李文艷，陳瀅瀅，董子怡，劉婕，肖鋒，張宇航

(1.河北大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北省炎性自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制及防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000)

單增李斯特菌(Lisetriamonocytogenes, LM)是一種食源性人獸共患病原菌，在自然界廣泛存在，妊娠動(dòng)物和孕婦嚴(yán)重感染后可引發(fā)流產(chǎn)，嚴(yán)重影響畜牧養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展和人類(lèi)生殖健康[1-2]，但其作用機(jī)制尚不清楚.研究顯示，LM誘導(dǎo)的小鼠流產(chǎn)與母胎界面炎性體的激活有關(guān)[3].胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞是母胎界面的一種重要細(xì)胞，在成功妊娠過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[4]，并且細(xì)胞中有多種炎性體表達(dá)[5]，LM是否可激活小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體以及LM誘導(dǎo)的小鼠流產(chǎn)是否和LM激活小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體有關(guān)鮮見(jiàn)報(bào)道.因此，本實(shí)驗(yàn)用野生型LM和溶血素O(listeriolysin O，LLO)缺陷型LM (ΔhlyLM)感染小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞，分析LM對(duì)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體的激活和LLO在其中的作用以及炎性體激活對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞死亡率的影響，初步明確LM對(duì)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體的激活及其與LM誘導(dǎo)流產(chǎn)的關(guān)系，為探討LM引起流產(chǎn)的機(jī)理和臨床防治提供科學(xué)依據(jù).

1 材料和方法

1.1 菌株和細(xì)胞株

小鼠胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞系SM9-1和菌株L.monocytogenesEGD (serovar 1/2a)分別由美國(guó)堪薩斯大學(xué)Joan Hunt教授和日本京都大學(xué)Masao Mitsuyama博士惠贈(zèng).

1.2 主要試劑

胎牛血清和培養(yǎng)基RPMI-1640購(gòu)自Gibco BRL公司；重組小鼠白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、天冬氨酸蛋白水解酶1 (cysteinyl aspartate specific proteinase 1，caspase 1) 抑制劑zYVAD-FMK 和LPS購(gòu)自Sigma公司.美洲倉(cāng)鼠抗小鼠IL-1β抗體，生物素標(biāo)記的兔抗小鼠IL-1β抗體購(gòu)自eBioscience公司；辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記的IL-1β二抗購(gòu)自Thermo公司；兔抗鼠半胱氨酸的caspase 1 p10和羊抗兔IgG-AP購(gòu)自Santa Cruz公司;CytoTox96?非放射性細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司；鼠源BrdU抗體、驢抗鼠Alexa Fluor594和DAPI購(gòu)自Abcam公司.

1.3 LM對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞感染的免疫熒光檢測(cè)

將生長(zhǎng)良好的小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞SM9-1鋪于放有cover slip的24孔板中，次日用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LM感染細(xì)胞1 h，50 μg/mL慶大霉素處理1 h以殺死胞外菌，40 g/L PFA固定30 min，通透液通透15 min，封閉液封閉后，分別與一抗和熒光二抗Alexa Fluor 488在濕盒中孵育，DAPI進(jìn)行細(xì)胞核復(fù)染色，封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察.

1.4 LM對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體的激活

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞接種于6孔板，隨機(jī)分組，次日，LM感染組分別加入含相應(yīng)數(shù)量LM的V-15培養(yǎng)基，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，吸出菌懸液，加入含慶大霉素的培養(yǎng)基殺菌1 h，棄去培養(yǎng)基，加入新的V-15培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h.LPS處理組用LPS(0.5 μg/mL)處理細(xì)胞6 h，LM和LPS共處理組中LPS與LM同時(shí)處理6 h，LPS和ATP共處理組加入LPS預(yù)處理4 h后再加入ATP(5 mmol/L)刺激1 h，收集培養(yǎng)基，離心后取上清液待用，細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞裂解液在4 ℃搖床過(guò)夜裂解，次日離心取上清液待用.

1.5 ELISA檢測(cè)IL-1β蛋白水平

取收集的細(xì)胞培養(yǎng)基，用IL-1β捕獲抗體包被96孔板過(guò)夜，封閉液37 ℃封閉2 h，每孔加入50 g/L脫脂牛奶稀釋的待測(cè)樣品100 μL，然后依次加入檢測(cè)抗體、酶標(biāo)抗體，分別孵育2 h，顯色后，采用酶標(biāo)儀讀取450 nm波長(zhǎng)的吸光度(A450)，計(jì)算IL-1β的濃度.

1.6 Western-blot檢測(cè)caspase 1水平

取制備的細(xì)胞裂解液，100 g/L SDS-PAGE電泳后，在恒流180 mA條件下采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，然后分別用羊抗鼠caspase 1和羊抗兔IgG-AP抗體進(jìn)行孵育，底物NBT和BCIP顯色，掃描儀掃描雜交譜帶.

1.7 非放射性細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞死亡

將生長(zhǎng)良好的小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞接種于6孔板，隨機(jī)分為 4 組：空白對(duì)照組、LM感染組、LM與zYVAD-FMK共處理組、zYVAD-FMK處理組.空白對(duì)照組和LM感染組按照1.4中的方法處理細(xì)胞，LM與zYVAD-FMK共處理組中加入zYVAD-FMK(10 μmol/L)12 h后用LM刺激，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至所需時(shí)間后，按照非放射性細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)計(jì)算細(xì)胞毒性百分比，分析小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞的死亡率.

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

通過(guò)SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理.數(shù)據(jù)間均數(shù)差異分析采用t檢驗(yàn)方法.

2 結(jié)果與分析

2.1 LM對(duì)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞的感染和最適感染比的確定

LM感染小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞SM9-1后，經(jīng)慶大霉素處理，用LM熒光抗體對(duì)LM進(jìn)行染色(綠色熒光)，DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色(藍(lán)色熒光)，激光共聚焦顯微鏡觀察LM的分布，結(jié)果顯示，視野中可觀察到LM的存在，并且LM主要分布在細(xì)胞核周?chē)?圖1a)，說(shuō)明LM能夠感染進(jìn)入小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞，因?yàn)閼c大霉素能夠殺死細(xì)胞外的細(xì)菌，只有感染進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌能夠存活.

為分析LM感染能否促進(jìn)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞IL-1β的表達(dá)并確定最適感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)，用不同MOI的LM感染小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)基中IL-1β水平.結(jié)果顯示，感染6 h后，每個(gè)感染組與對(duì)照組相比，培養(yǎng)基中IL-1β水平明顯升高，并且當(dāng)MOI =50時(shí)培養(yǎng)基中IL-1β的水平達(dá)到最高(圖1b).

*與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05).圖1 LM感染滋養(yǎng)層細(xì)胞后的熒光染色(a)和IL-1β的分泌(b)Fig.1 Fluorescence staining (a) and IL-1β secretion (b) of trophoblastic cells infected by LM

2.2 LM對(duì)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體的激活

用LM感染小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞SM9-1(MOI=50)6 h后，與空白對(duì)照組相比，LM感染組培養(yǎng)基中IL-1β水平明顯升高，并且LPS與LM共處理組細(xì)胞培養(yǎng)基中IL-1β水平與單獨(dú)LM處理組相比略有升高，但差異不顯著(圖2a)，說(shuō)明LM既可以促進(jìn)IL-1β前體的產(chǎn)生又可以促進(jìn)IL-1β的成熟.Western blot結(jié)果顯示，LM感染組與對(duì)照組相比，caspase 1 p10片段水平明顯增加(圖2b)，進(jìn)一步表明LM可以激活滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體，促進(jìn)IL-1β前體的成熟和釋放.

** 與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01).圖2 LM感染對(duì)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞IL-1β(a)和caspase 1(b)活化的影響Fig.2 Effects of LM infection on the activation of IL-1β (a) and caspase 1 (b) in mouse trophoblastic cells

2.3 LM對(duì)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞caspase 1依賴(lài)焦亡的誘導(dǎo)

用LM感染小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞，CytoTox96? 非放射性細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)釋放量，評(píng)估細(xì)胞焦亡率.結(jié)果顯示，LM感染6 h后，小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞的LDH釋放量明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明細(xì)胞已開(kāi)始發(fā)生焦亡，感染12 h后，LDH釋放量升高更加明顯，說(shuō)明有較多的細(xì)胞發(fā)生焦亡，但是加入caspase 1抑制劑zYVAD-FMK的LM感染組，無(wú)論是感染6 h還是12 h后，LDH的釋放量明顯低于沒(méi)有加zYVAD-FMK的LM感染組，說(shuō)明LM可通過(guò)激活滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡(圖3).

** 與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01).

2.4 LM激活小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體與LLO的關(guān)系

分別用野生型LM和ΔhlyLM感染滋養(yǎng)層細(xì)胞SM9-1，檢測(cè)培養(yǎng)基中IL-1β水平和細(xì)胞裂解液中caspase 1 p10水平，結(jié)果顯示，野生型LM刺激后小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞IL-1β水平明顯高于對(duì)照組和ΔhlyLM感染組(圖4a)，同時(shí)與對(duì)照組和ΔhlyLM感染組相比，LM組caspase 1 p10的產(chǎn)生明顯增多(圖4b),說(shuō)明LLO在LM激活小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體中發(fā)揮著重要作用.

圖4 LLO對(duì)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞IL-1β(a)和caspase 1(b)活化的影響Fig.4 Effects of LLO on the activation of IL-1β (a) and caspase 1 (b) in mouse trophoblastic cells

3 討論

LM感染可致妊娠動(dòng)物和孕婦流產(chǎn)，嚴(yán)重影響畜牧養(yǎng)殖業(yè)和人類(lèi)生殖健康[1-2]，但其致流產(chǎn)的機(jī)制尚不清楚.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，LM誘導(dǎo)的小鼠流產(chǎn)與母胎界面炎性體的激活有關(guān)[3]，本研究在本實(shí)驗(yàn)室已有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上[3]，在體外通過(guò)分析LM對(duì)小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體的激活及其誘導(dǎo)的死亡探討LM誘導(dǎo)小鼠流產(chǎn)的機(jī)制.

在妊娠過(guò)程中，胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞不僅是成功妊娠的物質(zhì)基礎(chǔ)，還是母胎界面特殊的天然免疫細(xì)胞[6]，其中有多種炎性體表達(dá).炎性體是免疫細(xì)胞內(nèi)的一類(lèi)模式識(shí)別受體，通過(guò)識(shí)別病原相關(guān)分子模式和危險(xiǎn)信號(hào)分子招募和活化caspase 1，激活I(lǐng)L-1β和IL-18前體的成熟[7-8]，在LM感染過(guò)程中，炎性體適度的激活對(duì)妊娠具有保護(hù)作用[9-10]，但過(guò)度的激活可導(dǎo)致免疫失衡和組織損傷，誘導(dǎo)妊娠失敗[3,5].本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LM感染可激活小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體，誘導(dǎo)IL-1β的成熟分泌，異常的IL-1β水平則會(huì)改變母胎界面的免疫平衡，導(dǎo)致妊娠失敗[11-12]，這可能是LM誘導(dǎo)流產(chǎn)的一個(gè)重要因素.

妊娠過(guò)程中，胎盤(pán)細(xì)胞的正常死亡對(duì)妊娠的維持具有重要作用，但是胎盤(pán)細(xì)胞死亡率過(guò)高或過(guò)低均會(huì)導(dǎo)致妊娠失敗[13].研究顯示，LM誘導(dǎo)的MAPK脫磷酸化使細(xì)胞中抗凋亡因子血紅素加氧酶-1表達(dá)下降引發(fā)的胎盤(pán)細(xì)胞凋亡與LM引發(fā)的流產(chǎn)有關(guān)[14].caspase 1依賴(lài)的焦亡是細(xì)胞死亡的另一種方式，關(guān)于LM感染后滋養(yǎng)層細(xì)胞是否會(huì)發(fā)生焦亡還未見(jiàn)報(bào)道，本文的結(jié)果顯示，LM可誘導(dǎo)caspase 1依賴(lài)的滋養(yǎng)層細(xì)胞焦亡，這可能是LM誘導(dǎo)流產(chǎn)的又一重要因素.

LLO是LM的一個(gè)重要的毒力因子，在LM感染宿主細(xì)胞過(guò)程中通過(guò)其成孔毒性發(fā)揮著重要的作用，另外本文的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，在LM誘導(dǎo)小鼠流產(chǎn)的過(guò)程中，LLO可通過(guò)激活巨噬細(xì)胞炎性體發(fā)揮重要作用[3]，但LLO是否可激活母胎界面的滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體還未見(jiàn)報(bào)道.本文的結(jié)果顯示，ΔhlyLM感染的小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的IL-1β和caspase 1 p10水平明顯低于野生型LM感染組，說(shuō)明LLO在LM激活小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用.

綜上，LM誘導(dǎo)的流產(chǎn)可能與滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性體激活誘導(dǎo)的IL-1β分泌水平增加和細(xì)胞焦亡有關(guān)，在此過(guò)程中LM的毒力因子LLO發(fā)揮著重要的作用.