P＜0．05。

組別空白對(duì)照組TGF-β1組TGF-β1+NONHSAT074080 shRNA組F lnc-NONHSAT074080 1．000±0．072 3．617±0．150a 1．676±0．177ab ARL6IP4 1．000±0．039 1．862±0．080a 1．072±0．131b 72．644＊＊32．106＊

Tab.5 Comparison of the expression levels of type I collagen and fibronectin between the three groups表5 各組I型膠原和纖連蛋白表達(dá)水平比較（n=3，μg/L，±s）

Tab.5 Comparison of the expression levels of type I collagen and fibronectin between the three groups表5 各組I型膠原和纖連蛋白表達(dá)水平比較（n=3，μg/L，±s）

＊＊P＜0．01；a與空白對(duì)照組比較，b與TGF-β1組比較，P＜0．05。

組別空白對(duì)照組TGF-β1組TGF-β1+NONHSAT074080 shRNA組F I型膠原2．490±0．098 7．008±0．344a 3．160±0．081ab 132．528＊＊纖連蛋白22．906±1．688 40．517±1．978a 23．058±1．505b 34．056＊＊

3 討論

肺纖維化是RA-UIP 的主要特征，剖析纖維化發(fā)生發(fā)展相關(guān)的致病因素是深入研究RA-UIP 發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵。近年來，隨著非編碼RNA在肺纖維化發(fā)病中的研究不斷深入，lncRNA在纖維化進(jìn)程中的作用也開始受到關(guān)注［6］。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA ZFAS1在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠肺組織及TGF-β1誘導(dǎo)的人胚肺成纖維細(xì)胞中高表達(dá)，且通過調(diào)控miR-150-5p/SLC38A1 軸發(fā)揮作用［7］。lncRNA AK088388和AK081523在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠體內(nèi)高表達(dá)，并作用于miR-29b-3p 和let-7i-5p，調(diào)控N4bp2 和plxna4 基因的表達(dá)參與肺纖維化的發(fā)?。?］；lncRNA CHRF 作用于miR-489 促進(jìn)二氧化硅誘導(dǎo)的肺纖維化，miR-489 在肺纖維化小鼠巨噬細(xì)胞和TGF-β1 處理的成纖維細(xì)胞中的表達(dá)減低，通過調(diào)控靶基因MyD88 及Smad3 參與肺纖維化的發(fā)病［9］；lncRNA uc．77 及l(fā)ncRNA 2700086A05Rik調(diào)節(jié)肺泡上皮的間質(zhì)轉(zhuǎn)化，在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［10］。本研究收集RA-UIP 和RA 無ILD 的患者全血，以Affymetrix 基因芯片技術(shù)篩選差異表達(dá)的lncRNA，發(fā)現(xiàn)RA-UIP 患者全血中存在192 個(gè)上調(diào)表達(dá)的lncRNA，選擇上調(diào)表達(dá)較明顯的lncRNAs 進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)與RA 無ILD 的患者相比，lnc-NONHSAT074080 在RA 肺纖維化組患者全血中的表達(dá)明顯升高，且生物信息學(xué)關(guān)于功能分析提示qPCR 驗(yàn)證的6 個(gè)高表達(dá)的lncRNAs 中，lnc-NONHSAT074080與纖維化進(jìn)程相關(guān)。同時(shí)，體外實(shí)驗(yàn)采用TGF-β1 誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞的纖維化進(jìn)程，發(fā)現(xiàn)人胚肺成纖維細(xì)胞經(jīng)TGF-β1 誘導(dǎo)后，lnc-NONHSAT074080表達(dá)較空白對(duì)照組明顯升高，人胚肺成纖維細(xì)胞的增殖水平、肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA水平及纖維化進(jìn)程相關(guān)的Ⅰ型膠原和纖連蛋白的表達(dá)水平也明顯升高。為進(jìn)一步證實(shí)lnc-NONHSAT074080在纖維化進(jìn)程中的作用，筆者構(gòu)建lnc-NONHSAT074080 shRNA 慢病毒載體轉(zhuǎn)染人胚肺成纖維細(xì)胞，體外沉默lnc-NONHSAT074080 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與TGF-β1誘導(dǎo)后相比，人胚肺成纖維細(xì)胞的增殖水平明顯下降，肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA表達(dá)降低，纖維化進(jìn)程相關(guān)的Ⅰ型膠原和纖連蛋白的表達(dá)也明顯下降，進(jìn)一步證實(shí)了lnc-NONHSAT074080與纖維化進(jìn)程的關(guān)系。

ARL6IP4 是Ras 家族的成員，可調(diào)控細(xì)胞凋亡［11］。目前關(guān)于ARL6IP4 功能的研究較少，尤其是ARL6IP4在纖維化進(jìn)程中的作用尚不清楚。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)ARL6IP4 可能是lnc-NONHSAT074080 調(diào)控的靶基因之一。進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)lnc-NONHSAT074080 表達(dá)載體上調(diào)ARL6IP4基因的熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)水平，沉默lnc-NONHSAT074080 后人胚肺成纖維細(xì)胞中ARL6IP4 mRNA表達(dá)水平下調(diào)，且TGF-β1誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞中ARL6IP4 的mRNA 表達(dá)升高，提示lnc-NONHSAT074080 調(diào)控靶基因ARL6IP4 的表達(dá)，參與肺成纖維細(xì)胞的纖維化進(jìn)程。

MAPK 信號(hào)通路和PPAR 信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)的主要信息傳導(dǎo)系統(tǒng)，在肺纖維化發(fā)病中發(fā)揮重要作用［12-13］。在肺炎癥/纖維化進(jìn)程中，氧化磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與了肺成纖維細(xì)胞的纖維化進(jìn)程，與間質(zhì)性肺疾病發(fā)病相關(guān)［14］。MAPK 下游的轉(zhuǎn)錄因子被激活，如核因子κB（NF-κB）、激活蛋白-1（AP-1）及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（STAT）等，這些活化的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控一系列纖維化相關(guān)基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致纖維化的產(chǎn)生［15-16］。筆者利用生物信息學(xué)對(duì)RAUIP 患者上調(diào)的差異lncRNA 基因進(jìn)行功能和信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)這些表達(dá)上調(diào)lncRNA 可能與PPAR信號(hào)通路和氧化磷酸化有關(guān)，同時(shí)，對(duì)lnc-NONHSAT074080 的生物信息學(xué)分析也同樣發(fā)現(xiàn)與MAPK信號(hào)通路和下游的STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制有待深入研究。

本研究發(fā)現(xiàn)RA-UIP 患者全血中l(wèi)nc-NONHSTAT074080 高表達(dá)，且 lnc-NONHSTAT074080 調(diào)節(jié)肺成纖維細(xì)胞的增殖及纖維化相關(guān)因子的表達(dá)；ARL6IP4 是 lnc-NONHSTAT074080 作用的靶基因，lnc-NONHSTAT074080 與纖維化相關(guān)信號(hào)通路MAPK、STAT 可能存在一定的關(guān)系。本研究對(duì)lnc-NONHSTAT074080在RA-UIP 發(fā)病中的作用進(jìn)行初步分析，為更全面闡釋其發(fā)病機(jī)制并尋找有效的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。