宋正鋒，劉媛媛，戚鵬，談仙星，馬磊

腦缺血是一種發(fā)病率、致殘率和病死率均較高的腦血管疾病，在全球所有因病死亡原因排名中僅次于缺血性心臟?。?］。目前，臨床常用的腦缺血治療方法是及時(shí)恢復(fù)大腦血液灌注，但會(huì)造成腦缺血再灌注損傷［2］。有研究顯示，在腦缺血再灌注損傷中，腦細(xì)胞的生物膜結(jié)構(gòu)和線粒體功能被破壞，并觸發(fā)線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑和死亡受體途徑的細(xì)胞凋亡［3］。研究表明，微小核糖核酸-15b（microRNA-15b，miR-15b）能夠以凋亡抑制基因B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）為靶點(diǎn)，下調(diào)Bcl-2 的表達(dá)以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡過(guò)程［4］。而心肌缺血再灌注損傷會(huì)誘導(dǎo)miR-15b 的表達(dá)上調(diào)［5］，但miR-15b在腦缺血再灌注損傷中的具體功能尚不清楚。本研究通過(guò)構(gòu)建大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞缺血再灌注損傷模型，探討miR-15b 基因干擾對(duì)腦缺血再灌注損傷的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 5只新生24 h內(nèi)無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)Wistar 乳鼠，雌雄不限，體質(zhì)量（17．59±2．35）g，購(gòu)自南通大禹生物技術(shù)有限公司［動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2019-0008］；293 T細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)Sciencell 公司（批號(hào)T191203）；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒購(gòu)自廣州兆康生物科技有限公司（批號(hào)1915142）；兔抗鼠角質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Merck 公司（批號(hào)190417C）；氮蘭四唑鹽（methyl tetrazolium salt，MTS）溶液購(gòu)自上海羽哚生物科技有限公司（批號(hào)181203）；聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒購(gòu)自日本TAKARA 公司（批號(hào)RR820A）；兔抗鼠Bcl-2、胱天蛋白酶（Caspase）-3、Caspase-9 單克隆抗體，羊抗兔Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9 多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Merck 公司（批號(hào)190225A、181006A、191117C、180526A、190718B、191225C）；pMiR-LucTM熒光素酶報(bào)告載體購(gòu)自廣州伯信生物科技有限公司（批號(hào)1915179）。HALO MPR-96 型酶標(biāo)儀購(gòu)自英國(guó)Dynamica 公司；LABOSPECT 006 型自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自日本Hitachi公司；Attune NxT型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；S1000?384 Well 型PCR 儀購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；MSMINIONE 型電泳儀購(gòu)自英國(guó)Cleaver 公司；ZF-258型凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自上海嘉鵬科技有限公司。

1.2 大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)及鑒定

1.2.1 大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng) 取新生24 h以內(nèi)的Wistar 乳鼠，碘伏消毒后，在無(wú)菌環(huán)境下剪開(kāi)頭皮和顱骨，分離出雙側(cè)大腦皮層，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗后將大腦皮層剪碎。用胰蛋白酶消化20 min，加入3 mL 含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，1 000 r/min 離心5 min（離心半徑6 cm），棄去上清液并加入DMEM培養(yǎng)液，反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液。經(jīng)100目尼龍網(wǎng)過(guò)濾后，用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1．0×106個(gè)/mL，接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)飽和濕度條件下培養(yǎng)50 min，更換培養(yǎng)瓶并棄去未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)50 min，24 h后換液去除懸浮死亡細(xì)胞，每3 d換液1次，經(jīng)過(guò)9～11 d細(xì)胞融合為單層細(xì)胞即可傳代培養(yǎng)。

1.2.2 大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞傳代培養(yǎng) 棄去原培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)DMEM 培養(yǎng)基，用D-Hanks 液清洗2 次，加入0．1%的胰酶，倒置相差顯微鏡下觀察。待細(xì)胞間隙增大、大部分細(xì)胞突起回縮且細(xì)胞形態(tài)略變圓時(shí)，棄去酶液，加入完全培養(yǎng)基以終止消化，反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液。以1．0×104個(gè)/mL的細(xì)胞密度重新接種在新培養(yǎng)瓶中，每2～3 d換液1次，5～7 d后可再次傳代，取第4代細(xì)胞（星形膠質(zhì)細(xì)胞純度較高）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞鑒定 GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白，故通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定GFAP 表達(dá)［6］。取培養(yǎng)所得的第4 代細(xì)胞進(jìn)行GFAP 免疫化學(xué)染色，顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)視野內(nèi)GFAP 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比例，陽(yáng)性細(xì)胞占比大于95%即證實(shí)大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)成功。

1.3 細(xì)胞分組及干預(yù) 取第4代細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞培養(yǎng)至亞融合狀態(tài)時(shí)將細(xì)胞分為對(duì)照組和模型組。對(duì)照組加入含20%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；模型組采用氧糖剝奪/再恢復(fù)法處理模擬體內(nèi)腦缺血再灌注損傷，即在培養(yǎng)基內(nèi)加入含5．0×10-4mol/L 的連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）的無(wú)糖Earle’s 液，1 h 后改為DMEM 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，模擬體內(nèi)腦缺血再灌注損傷［7］。構(gòu)建miR-15b 干擾腺病毒過(guò)表達(dá)載體（Ad miR-15b）、沉默載體（Ad as miR-15b）、過(guò)表達(dá)對(duì)照載體（Ad miR-15b-NC）和沉默對(duì)照載體（Ad as miR-15b-NC），送至杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司鑒定，將構(gòu)建成功的載體分別轉(zhuǎn)染上述模型組細(xì)胞，記為過(guò)表達(dá)組、沉默組、過(guò)表達(dá)對(duì)照組、沉默對(duì)照組，另設(shè)置空白組，每組各設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。

1.4 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和轉(zhuǎn)染效率觀察 各組細(xì)胞分組并培養(yǎng)24 h后，在倒置相差顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化。另在熒光顯微鏡下觀察拍照，計(jì)算各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率＝熒光顯微鏡下發(fā)光細(xì)胞數(shù)/普通顯微鏡下細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5 各組細(xì)胞存活率、細(xì)胞活力及凋亡率檢測(cè) （1）MTS 檢測(cè)細(xì)胞存活率。在培養(yǎng)于96孔板的各組細(xì)胞內(nèi)每孔避光加入20 μL MTS溶液，設(shè)置空白對(duì)照組，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h。并用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在490 nm波長(zhǎng)處的光密度（OD）值，重復(fù)3 次取平均值，細(xì)胞存活率（%）=OD實(shí)驗(yàn)組／OD空白對(duì)照組×100%。（2）LDH 漏出率實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力。取培養(yǎng)于96 孔板的各組細(xì)胞，按照LDH 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作步驟，用自動(dòng)生化分析儀分別檢測(cè)各組細(xì)胞上清液和細(xì)胞內(nèi)LDH活力。細(xì)胞活力（%）=上清液LDH活力/（上清液LDH活力＋細(xì)胞內(nèi)LDH活力）×100%。（3）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。取各組細(xì)胞培養(yǎng)96 h 后，按1．0×105個(gè)/μL 置于流式管中，PBS沖洗2次，加入500 μL的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入Annexin V-FITC 和PI 各5 μL，室溫避光孵育10 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用FlowJo v10．8．1軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測(cè)各組細(xì)胞miR-15b 以及Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9 mRNA 表達(dá) 取各組細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后qPCR檢測(cè)各目的基因mRNA的表達(dá)。用PureLink 純化試劑盒提取總RNA，合成cDNA。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成，miR-15b 引物：上 游 5'-TAGCTAGTCATGCTAAGC-3'，下 游 5'-CATGTATAGCTAATGCAC-3'，產(chǎn)物大小318 bp；Bcl-2 引物：上 游 5'-ATCTATAATGCGTACCCATG-3'，下 游 5'-TTAGCTGACCAGTTACATTA-3'，產(chǎn)物大小326 bp；Caspase-3 引物：上游5'-TGTTCATGCTAATGCACCTTGA-3'，下游5'-GCAACTAGCATTACGGACAACT-3'，產(chǎn)物大小330 bp；Caspase-9引物：上游5'-ATAACTGAATCGAACACT-3'，下游5'-GCAACTACTGATACGTAC-3'，產(chǎn)物大小314 bp。反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ10 μL，上下游引物各0．8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0．4 μL，cDNA 模板2．0 μL，DEPC 水6．0 μL。反應(yīng)過(guò)程：94 ℃3 min；94 ℃15 s，52 ℃1 min，72 ℃1 min，40 個(gè)循環(huán)。miR-15b 以U6 為內(nèi)參，其余基因以β-actin 為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算各目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá) 取各組細(xì)胞，培養(yǎng)48 h 后棄去培養(yǎng)液，冰浴條件下用200 W功率超聲波破碎細(xì)胞5次，每次5 s，提取總蛋白。加入3 μL的上樣緩沖液混合均勻，100 ℃熱修復(fù)5 min。90 V電壓電泳15 min 濃縮膠，120 V 恒壓電泳1 h 分離膠。取凝膠，以濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜。1．5 h 后洗膜3 次，每次10 min；用5%脫脂牛奶封閉1 h再次以同法洗膜；加入一抗（1∶2 000），4 ℃孵育過(guò)夜，次日加入二抗（1∶2 000）；加入400 μL化學(xué)發(fā)光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL），室溫避光孵育1 min，保鮮膜包好置于壓片夾中，暗室顯影、定影，標(biāo)定Marker，掃描分析，計(jì)算各目標(biāo)蛋白與β-actin灰度值的比值。

1.8 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-15b 是否靶向調(diào)控Bcl-2 采用TargetScan 靶基因在線軟件（http://www．targetscan．org/vert_72/）預(yù)測(cè)miR-15b的靶基因。將野生型和突變型Bcl-2 熒光素酶報(bào)告載體與Ad miR-15b、Ad miR-15b-NC共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞，以空載體作為空白對(duì)照組。棄去培養(yǎng)液，用100 μL 的PBS 沖洗各孔，每孔加入50 μL 細(xì)胞裂解液，于搖床上室溫?fù)u15 min裂解細(xì)胞，取10 μL上清液加入酶標(biāo)板中，加入100 μL的LARⅡ檢測(cè)試劑，靜置2 s后用酶標(biāo)儀檢測(cè)數(shù)據(jù)。隨后每孔加入100 μL 的淬滅劑，靜置2 s 后再次檢測(cè)數(shù)據(jù)。計(jì)算出前后2組數(shù)據(jù)的比值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0．05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定 GFAP陽(yáng)性細(xì)胞胞體肥大，突起分支少，胞核呈空泡狀，不顯色，其中陽(yáng)性細(xì)胞占比（98．12±2．05）%，大于95%，證實(shí)大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)成功，見(jiàn)圖1。

Fig．1 Identification of astrocytes in rat cerebral cortex(immunochemical staining，×200)圖1 大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞鑒定（免疫化學(xué)染色，×200）

2.2 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和轉(zhuǎn)染效率觀察 （1）形態(tài)學(xué)變化。對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞體積較大，突起粗壯，具有折光性，胞間聯(lián)系緊密；空白組、過(guò)表達(dá)對(duì)照組和沉默對(duì)照組細(xì)胞明顯可見(jiàn)貼壁細(xì)胞減少，細(xì)胞縮小變圓，細(xì)胞間隙變大，分布松散，折光性差；過(guò)表達(dá)組細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步減少，分布更加稀疏，可見(jiàn)有明顯細(xì)胞漂浮于培養(yǎng)液中；沉默組細(xì)胞數(shù)量較空白組和沉默對(duì)照組增加，但仍低于對(duì)照組，細(xì)胞有輕微縮小。（2）轉(zhuǎn)染效率。除對(duì)照組和空白組外，各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率均在85%以上，其中對(duì)照組和空白組轉(zhuǎn)染效率為0；過(guò)表達(dá)對(duì)照組轉(zhuǎn)染效率為（89．26±5．13）%；沉默對(duì)照組轉(zhuǎn)染效率為（90．21±6．70）%；過(guò)表達(dá)組轉(zhuǎn)染效率為（92．04±6．55）%；沉默組轉(zhuǎn)染效率為（88．18±5．82）%，見(jiàn)圖2。

2.3 各組細(xì)胞存活率、細(xì)胞活力及凋亡率比較 與對(duì)照組比較，空白組、過(guò)表達(dá)對(duì)照組和沉默對(duì)照組細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡率升高（P＜0．05）；與空白組和過(guò)表達(dá)對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡率升高（P＜0．05）；與空白組和沉默對(duì)照組比較，沉默組細(xì)胞存活率升高，細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡率降低（P＜0．05），見(jiàn)圖3，表1。

Fig．2 Cell morphology and transfection efficiency of each group(×100)圖2 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)及轉(zhuǎn)染效率（×100）

Fig．3 Analysis of apoptosis rate in each group圖3 各組細(xì)胞凋亡率分析

Tab.1 Analysis of cell survival rate,cell viability and apoptosis rate in each group表1 各組細(xì)胞的存活率、細(xì)胞活力及凋亡率比較（n=3，%，±s）

Tab.1 Analysis of cell survival rate,cell viability and apoptosis rate in each group表1 各組細(xì)胞的存活率、細(xì)胞活力及凋亡率比較（n=3，%，±s）

＊＊P＜0．01；a與對(duì)照組比較，b與空白組比較，c與過(guò)表達(dá)對(duì)照組比較，d與沉默對(duì)照組比較，P＜0．05。

組別對(duì)照組空白組過(guò)表達(dá)對(duì)照組沉默對(duì)照組過(guò)表達(dá)組沉默組F存活率95．62±6．39 29．51±5．84a 28．94±5．73a 26．45±6．86a 9．12±1．02abc 55．23±8．04abd 76．586＊＊細(xì)胞活力1．85±0．33 52．27±9．02a 49．58±9．23a 51．14±9．55a 77．25±11．78abc 27．36±5．15abd 28．127＊＊凋亡率4．55±0．81 40．26±7．04a 42．55±7．30a 41．93±7．55a 64．54±10．06abc 21．18±2．03abd 28．700＊＊

2.4 各組細(xì)胞miR-15b 以及Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9 mRNA 表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，空白組、過(guò)表達(dá)對(duì)照組和沉默對(duì)照組細(xì)胞miR-15b、Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)升高，Bcl-2 mRNA表達(dá)降低（P＜0．05）；與空白組和過(guò)表達(dá)對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞miR-15b、Caspase-3、Caspase-9 mRNA 表達(dá)升高，Bcl-2 mRNA 表達(dá)降低（P＜0．05）；與空白組和沉默對(duì)照組比較，沉默組細(xì)胞miR-15b、Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)降低，Bcl-2 mRNA表達(dá)升高（P＜0．05），見(jiàn)表2。

2.5 各組細(xì)胞Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9 蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，空白組、過(guò)表達(dá)對(duì)照組和沉默對(duì)照組細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)升高，Bcl-2 蛋白表達(dá)降低（P＜0．05）；與空白組和過(guò)表達(dá)對(duì)照組相比較，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低（P＜0．05）；與空白組和沉默對(duì)照組比較，沉默組細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9 蛋白表達(dá)降低，Bcl-2 蛋白表達(dá)升高（P＜0．05），見(jiàn)圖4，表3。

2.6 熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果 TargetScan 軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，Bcl-2 的3'-UTR 序列中含有miR-15b 的結(jié)合位點(diǎn)，表明Bcl-2 可能是miR-15b 的靶基因，見(jiàn)圖5。在轉(zhuǎn)染野生型Bcl-2細(xì)胞中，Ad miR-15b細(xì)胞的熒光素酶相對(duì)活性低于Ad miR-15b-NC 細(xì)胞（0．55±0．09vs.1．06±0．18，t=4．389，P＜0．05）；在轉(zhuǎn)染突變型Bcl-2 細(xì)胞中，Ad miR-15b 細(xì)胞的熒光素酶相對(duì)活性與Ad miR-15b-NC 細(xì)胞熒光素酶相對(duì)活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1．01±0．17vs.0．98±0．15，t=0．229，P＞0．05）。

Tab.2 Analysis of relative expression levels of miR-15b,Bcl-2,Caspase-3 and Caspase-9 mRNA in cells of each group表2 各組細(xì)胞的miR-15b以及Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（n=3，±s）

Tab.2 Analysis of relative expression levels of miR-15b,Bcl-2,Caspase-3 and Caspase-9 mRNA in cells of each group表2 各組細(xì)胞的miR-15b以及Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（n=3，±s）

＊＊P＜0．01；a與對(duì)照組比較，b與空白組比較，c與過(guò)表達(dá)對(duì)照組比較，d與沉默對(duì)照組比較，P＜0．05。

組別對(duì)照組空白組過(guò)表達(dá)對(duì)照組沉默對(duì)照組過(guò)表達(dá)組沉默組F miR-15b 1．03±0．18 1．78±0．31a 1．85±0．34a 1．82±0．33a 2．98±0．52abc 1．11±0．19bd 16．952＊＊Bcl-2 1．01±0．20 0．52±0．09a 0．50±0．09a 0．47±0．08a 0．18±0．03abc 0．87±0．16abd 30．145＊＊Caspase-3 0．98±0．17 2．05±0．38a 2．01±0．35a 1．99±0．36a 3．26±0．57abc 1．24±0．21bd 21．377＊＊Caspase-9 1．00±0．19 1．62±0．28a 1．59±0．26a 1．65±0．30a 2．74±0．51abc 1．07±0．16bd 14．108＊＊

Fig．4 The expression levels of Bcl-2,Caspase-3 and Caspase-9 protein in cells of each group圖4 各組細(xì)胞Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)

Tab.3 Analysis of relative expression levels of Bcl-2,Caspase-3 and Caspase-9 proteins in cells of each group表3 各組細(xì)胞的Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量分析（n=3，±s）

Tab.3 Analysis of relative expression levels of Bcl-2,Caspase-3 and Caspase-9 proteins in cells of each group表3 各組細(xì)胞的Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量分析（n=3，±s）

＊＊P＜0．01；a與對(duì)照組比較，b與空白組比較，c與過(guò)表達(dá)對(duì)照組比較，d與沉默對(duì)照組比較，P＜0．05。

組別對(duì)照組空白組過(guò)表達(dá)對(duì)照組沉默對(duì)照組過(guò)表達(dá)組沉默組F Bcl-2 1．71±0．27 0．79±0．12a 0．76±0．12a 0．80±0．13a 0．30±0．08abc 1．26±0．18abd 26．973＊＊Caspase-3 0．52±0．08 1．51±0．25a 1．55±0．28a 1．46±0．24a 2．31±0．37abc 0．78±0．14bd 20．052＊＊Caspase-9 0．48±0．07 1．15±0．21a 1．22±0．22a 1．06±0．18a 1．85±0．31abc 0．51±0．12bd 19．406＊＊

Fig．5 Binding site of miR-15b in Bcl-2圖5 miR-15b在Bcl-2的結(jié)合位點(diǎn)圖

3 討論

miR-15b位于SMC4基因的第5內(nèi)含子中，廣泛參與了細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及周期調(diào)控等重要細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程［8］。有研究顯示，miR-15b 在肺癌、肝癌和胃癌細(xì)胞中均參與了調(diào)控細(xì)胞凋亡過(guò)程［9-10］。在新生大鼠的心肌細(xì)胞中，miR-15b被證實(shí)可以通過(guò)活化Caspase 信號(hào)通路和調(diào)控細(xì)胞凋亡線粒體途徑，從而誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞凋亡［11］。本研究中，各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率均在85%以上，說(shuō)明miR-15b成功轉(zhuǎn)染大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞；與空白組和過(guò)表達(dá)對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡率升高；與空白組和沉默對(duì)照組相比，沉默組細(xì)胞存活率升高，細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡率降低，表明miR-15b 過(guò)表達(dá)會(huì)降低細(xì)胞活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，miR-15b 沉默則有增加細(xì)胞活力并減少細(xì)胞凋亡的作用。

腦缺血再灌注損傷誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的途徑包括線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑和死亡受體途徑［12］。Caspase-3是這3種凋亡途徑共同的下游效應(yīng)分子，是凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路。有研究顯示，在正常人腦神經(jīng)細(xì)胞中Caspase-3蛋白幾乎無(wú)表達(dá)，在腦缺血狀態(tài)下Caspase-3 蛋白表達(dá)明顯升高，且Caspase-3 蛋白表達(dá)的變化趨勢(shì)與腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡的變化趨勢(shì)保持一致［13］。Bcl-2 基因被廣泛認(rèn)為是一種內(nèi)源性凋亡抑制基因，對(duì)維持腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的生存有重要作用。Bcl-2蛋白是一種主要存在于線粒體外膜的穩(wěn)定蛋白，能夠保護(hù)線粒體內(nèi)外膜的穩(wěn)定性。線粒體是細(xì)胞凋亡線粒體途徑的控制中心，線粒體外膜被破壞后釋放的細(xì)胞色素C等凋亡誘導(dǎo)因子，能夠激活Caspase-9和Caspase-3并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［14］。Caspase-9是細(xì)胞線粒體凋亡途徑中的重要起始因子，當(dāng)線粒體發(fā)出促凋亡信號(hào)后，被活化的Caspase-9通過(guò)激活下游的Caspases，進(jìn)一步放大級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［15］。另有研究顯示，在大鼠腦缺血再灌注損傷模型中，可以通過(guò)誘導(dǎo)Bcl-2 基因的表達(dá)，抑制Caspase-3 活性，減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，保護(hù)腦組織［16］。本研究中，與空白組和過(guò)表達(dá)對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)降低，miR-15b表達(dá)以及Caspase-3、Caspase-9 mRNA 和蛋白表達(dá)升高；與空白組和沉默對(duì)照組比，沉默組細(xì)胞Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)升高，miR-15b 表達(dá)以及Caspase-3、Caspase-9 mRNA和蛋白表達(dá)降低，表明miR-15b過(guò)表達(dá)能降低Bcl-2的表達(dá)，增加Caspase-3、Caspase-9 的表達(dá)，miR-15b 沉默則升高Bcl-2 的表達(dá)，抑制Caspase-3、Caspase-9 的表達(dá)，推測(cè)miR-15b 是通過(guò)降低Bcl-2 的表達(dá)，增加Caspase-3、Caspase-9 的表達(dá)以實(shí)現(xiàn)降低細(xì)胞活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果，進(jìn)一步加重腦缺血再灌注損傷。

miRNA 作用于靶基因的3'-UTR 起作用，故把目的基因的3'-UTR 區(qū)域構(gòu)建于熒光素酶報(bào)告基因載體中，可通過(guò)比較過(guò)表達(dá)或者干擾miRNA 前后，檢測(cè)螢光素酶活性變化以反映miRNA 對(duì)目的基因的靶向作用［17］。有研究顯示，山奈酚可通過(guò)激活胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）途徑下調(diào)miR-15b的表達(dá)，下調(diào)的miR-15b靶向作用于Bcl-2并通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2 的表達(dá)減少氧-葡萄糖剝奪引起的細(xì)胞凋亡，緩解缺血性心臟病病情［18］。本研究中，在轉(zhuǎn)染野生型Bcl-2 細(xì)胞中，Ad miR-15b 細(xì)胞的熒光素酶相對(duì)活性低于Ad miR-15b-NC 細(xì)胞，說(shuō)明miR-15b 與Bcl-2 的3'-UTR 序列有結(jié)合位點(diǎn)，miR-15b轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞后抑制了該靶點(diǎn)的熒光素酶活性，干擾Bcl-2 的3'-UTR 序列結(jié)合位點(diǎn)后，熒光強(qiáng)度基本恢復(fù)正常，證實(shí)了miR-15b可靶向調(diào)控Bcl-2。

綜上所述，miR-15b 沉默是通過(guò)線粒體凋亡途徑增加Bcl-2 的表達(dá)，降低Caspase-3、Caspase-9 的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡，減輕腦缺血再灌注損傷。這為miR-15b運(yùn)用于腦缺血再灌注損傷治療提供了理論依據(jù)。