唐瑞霞　蘇晗　邢倩

【摘 要】目的：分析類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）患者與健康人群腸道菌群的結(jié)構(gòu)差異，探討腸道菌群在RA骨代謝中的臨床意義。方法：收集32例RA合并骨質(zhì)疏松患者，30例RA合并骨量減少患者和32例健康對照者的糞便樣本，利用Illumina MiSeq平臺對樣本16S rRNA基因序列V3-V4高變區(qū)進行PCR擴增及測序，分析Alpha、Beta多樣性及菌群差異性，用LEfSe聚類分析法得到各組差異腸道菌群。觀察各組對象RA相關(guān)抗體、炎性指標及血清骨代謝指標水平，對連續(xù)變量資料采用方差分析，同時與腸道菌群間進行Spearman相關(guān)性分析。結(jié)果：RA組腸道菌群厚壁菌門/擬桿菌門

（F/B）顯著低于健康對照組（P < 0.05），而RA不同骨代謝水平組間F/B差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。采用Wilcox秩和檢驗進行組間差異顯著性分析，提示3組間在菌群構(gòu)成上差異有統(tǒng)計學意義（P = 0.001）。LEfSe分析尋找組間代表性菌屬，結(jié)果表明，健康對照組的代表性菌屬為p-Firmicutes、g-Megamonas、g-Agathobacter；RA合并骨質(zhì)疏松組為o-Enterobacteriales、f-Enterobacteriaccae；RA合并骨量減少組為s-Bacteroides-plebeius，差異有統(tǒng)計學意義（LDA值均 > 4）。采用Spearman相關(guān)性檢驗與LEfSe分析相結(jié)合，結(jié)果顯示，Megamonas菌屬與類風濕因子（RF）、β膠聯(lián)降解產(chǎn)物等骨代謝標志物（β-CTX）呈負相關(guān)

（P < 0.05）；Agathobacter菌屬與RF、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體呈負相關(guān)，與25-羥維生素D呈正相關(guān)（P < 0.05）；大腸埃希菌與PINP呈正相關(guān)（P < 0.05），與25-羥維生素D呈負相關(guān)（P < 0.05）。結(jié)論：RA患者存在腸道菌群失調(diào)，可能通過影響炎癥因子、骨代謝標志物等方面參與RA骨代謝的異常。

【關(guān)鍵詞】 類風濕關(guān)節(jié)炎；骨質(zhì)疏松；腸道菌群；骨代謝；16S rRNA

Study on the Relationship Between Intestinal Flora and Bone Metabolism in Patients with Rheumatoid Arthritis

TANG Rui-xia，SU Han，XING Qian

【ABSTRACT】Objective：To analyze the structural differences of intestinal flora between patients with rheumatoid arthritis（RA）and healthy people，and to explore the clinical significance of intestinal flora in bone metabolism of RA.Methods：Fecal samples from 32 RA patients with osteoporosis，30 RA patients with osteopenia and 32 healthy controls were collected.The highly variable regions of the 16S rRNA gene sequence V3-V4 were amplified and sequenced using Illumina MiSeq platform.Alpha and Beta diversity analysis and flora difference analysis were performed.Differential intestinal flora in each group was obtained by LEfSe cluster analysis.The levels of RA related antibody，inflammatory index and serum bone metabolism index were observed in each group.Analysis of variance was used for continuous variable data，and Spearman correlation analysis was conducted for intestinal flora.Results：The intestinal microflora of Firmicutes/Bacteroides（F/B）in RA group was significantly lower than that in healthy control group（P < 0.05），while there was no significant difference in F/B between RA groups with different bone metabolism levels（P > 0.05）.Wilcox rank sum test was used to analyze the significance of differences between groups，indicating that there was a statistically significant difference in the composition of flora among the three groups（P = 0.001）.The results of LEfSe analysis showed that the representative genera of the healthy control group were p-Firmicutes，g-Megamonas，g-Agathobacteria;the RA group with osteoporosis was o-Enterobacterials and f-Enterobacteriacae;the RA group with reduced osteopenia was s-Bacteroides-plebeius，and the difference was statistically significant（LDA value > 4）.The results of using Spearman correlation test and LEfSe analysis showed that Megamonas was negatively correlated with RF and β-CTX）;Agathobacter was negatively correlated with RF and anti-cyclic citrullinated peptide antibody，and positively correlated with 25 hydroxyvitamin D;Escherichia coli was positively correlated with PINP and negatively correlated with

25 hydroxyvitamin D.Conclusion：RA patients have intestinal flora imbalance，which may be involved in abnormal bone metabolism in RA by influencing inflammatory factors and bone metabolism markers.

【Keywords】 rheumatoid arthritis;osteoporosis;intestinal flora;bone metabolism;16S rRNA

類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種侵犯滑膜和軟骨的自身免疫性疾病，特征為多關(guān)節(jié)慢性炎癥，伴有骨侵蝕和軟骨破壞。RA患者易出現(xiàn)全身和局部骨質(zhì)丟失，骨質(zhì)疏松（osteoporosis，OP）發(fā)生率遠高于正常人［1］。RA骨代謝異?？赡芘c疾病本身及內(nèi)外環(huán)境因素有關(guān)，其發(fā)病機制尚未闡明［2］。隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，腸道菌群與宿主疾病的關(guān)系受到廣泛關(guān)注。當發(fā)生菌群失調(diào)時，腸道菌群失去原有的保護功能，腸道黏膜屏障破壞，不能有效阻止病原菌進入機體，可激活免疫系統(tǒng)，導致多種疾病發(fā)生。目前許多研究證實，RA患者較正常人群腸道菌群結(jié)構(gòu)存在明顯差異［3］。國外一項大型前瞻性隊列研究發(fā)現(xiàn)，慢性腹瀉與RA的發(fā)病風險存在關(guān)聯(lián)［4］。但腸道菌群失調(diào)是否參與RA的發(fā)生發(fā)展、是否對RA患者骨代謝存在影響尚不明確。本試驗旨在研究RA患者不同骨代謝水平和健康對照人群腸道菌群的構(gòu)成差異，同時進行相關(guān)性分析，初步揭示腸道菌群與RA骨代謝發(fā)病的關(guān)系。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2020年3月至2021年2月

在青島市市立醫(yī)院就診的62例RA患者，分為RA合并OP組32例、RA骨量減少組30例，同時選取同期門診健康人群32例為健康對照組。雙能X線骨密度測定儀對患者進行腰椎前后位（L2～L4）、雙側(cè)股骨頸、大轉(zhuǎn)子的骨密度（BMD）值測定。由經(jīng)過專門培訓的技術(shù)人員進行測量，BMD值低于同性別、同種族健康成人的骨峰值不足1個標準差屬正常，降低1～

2.4個標準差為骨量減少，降低程度≥2.5個標準差診斷為OP。任一部位BMD的T值≤ -2.5即診斷為OP［5］。3組在性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、吸煙等方面比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），具有可比性。見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 診斷標準 按照2010年美國風濕病學會（ACR）和歐洲抗風濕病聯(lián)盟（EULAR）發(fā)布的RA診斷標準。

1.3 納入標準 ①RA患者均符合上述診斷標準；②健康對照人群指未患有風濕病且骨量正常，以及無已知影響腸道菌群、骨代謝疾病的人群；③患者自愿參與，且簽署知情同意書。

1.4 排除標準 ①BMI值明顯偏離正常范圍者；②重疊其他風濕病者，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、嚴重膝骨關(guān)節(jié)炎等；③合并嚴重的腎、肝、心、腦和造血系統(tǒng)等嚴重疾病者；④合并精神疾病、胃腸炎及其他炎癥性疾病和傳染病者，妊娠期及哺乳期婦女；⑤8周內(nèi)使用抗生素或益生菌治療者；⑥有特殊飲食習慣者；⑦血鈣及骨代謝指標明顯偏離正常范圍者；⑧使用大劑量激素治療者；⑨資料不完整者。

2 方 法

2.1 治療方法 RA患者組接受規(guī)范藥物治療，口服免疫抑制劑甲氨蝶呤片（上海上藥信誼藥廠有限公司，批號220901，規(guī)格2.5 mg），每次7.5～12.5 mg，每周1次，碳酸鈣D3咀嚼片（惠氏制藥有限公司，國藥準字H10950030，規(guī)格碳酸鈣0.75 mg、維生素D3 60國際單位），每次1片，每日1次。為保證健康對照組血鈣水平（CA）不受口服補鈣劑影響，選取預防性補鈣（碳酸鈣D3咀嚼片，每次1片，每日1次）老年人群為健康對照組。

2.2 腸道菌群測定 收集研究對象的清晨（6：00～8：00）新鮮大便標本2 mL于一次性無菌糞便采集管中，收集后置于液氮中，研究人員30 min內(nèi)將標本轉(zhuǎn)移至實驗室，并將糞便標本轉(zhuǎn)移至2 mL凍存管，編號放于-80℃低溫條件下保存。標本4 ℃解凍，用超純水1∶3稀釋，制成糞便漿。使用ZR-96糞便DNA試劑盒，分離DNA。提取樣品總DNA后，根據(jù)保守區(qū)設計得到引物，在引物末端加上測序接頭，進行PCR擴增并對其產(chǎn)物進行純化、定量和均一化形成測序文庫，建好的文庫先進行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina HiSeq 2500進行高通量測序。對原始測序序列進行過濾、雙端拼接，得到優(yōu)化序列（Tags），并將優(yōu)化序列進行聚類，劃分OTU，并根據(jù)OTU的序列組成得到其物種分類。

2.3 炎性因子、RA相關(guān)抗體及骨代謝標志物檢測 使用EDTA抗凝管收集研究對象晨起后的空腹肘靜脈血2管5 mL，于30 min內(nèi)送至檢驗科分別檢測相關(guān)指標。采用靜置法檢測紅細胞沉降率（ESR），免疫擴散法檢測C反應蛋白（CRP），酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測類風濕因子（RF）、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（抗CCP抗體）等相關(guān)抗體、25-羥維生素D、甲狀旁腺激素（PTH）、骨鈣素（BGP）、總Ⅰ型膠原氨基端前肽（PINP）、β膠聯(lián)降解產(chǎn)物等骨代謝標志物（β-CTX），絡合滴定法檢測CA水平。

2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布以表示，3組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析；計數(shù)資料采用χ2檢驗。腸道菌群測序資料通過R語言進行Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析，Wilcox秩和檢驗進行組間差異顯著性分析、主坐標分析（PCoA）、LEfSe分析、Spearman相關(guān)性分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 3組ESR、CRP、RF、抗CCP抗體比較 3組ESR、CRP、RF、抗CCP抗體比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表2。

3.2 3組血清骨代謝標志物比較 3組β-CTX、PINP、CA、25-羥維生素D水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。3組PTH、BGP比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表3。

3.3 3組間腸道菌群比較

3.3.1 3組腸道菌群OTUs聚類比較 對所有樣本的有效數(shù)據(jù)以97%的一致性進行OTUs聚類，共得到477個OTUs。其中RA合并OP組470個OTUs，RA骨量減少組473個OTUs，健康對照組472個OTUs。對其進行Alpha多樣性分析，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。

3.3.2 3組腸道菌群構(gòu)成比較 健康對照組腸道菌群門水平上厚壁菌門（Firmicutes）/擬桿菌門（Bacteroidetes），即F/B顯著高于RA合并OP組與RA骨量減少組（P < 0.05）；而RA合并OP組與RA骨量減少組F/B差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。RA骨量減少組相較于RA合并OP組，疣微菌門偏多，而變形菌門偏少。見圖1。3組之間進行Wilcox秩和檢驗，P = 0.001，提示3組間菌群構(gòu)成上存在差異。PCoA分析能直觀表現(xiàn)出3組分別有不同的聚集傾向，表明3組腸道菌群結(jié)構(gòu)存在差異。見圖2。

3.3.3 3組生物標志物比較 LEfSe能夠在不同組間尋找具有統(tǒng)計學差異的生物標志物（Biomarker）。健康對照組生物標志物為p-Firmicutes、g-Megamonas（巨單胞菌）、g-Agathobacter，RA合并OP組為o-Enterobacteriales、f-Enterobacteriaccae，RA骨量減少組為s-Bacteroides-plebeius。默認LDA值篩選值為4，LDA值 ﹥4為差異有統(tǒng)計學意義。見圖3。

3.3.4 相關(guān)性分析 3組間BGP、CA、RF、抗CCP抗體、PTH、25-羥維生素D、PINP、β-CTX與腸道菌群進行Spearman相關(guān)性檢驗，得到相關(guān)性分析熱圖。見圖4。Megamonas、Agathobacter、Roseburia與RF存在負相關(guān)（P < 0.05）；Ruminococcaceae-UCG-002、uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae與RF呈正相關(guān)（P < 0.05），Agathobacter與抗CCP抗體呈負相關(guān)（P < 0.05），Ruminococcaceae-UCG-002與抗CCP抗體呈正相關(guān)（P < 0.05）；Ruminococcaceae-UCG-002、Parabacteroldes與β-CTX呈正相關(guān)（P < 0.05），Megamonas、Bifdobacterium、Ruminococcus-2與β-CTX呈負相關(guān)（P < 0.05），Escherchia-Shigella與PINP呈正相關(guān)（P < 0.05），Lachnoclostridium與PINP呈負相關(guān)（P < 0.05），Lachnospira與PTH呈負相關(guān)（P < 0.05），Escherchia-Shigella與25-羥維生素D呈負相關(guān)（P < 0.05），Agathobacter與25-羥維生素D呈正相關(guān)（P < 0.05），BGP、CA水平與腸道菌無明顯相關(guān)性（P ﹥ 0.05）。將該結(jié)果與LEfSe分析結(jié)果相結(jié)合，最終得出Megamonas可能與RF、β-CTX呈負相關(guān)；Agathobacter與RF、抗CCP抗體呈負相關(guān)（P < 0.05），而與25-羥維生素D呈正相關(guān)；大腸埃希菌與PINP呈正相關(guān)（P < 0.05），而與25-羥維生素D呈負相關(guān)（P < 0.05）。

4 討 論

RA合并OP的發(fā)生率約56.67%，明顯高于我國65歲以上人群的OP發(fā)生率（32.0%）［6］。RA存在破骨細胞的過度活化，在骨破壞中起到關(guān)鍵性作用。β-CTX是一種骨破壞產(chǎn)物，可作為骨破壞程度指標。本研究中RA患者血清β-CTX水平升高，說明RA患者存在較高骨破壞水平，且OP組高于非OP組。PINP為骨合成標志物，當PINP增加，提示骨合成代謝水平升高。本研究發(fā)現(xiàn)，RA合并OP組的PINP較健康對照組增加，提示可能與RA合并OP時破骨細胞活化使骨破壞增加，從而代償性增加骨合成，而RA不同骨代謝水平組間未見明顯差異，可能與骨合成水平代償性增加水平遠低于機體骨破壞作用水平相關(guān)。BGP由成骨細胞合成，血中BGP水平能反映成骨細胞的活性，可反映骨代謝及骨轉(zhuǎn)換水平，國外一項研究發(fā)現(xiàn)RA患者BGP升高［7］。在本研究中，組間血清BGP水平無明顯差異。CA可反映機體外周血中鈣水平，間接反映骨代謝情況。本研究發(fā)現(xiàn)，RA合并OP組CA較健康對照組顯著降低，可能與腸道內(nèi)鈣吸收減少及體內(nèi)鈣流失增加相關(guān)。25-羥維生素D為脂溶性維生素，羥化后形成1，25-二羥維生素D3，主要功能是促進小腸黏膜對鈣和磷的吸收，促進腎小管對鈣磷重吸收，同時促進新骨生成。本研究中RA患者25-羥維生素D顯著低于健康對照組，影響CA吸收及新骨形成。另外，PTH、BGP組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。

當自身免疫性疾病活動時，機體處于慢性炎癥狀態(tài)，體內(nèi)免疫細胞被激活，可產(chǎn)生大量破骨細胞因子［如核轉(zhuǎn)錄因子-κB受體活化因子配體（RANKL）、白細胞介素-1、白細胞介素-17、腫瘤壞死因子-α］，使骨質(zhì)破壞增加。一項小鼠實驗發(fā)現(xiàn)，慢性炎癥組小鼠破骨細胞能激活CD4+ T細胞產(chǎn)生炎性因子［8］。研究發(fā)現(xiàn)，RANKL水平與CRP水平呈正相關(guān)［7］。本研究檢測了CRP等炎性指標水平，發(fā)現(xiàn)RA患者炎性指標遠高于健康對照組，提示機體慢性炎癥狀態(tài)下激活機體免疫，從而影響骨代謝水平。

腸道內(nèi)部定植的所有共棲、共生及致病微生物被稱為腸道菌群。在出生時，人體內(nèi)腸道菌群幾乎完全來自于母體，后續(xù)隨著飲食、疾病、藥物等環(huán)境變化而變化［9］。腸道菌群會影響機體內(nèi)環(huán)境，并促進體內(nèi)維生素、蛋白質(zhì)、鈣等營養(yǎng)物質(zhì)合成，成為腸道的天然屏障［10］。當發(fā)生菌群失調(diào)時，腸道菌群失去原有的保護功能，腸道黏膜屏障破壞，不能有效阻止病原菌進入機體。致病菌侵襲機體后，細菌細胞壁的肽聚糖成分促進細胞因子的產(chǎn)生及釋放，而這可能是誘發(fā)RA發(fā)病的一個重要因素［11］。HAMILTON等［12］證明，改變腸道菌群失調(diào)可誘導腸道黏膜通透性增加，血清脂多糖（LPS）水平增加。而LPS增加使黏膜通透性進一步增加，最終導致腸道細菌毒素吸收入血，使機體處于慢性炎癥狀態(tài)或引起內(nèi)毒素血癥，誘發(fā)RA及骨代謝紊亂。從而證明，腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂一方面能誘發(fā)RA的發(fā)生；另一方面，通過菌群移位，細菌及其代謝產(chǎn)物入血，機體免疫處于激活狀態(tài)，產(chǎn)生炎性因子，使機體處于慢性炎癥狀態(tài)，從而使疾病進展。以原發(fā)性OP為研究對象，通過腸道菌16S rRNA擴增、測序、生物信息學分析一項研究發(fā)現(xiàn)，OP組相較于正常組，在菌群豐富度及菌群結(jié)構(gòu)上均存在差異，得出OP狀態(tài)下的腸道菌群多樣性較正常組明顯不同［13］。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群的存在及其多樣性與骨代謝密切相關(guān)［14］。進而提出“骨微生物學”這一概念，指微生物群在骨骼健康中的作用，以及微生物群調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育、骨骼老化和病理性骨丟失的機制［15］。關(guān)于腸道菌群通過何種機制影響RA及OP的發(fā)生、發(fā)展，目前仍處于探索階段。本實驗發(fā)現(xiàn)，腸道菌群結(jié)構(gòu)在RA與健康對照組間存在明顯差異；同時，RA骨代謝水平不同，腸道菌群結(jié)構(gòu)分布也存在明顯不同。提示腸道菌群可能與RA及骨代謝存在相關(guān)性。進行相關(guān)性分析得到相關(guān)性熱圖，發(fā)現(xiàn)β-CTX與腸道菌群存在相關(guān)性，且與RF、抗CCP抗體存在關(guān)系，提示RA患者腸道菌群改變可能參與骨代謝異常，增加骨破壞，從而導致OP。在對90例患者進行的橫斷面研究中，試驗者收集RA患者血清標本，通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測患者抗CCP抗體，并測定ESR、RF、DAS28評分等，對其進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)抗CCP抗體滴度與DAS28評分之間存在相關(guān)性［16］，

提示抗CCP抗體滴度的高低可反映體內(nèi)炎癥水平。本研究還發(fā)現(xiàn)，腸道菌群與RA相關(guān)抗體存在相關(guān)性，可能是菌群結(jié)構(gòu)改變影響抗體滴度，通過影響疾病活動度間接對骨代謝發(fā)揮作用。腸道菌群與RA相關(guān)性抗體、骨代謝標志物相關(guān)，尋找其相關(guān)差異菌可作為RA合并OP一個治療靶點，為今后RA合并OP行調(diào)節(jié)腸道菌群治療提供理論依據(jù)。

綜上所述，RA患者存在腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂，且骨代謝水平不同菌群構(gòu)成存在差異。腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂可能參與RA合并OP發(fā)病，目前關(guān)于腸道菌群誘發(fā)RA及OP的機制仍待進一步研究。另外，本研究所涉樣本量較少，且飲食習慣存在地域差別，需要多地域更大的樣本量進行證實研究。

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