邱明山　林雙杰　張少紅　李依寒　錢麗霞　李良成　陳進春

【摘 要】目的：觀察加減指迷茯苓方對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠關(guān)節(jié)病變及滑膜組織血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和血管內(nèi)皮生長因子受體（FLK-1）mRNA表達(dá)的影響，探討加減指迷茯苓方對CIA的作用及其機制。方法：選用SPF級Wistar大鼠32只，隨機選取8只作為空白對照組，其余24只采用尾根部及脊背部皮內(nèi)注射牛Ⅱ型膠原乳化劑，7 d后加強免疫。造模成功后，將CIA大鼠隨機分為模型對照組、雷公藤多苷組（7.81 mg·kg^-1灌胃）、加減指迷茯苓方組（31.68 g·kg^-1灌胃），每組8只?？瞻讓φ战M和模型對照組大鼠灌服等體積的生理鹽水。4組均連續(xù)灌胃30 d，每日1次。飼養(yǎng)期間測量大鼠體質(zhì)量、踝關(guān)節(jié)腫脹度，治療30 d后進行關(guān)節(jié)彩超評價，實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測關(guān)節(jié)滑膜VEGF、FLI-1 mRNA水平。結(jié)果：與模型對照組比較，雷公藤多苷組和加減指迷茯苓方組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分、彩超超聲表現(xiàn)分級（Szkudlarek）評分（關(guān)節(jié)積液、多普勒血流、滑膜增生、骨質(zhì)侵蝕4個方面），以及關(guān)節(jié)滑膜的VEGF、FLK-1 mRNA表達(dá)水平均明顯降低（P < 0.01或P < 0.05）。結(jié)論：加減指迷茯苓方可抑制CIA大鼠關(guān)節(jié)炎癥，抑制滑膜VEGF和FLK-1表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎；指迷茯苓方；血管內(nèi)皮生長因子；血管內(nèi)皮生長因子受體；大鼠

Effect of Modified Zhimi Fuling Formula（指迷茯苓方） on Arthropathy and Synovial VEGF/FLK-1 mRNA

Expression in Collagen induced Arthritis Rats

QIU Ming-shan，LIN Shuang-jie，ZHANG Shao-hong，LI Yi-han，QIAN Li-xia，LI Liang-cheng，CHEN Jin-chun

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of modified Zhimi Fuling Formula（指迷茯苓方）on

arthropathy and synovial VEGF/FLK-1mRNA expression in collagen induced arthritis rats（CIA rats），and to explore the effect and mechanism of the formula on CIA.Methods：Thirty-two SPF Wistar rats were selected.Eight rats were randomly selected as the blank control group，and the other twenty-four were injected with bovine typeⅡcollagen emulsifier intradermally at the tail root and back of the spine.After 7 days of intensive immunization，CIA rats were randomly divided into a model control group，a tripterygium wilfordii polyglycosides group（TWP group with 7.81 mg·kg^-1gavage），and a modified Zhimi Fuling Formula group（MZFF group with 31.68 g·kg^-1gavage），with eight rats in each.The rats in the blank control group and the model control group were perfused with the same volume of normal saline.All the four groups were given gastric perfusion for 30 days，once a day.The body mass and ankle swelling of rats were measured during the feeding period.After 30 days of treatment，the joints were evaluated by color ultrasound，and the level of VEGF/FLI-1 mRNA in synovium of joints was detected by real-time quantitative PCR.Results：Compared with the model control group，the arthritis index score，Color Doppler Ultrasound Szkudlarek score（joint effusion，Doppler blood flow，synovial hyperplasia，bone erosion），and the expression level of VEGF/FLK-1 mRNA in the synovium of the rats in the TWP group and the MZFF group were significantly reduced（P < 0.01 or P < 0.05）.Conclusion：Modified Zhimi Fuling Formula can inhibit joint inflammation and the expression of VEGF and FLK-1 in synovium of CIA rats.

【Keywords】 rheumatoid arthritis;collagen induced arthritis;Zhimi Fuling Formula（指迷茯苓方）;vascular endothelial growth factor;vascular endothelial growth factor receptor;rats

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是臨床上最常見的自身免疫性疾病，好發(fā)于中老年人，女性發(fā)病率較高［1］。RA基本病理表現(xiàn)為增生性滑膜炎、血管翳形成，并逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失［2］。而血管內(nèi)皮異常增生是RA滑膜炎和血管翳的基礎(chǔ)，血管增生受血管生成刺激因子及抑制因子的雙重調(diào)節(jié)，即血管生成平衡假說。當(dāng)血管生成刺激因子異常增高時，這種平衡被打破，出現(xiàn)病理性血管增生。RA血管病理性增生中最重要的促血管形成因子是血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF在RA患者滑膜組織及血漿中高表達(dá)，與疾病活動性相關(guān)并加重疾病發(fā)展［3］。血管內(nèi)皮生長因子受體（FLK-1）是VEGF在內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮作用最為重要的受體，在生理及病理性血管生成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［4］。

RA屬中醫(yī)學(xué)“痹病”中“頑痹（尪痹）”范疇，正氣不足、感受六淫邪氣而致營衛(wèi)氣血失調(diào)、痰濁瘀血內(nèi)生是痹病的基本病因病機［5］。以活血法、化痰活血法為主的中醫(yī)藥治療研究較多，但單純的化痰法在該領(lǐng)域研究較少。因此，筆者觀察以化痰法為依歸的加減指迷茯苓方對CIA大鼠關(guān)節(jié)及滑膜VEGF和FLK-1表達(dá)的影響，探討化痰法對RA的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用SPF級Wistar大鼠32只，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，購自廈門大學(xué)動物實驗中心。實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2012-0002。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 藥品與試劑 加減指迷茯苓方（膽南星16 g、茯苓8 g、生姜8 g、枳殼4 g、芒硝2 g）來自廈門市中醫(yī)院中藥房（購自康美藥業(yè)）。雷公藤多苷片（福建匯天生物藥業(yè)有限公司，批號20140901，規(guī)格10 mg）；牛Ⅱ型膠原（美國Chondrex公司，批號20021，4 ℃儲存）；完全弗氏佐劑（美國Sigma公司，F(xiàn)-5881）；FLK-1以及CD34抗體（博士德生物制品有限公司）；cDNA合成逆轉(zhuǎn)試劑盒（Thermo Fisher Scientific，K1622）；TransStart Top Green qPCR SuperMix（TransGen Biotech，K10225）；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色液（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）；水合氯醛、多聚甲醛（美國Sigma公司）；冰醋酸（西隴化工股份有限公司）。

1.3 模型制作及動物分組 無菌條件下，牛Ⅱ型膠原在0.01 mmol·L^-1冰醋酸中充分溶解，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 mg·mL^-1，放置4 ℃冰箱備用；再與等體積的弗氏完全佐劑充分混勻用玻璃注射器在冰上充分乳化，終末質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 mg·mL^-1，乳化時間約3 h；取一小滴懸濁液滴入燒杯水中，懸濁液未分散開來表示達(dá)到理想的乳化結(jié)果。32只SPF級Wistar大鼠，隨機選取8只作為空白對照組，其余24只造模。取0.2 mg牛Ⅱ型膠原乳化劑在大鼠尾根部及脊背部分一側(cè)前中后3點皮下注射，7 d后在尾根部及脊背部皮下內(nèi)注射0.1 mg牛Ⅱ型膠原乳化劑加強免疫1次。免疫14 d后，將造模大鼠隨機分為模型對照組、雷公藤多苷組（TG組）、指迷茯苓方組（FL組），每組8只。

1.4 造模成功判定標(biāo)準(zhǔn) 實驗大鼠造模過程中，每隔6 d進行雙后肢關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分（AI評分），在初次注射牛Ⅱ型膠原乳化劑的第12天開始出現(xiàn)部分大鼠單側(cè)或雙側(cè)踝關(guān)節(jié)紅腫，第14天所有大鼠出現(xiàn)雙側(cè)踝關(guān)節(jié)紅腫，根據(jù)AI評分進行模型成功評判。0級，無關(guān)節(jié)紅腫；Ⅰ級，小趾關(guān)節(jié)腫脹；Ⅱ級，趾關(guān)節(jié)及足趾關(guān)節(jié)腫脹；Ⅲ級，踝關(guān)節(jié)以下足爪腫脹；Ⅳ級，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。每只大鼠單肢評分最高4分，四肢累計得分為AI評分，最高16分，AI評分≥4分被認(rèn)定造模成功，AI評分 < 4分從實驗中剔除。

1.5 中藥煎煮及濃縮

1.5.1 中藥煎煮 煎煮時，取加減指迷茯苓方藥10劑劑量，放置于3000 mL水中浸泡30 min；先用武火煮沸，再改用文火，煎煮25 min之后倒出；第二煎加入2000 mL水，煎煮20 min倒出，與頭煎藥液混合成1000 mL備用。

1.5.2 中藥濃縮與稀釋 將上述1000 mL藥液放置于旋蒸儀，將水浴鍋溫度調(diào)控在60 ℃，轉(zhuǎn)速為7～8 r·min^-1，最后濃縮至90 mL；再用蒸餾水將藥液稀釋至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.69 g·mL^-1。

1.6 給藥方法 分組后開始灌胃給藥，每日1次，連續(xù)30 d。各組給藥劑量如下：TG組給予7.81 mg·kg^-1雷公藤多苷灌胃，F(xiàn)L組給予31.68 g·kg^-1加減指迷茯苓方灌胃，空白對照組和模型對照組給予等體積的生理鹽水灌胃。4組均連續(xù)灌胃30 d，每日1次。

1.7 樣本制備 大鼠稱重，腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%水合氯醛0.3 mL·（100 g）^-1腹腔麻醉，仰位固定，沿左側(cè)后腿膝關(guān)節(jié)正中縱行切開皮膚，直至暴露出以膝關(guān)節(jié)為中心約3 cm×3 cm的區(qū)域，沿髕骨上沿0.3～0.4 cm處向下切割直至髕骨，再分別沿髕骨兩側(cè)向下分離至脛骨。此時，即打開了膝關(guān)節(jié)腔，可見由髕骨下極向下延續(xù)有一層平滑光亮呈淺淡黃色的滑膜組織。用眼科直鑷鈍性分離關(guān)節(jié)囊的滑膜層和纖維層，完整剝離滑膜組織，最后以眼科鑷輕輕夾住其中央，用眼科剪完整剪下，置于液氮冷凍PCR備用。同時，將右后肢緣后肢正中縱行切開皮膚直至暴露膝關(guān)節(jié)，分離剝除肌肉，可見關(guān)節(jié)囊，在膝關(guān)節(jié)上、下緣各1 cm左右用眼科剪剪斷，放入20倍體積的體積分?jǐn)?shù)為10%的中性甲醛溶液固定10 d，再將關(guān)節(jié)置于10倍標(biāo)本體積的體積分?jǐn)?shù)為10% EDTA脫鈣液脫鈣30 d，2 d更換1次，最后進行脫水、包埋備用。

1.8 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.8.1 關(guān)節(jié)腫脹度 用自制的大鼠足容積測量儀（排水法）測量大鼠雙后肢踝關(guān)節(jié)以下容積，每隔6 d測量1次。

1.8.2 AI評分 根據(jù)AI評分標(biāo)準(zhǔn)，每隔6 d判斷1次雙后肢關(guān)節(jié)腫脹程度。

1.8.3 血管翳形成及關(guān)節(jié)滑膜厚度 將實驗大鼠用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%水合氯醛按0.3 mL·（100 g）^-1腹腔注射麻醉；使用剃毛器去除左下肢左側(cè)腹部絨毛，將大鼠仰臥位于平板，助手根據(jù)彩超醫(yī)師要求固定體位。在實驗大鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié)表面涂耦合劑，使用頻率為18 MHz的探頭進行縱橫切面觀察，以能夠完整清晰顯示關(guān)節(jié)腔，顯示滑膜變化的切面作為最終評估的切面。以此切面對關(guān)節(jié)血管翳、滑膜厚度進行仔細(xì)觀察，對相關(guān)數(shù)據(jù)進行測量并儲存成像圖。檢查結(jié)束后，由彩超醫(yī)生對圖像進行判讀。利用彩超Szkudlarek評分［6］評價治療后（造模42 d）各組大鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)積液、多普勒血流及滑膜增生、骨質(zhì)侵蝕分級。

1.8.4 實時定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測滑膜組織中VEGF和FLK-1的mRNA表達(dá)

1.8.4.1 mRNA提取 剝離大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織每只15 mg左右，加入總RNA抽提試劑（Trizol），放入組織研磨儀研磨；然后，三氯甲烷、苯酚、異丙醇沉淀法抽提總RNA，干燥，溶于12 μL DEPC 水中；待RNA溶解后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8.4.2 cDNA合成 采用cDNA逆轉(zhuǎn)試劑盒，并按其說明書進行。

1.8.4.3 qPCR反應(yīng) 采用TransStart Top Green qPCR SuperMix并按其說明書進行，所用引物見表1。反應(yīng)條件：95 ℃，預(yù)變性30 s，然后進入95 ℃，變性5 s，60 ℃，延伸30 s，進行45個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，65 ℃延伸30 s，降至4 ℃。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布以表示，采用單因素方差分析及t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況觀察 造模12 d后，與空白對照組比較，模型對照組、TG組及FL組大鼠體質(zhì)量增長緩慢，之后均有所下降；造模第42天后，與模型對照組和TG組比較，F(xiàn)L組大鼠體質(zhì)量明顯升高，見表2。CIA大鼠踝關(guān)節(jié)和趾關(guān)節(jié)病變明顯，呈對稱性，且后肢最先發(fā)病。24只大鼠總發(fā)病率為100 %。

造模后第12天可見，部分大鼠關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫、瘀斑及輕度腫脹；第14天雙側(cè)踝趾關(guān)節(jié)紅腫逐漸加重，部分關(guān)節(jié)表面皮膚發(fā)亮充血。之后，模型對照組關(guān)節(jié)癥狀繼續(xù)加重、行動受限，F(xiàn)L組與TG組關(guān)節(jié)紅腫未見加重。治療20 d后FL組與TG組部分大鼠關(guān)節(jié)紅腫逐漸減輕，而模型對照組關(guān)節(jié)紅腫繼續(xù)加重。造模第42天，模型對照組部分大鼠可見負(fù)重困難、關(guān)節(jié)活動障礙，F(xiàn)L組與TG組癥狀減輕。

2.2 各組大鼠治療前后AI評分比較 治療前（造模第12天），模型對照組、TG組、FL組大鼠AI評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；3組與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。治療后（造模第42天），與模型對照組比較，TG組和FL組大鼠AI評分明顯降低（P < 0.05或P < 0.01）。見表3。

2.3 各組大鼠關(guān)節(jié)彩超Szkudlarek評分比較 治療后（造模第42天），TG組和FL組組大鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)積液、多普勒血流及滑膜增生、骨質(zhì)侵蝕分級與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義

（P < 0.01）。見表4。

2.4 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中VEGF、FLK-1 mRNA表達(dá)水平比較 以GAPDH為內(nèi)參，利用實時定量RT-PCR分別檢測各組大鼠滑膜組織中VEGF mRNA和FLK-1 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型對照組表達(dá)水平顯著升高（P < 0.01）；與模型對照組比較，F(xiàn)L組、TG組均顯著降低（P < 0.01）；與TG組比較，F(xiàn)L組的VEGF mRNA水平較高（P < 0.01），而FLK-1 mRNA水平顯著降低（P < 0.01）。見表5。

3 討 論

指迷茯苓丸又稱茯苓丸，出自宋·王貺《全生

指迷方》，原方由姜制半夏二兩、茯苓一兩、枳殼五錢、風(fēng)化硝二錢半及姜汁組成。原書謂：前藥共為細(xì)末，姜汁糊丸，如梧桐子大，每服30丸，食后姜湯送下。清·程國彭在《醫(yī)學(xué)心悟》中說：“肩背痛，古人主以茯苓丸，謂痰飲為患也，痰飲隨風(fēng)走入經(jīng)絡(luò)而肩背腫痛，治無不效?！敝x觀在《中國醫(yī)學(xué)大辭典》茯苓丸條目第2項中，詳細(xì)敘述了其功用、藥物組成、制法、用法等，指出：“治中脘留伏痰飲，脾氣虛弱，痰邪相搏以致手臂牽掣，或戰(zhàn)掉不能舉物，筋脈攣急而痛，或四肢不能移轉(zhuǎn)?！惫P者所用加減茯苓方組方為膽南星、茯苓、枳殼、風(fēng)化硝、生姜（質(zhì)量比為8∶4∶2∶1∶4），水煎服。因天南星“治痰功同半夏”，然半夏雖屬辛散，但專理脾胃濕痰，而天南星辛散之力勝過半夏，專主經(jīng)絡(luò)風(fēng)痰。膽南星為天南星經(jīng)過牛膽汁制，燥性已減，性味苦涼，兼清痰熱，對于痰濁久滯郁而化熱更為妥當(dāng)，為君藥。茯苓味淡性平，“祛邪而不傷正，補而不助邪”，有化痰滲濕、健脾寧心之效，助膽南星化痰；枳殼味苦辛酸性微寒，具有宣化氣機、行氣化痰之功，與茯苓共為臣藥。生姜味辛性溫，具有解表散寒、溫中止嘔、化痰止咳、行水解毒之效，可佐助膽南星化痰濁，又制膽南星、芒硝之毒，而為佐藥。芒硝味辛苦咸性寒，有瀉下、清熱、潤燥、軟堅的作用，可引痰濁之邪從大便排出，又引經(jīng)報使，而為使藥。5味藥聯(lián)用，祛邪而不傷正，共奏化痰泄?jié)嶂Α?/p>

本研究中，筆者以雷公藤多苷［7］為陽性對照組，利用動物整體形態(tài)變化、受累關(guān)節(jié)彩超、關(guān)節(jié)滑膜分子生物學(xué)手段，觀察了加減指迷茯苓方對CIA大鼠的治療作用。結(jié)果顯示，加減指迷茯苓方和雷公藤多苷均可使大鼠關(guān)節(jié)炎癥顯著下降，同時可使滑膜組織中VEGF mRNA、FLK-1 mRNA 水平顯著降低。表明加減指迷茯苓方可通過抑制滑膜組織中VEGF及其受體的表達(dá)，抑制滑膜增生、延緩骨質(zhì)侵蝕，進而使得CIA大鼠AI指數(shù)降低，有效控制CIA大鼠關(guān)節(jié)炎癥。本實驗也說明中醫(yī)化痰法對RA具有較好的治療前景。

（致謝：廈門市中醫(yī)院B超功能科劉曄醫(yī)師協(xié)助完成關(guān)節(jié)彩超評價。）

參考文獻

［1］ JIN S，LI M，F(xiàn)ANG Y，et al.Chinese Registry of rheumatoid arthritis（CREDIT）：Ⅱ.prevalence and risk factors of major comorbidities in Chinese patients with rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Res Ther，2017，19（1）：251-258.

［2］ BURMESTER GR，POPE JE.Novel treatment strategies in rheumatoid arthritis［J］.Lancet，2017，389（10086）：2338-2348.

［3］ WU S，LI Y，LI Y，et al.Interleukin-35 attenuates collagen-induced arthritis through suppression of vascular endothelial growth factor and its receptors［J］．Int Immunopharm，2016，34（1）：71-77.

［4］ KENDREW J，EBERLEIN C，HEDBERG B，et al.An antibody targeted to VEGFR-2 Ig domains 4-7 inhibits VEGFR-2 activation and VEGFR-2-dependent angiogenesis without affecting ligand binding［J］.Mol Cancer Ther，2011，10（5）：770-783.

［5］ 王承德，沈丕安，胡蔭奇.實用中醫(yī)風(fēng)濕病學(xué)［M］.2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2015：16-21.

［6］ 中國醫(yī)師協(xié)會超聲醫(yī)師分會.中國肌骨超聲檢查指南［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2017：164-167.

［7］ 韓曼麗，章金春.雷公藤多苷對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠組織中血管內(nèi)皮生長因子及血管內(nèi)皮生長因子受體2 mRNA表達(dá)水平的影響［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2013，26（5）：478-480.