楊少瀅，肖 成，劉 宇，吳 健，3，趙玉民，3，曹 陽*

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 公主嶺 136100；2.延邊大學(xué)，吉林 延吉 133002；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部肉牛遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130000）

隨著我國(guó)居民生活水平的提高，市場(chǎng)對(duì)牛肉的需求量逐漸增加，高品質(zhì)牛肉的需求更是無法得到滿足。目前我國(guó)肉牛養(yǎng)殖業(yè)所提供的肉產(chǎn)品無法滿足國(guó)內(nèi)市場(chǎng)需求，而且本土肉牛品種的產(chǎn)肉性能及肉質(zhì)不如國(guó)外優(yōu)秀的肉牛品種，這導(dǎo)致我國(guó)需要從國(guó)外進(jìn)口大量牛肉來彌補(bǔ)市場(chǎng)所需。為了解決這一棘手問題，科研工作者引進(jìn)國(guó)外優(yōu)質(zhì)品種牛與本土品種雜交，通過分子育種和常規(guī)育種方法培育出具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新品種。目前我國(guó)自主培育的肉牛品種很多，如沃金黑牛、草原紅牛、延邊黃牛等，這些新品種的產(chǎn)肉性能及肉質(zhì)性狀均有顯著提升，但與國(guó)外優(yōu)良品種仍有差距［1］。同時(shí)，國(guó)內(nèi)培育的不同品種間生產(chǎn)性能和肉質(zhì)性狀也存在差異。因此，了解及探索調(diào)控肉牛經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)鍵基因?qū)τ谔岣咂溥x育強(qiáng)度至關(guān)重要。

胰島素樣生長(zhǎng)因子1（Insulin-like growth factor-I，IGF1）可以通過與生長(zhǎng)激素結(jié)合而對(duì)家畜機(jī)體生長(zhǎng)進(jìn)行調(diào)控［1］；還可以影響肌肉、骨骼及脂肪的代謝合成，對(duì)生命體至關(guān)重要［2］。脂肪酸結(jié)合蛋白HFABP在肌肉中表達(dá)，對(duì)家畜生長(zhǎng)具有重要作用［3］。生長(zhǎng)激素（growth hormone，GH）是大腦垂體前葉分泌的一種多肽類激素，對(duì)于動(dòng)物機(jī)體必不可少，能夠調(diào)控其生長(zhǎng)發(fā)育。生長(zhǎng)激素受體（growth hormone reporter，GHR）是與生長(zhǎng)激素結(jié)合而發(fā)揮作用的［4］。生肌調(diào)節(jié)因子5（myogenic factor 5，Myf5）參與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育，是調(diào)節(jié)肌肉合成、影響肉質(zhì)的重要基因［5］。Leptin又稱瘦素，中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)能量代謝進(jìn)程中的重要能量調(diào)節(jié)因子，參與脂肪沉積的調(diào)節(jié)［6］。肌細(xì)胞生成素（myogenin，MyoG）是與產(chǎn)肉性狀相關(guān)的重要候選基因，與家畜體重、胴體重具有顯著相關(guān)性［7］。肌肉生長(zhǎng)抑制素（myostatin，MSTN）主要在骨骼肌中表達(dá)，參與調(diào)控骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育［8］。脂蛋白分解酶（lipoprotein lipase，LPL）、長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A 合 成 酶1（long-chain fatty acyl-CoA 1，ACSL1）、過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferative activated receptor gamma，PPARγ）等基因主要在脂肪組織中表達(dá)，并且是脂肪細(xì)胞形成與分化的標(biāo)志基因［9-11］。

本試驗(yàn)希望通過比較不同品種牛間生長(zhǎng)及肉質(zhì)相關(guān)基因找到重要的分子表達(dá)機(jī)制，以提高分子育種強(qiáng)度、提升經(jīng)濟(jì)性狀。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品的采集

草原紅牛、沃金黑牛飼養(yǎng)及飼喂條件相同，均按照國(guó)家肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（NY／T 815—2004）飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)室前期已對(duì)草原紅牛群體和沃金黑牛群體的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)、肉質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比。測(cè)量的數(shù)據(jù)有體重、體高、十字部高、體斜長(zhǎng)、胸圍、腹圍、管圍、眼肌面積、背膘厚、肉色、嫩度、加壓失水率、離心失水率、滴水損失、蒸煮損失、熟肉率等。沃金黑牛在生長(zhǎng)及肉質(zhì)性狀上優(yōu)于草原紅牛，此數(shù)據(jù)部分正在投稿中，部分已經(jīng)發(fā)表［12］。因此，從吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所的草原紅牛群體里隨機(jī)選擇18月齡健康雄性草原紅牛3頭，從長(zhǎng)春市皓月集團(tuán)的沃金黑牛群體里隨機(jī)選擇18月齡健康雄性沃金黑牛3頭，檢測(cè)不同品種牛各組織中可能出現(xiàn)的差異基因。試驗(yàn)動(dòng)物在同一屠宰廠屠宰并采集其肝臟組織、皮下組織、背最長(zhǎng)肌組織保存于液氮，用于提取RNA。

1.2 試驗(yàn)試劑及用品

TRIzol試劑，購(gòu)自賽默飛生物有限公司；異丙醇、氯仿，購(gòu)自北京化工有限公司；雙蒸水，購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自TAKARA生物公司；實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x器、試劑及配套的96孔板，均購(gòu)自Roche生物有限公司；引物，金唯智生物有限公司提供。

1.3 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

將凍存在液氮中的組織樣品取黃豆粒大小進(jìn)行液氮研磨，然后將研磨后的粉末轉(zhuǎn)移到EP管中，加入1 mL TRIzol試劑，按照經(jīng)典的RNA提取步驟進(jìn)行試驗(yàn)。提取好的RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行完整性驗(yàn)證，隨后利用超微量分光光度計(jì)進(jìn)行RNA純度、濃度的檢測(cè)。分光光度計(jì)顯示的OD260／OD280值在1.8～2.1之間表示純度較好。為了避免RNA降解，樣品于-80℃超低溫冰箱保存。總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)，反應(yīng)體系：Mix 2μL，RNA 500 ng，ddH2O補(bǔ)到10μL；反應(yīng)程序：37℃預(yù)變性15 min，85℃變性5 s，12℃保存。反轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)物加入90μL ddH2O后配成工作液，可直接用于定量試驗(yàn)或于-20℃冰箱保存。

1.4 引物設(shè)計(jì)及驗(yàn)證

以NCBI網(wǎng)站的牛IGF1、H-FABP、GH、GHR、Myf5、MyoG、MSTN、LPL、ACSL1、PPARγ、GAPDH基因組為參考，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)定量引物，引物信息見表1。以上述試驗(yàn)提取的cDNA為模板進(jìn)行引物特異性驗(yàn)證。PCR反應(yīng)體系：2×Taq Master Mix 10 μL，ddH2O 8 μL，上 下 游 引 物 各0.5μL，cDNA 1μL，總計(jì)為20μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min，產(chǎn)物于12℃保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 定量引物序列Tab.1 Sequence of quantitative primers

1.5 定量試驗(yàn)

以沃金黑牛、草原紅牛的肝臟、皮下脂肪、肌肉組織cDNA為樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)。檢測(cè)基因?yàn)镮GF1、H-FABP、GH、GHR、Myf5、MyoG、MSTN、LPL、ACSL1、PPARγ，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因進(jìn)行比較。qPCR體系（20μL）：Light Cycler 480 SYBR GreenⅠMaster（2×）10μL，ddH2O 8μL，cDNA 1μL，上下游引物各0.5μL。反應(yīng)程序：95℃5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)；95℃5 s，65℃1 min，40℃10 s，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。采用Roche Lightcycler 480軟件收集測(cè)定數(shù)據(jù)。

1.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。相同組織不同基因間表達(dá)差異采用t檢驗(yàn)方法進(jìn)行比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性驗(yàn)證

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，PCR產(chǎn)物條帶單一，可用于接下來的試驗(yàn)。

圖1 各基因PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 PCR products of each gene

2.2 沃金黑牛、草原紅牛生長(zhǎng)性狀相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量對(duì)比

IGF1、H-FABP、GH、GHR、Myf5、MSTN基因主要在肝臟及肌肉中表達(dá)，顯著影響牛的生長(zhǎng)性狀，如體重、體高、十字部高、體斜長(zhǎng)、胸圍、腹圍、管圍，對(duì)上述基因在肝臟及肌肉中進(jìn)行定量試驗(yàn)，結(jié)果見圖2。由圖2可以看出：沃金黑牛肝臟及肌肉中IGF1、H-FABP基因表達(dá)量均顯著高于草原紅牛（P＜0.05）；GH、GHR基因表達(dá)量在草原紅牛肝臟中較高，而沃金黑牛則是肌肉中較高（P＜0.05）；兩品種牛肝臟中沒有檢測(cè)到Myf5和MSTN基因，這兩種基因在沃金黑牛肌肉中的表達(dá)量顯著高于草原紅牛（P＜0.05）。

圖2 沃金黑牛、草原紅牛肝臟、肌肉組織中生長(zhǎng)性狀相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression levels of genes related to growth traits in liver and muscle tissues of Woking Black cattle and Steppes Red cattle

2.3 沃金黑牛、草原紅牛肉質(zhì)性狀相關(guān)基因?qū)Ρ?/h3>

IGF1、PPARγ、LPL、ACSL1基因主要在肝臟及脂肪中表達(dá)，顯著影響牛的肉質(zhì)性狀，如眼肌面積、背膘厚、嫩度、熟肉率等，對(duì)上述基因在肝臟及脂肪中進(jìn)行定量試驗(yàn)，結(jié)果見圖3。由圖3可以看出：IGF1基因表達(dá)量在沃金黑牛和草原紅牛脂肪組織中無顯著差異（P＞0.05），而沃金黑牛肝臟中IGF1基因表達(dá)量顯著高于草原紅牛（P＜0.05）；PPARγ和LPL基因表達(dá)量在草原紅牛肝臟中較高，而在沃金黑牛脂肪組織中較高（P＜0.05）；ACSL1基因在兩品種牛的肝臟組織中沒有檢測(cè)出來，脂肪組織中沃金黑牛組織顯著高于草原紅牛（P＜0.05）。

圖3 沃金黑牛、草原紅牛肝臟、脂肪組織中肉質(zhì)性狀相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expression levels of genes related to meat quality traits in liver and adipose tissue of Woking Black cattle and Steppe Red cattle

3 討論

沃金黑牛和草原紅牛都是我國(guó)近年來培育出的新品種，抗逆性強(qiáng)，耐粗飼，具有較好的生長(zhǎng)性能及肉質(zhì)性狀。沃金黑牛是由黑毛牛為父本、延邊牛為母本培育而成，而草原紅牛是短角牛與蒙古牛雜交選育而成［13-14］。由于科研人員所處的時(shí)代背景及培育目的不同，導(dǎo)致沃金黑牛偏向肉用，而草原紅牛更偏向于乳肉兼用。在相同月齡的兩個(gè)品種牛中，沃金黑牛體型明顯大于草原紅牛。屠宰過程中，沃金黑牛的背最長(zhǎng)肌橫截面出現(xiàn)的大理石花紋顯著高于草原紅牛。品種導(dǎo)致這些性狀出現(xiàn)明顯差異，但從分子層面來說，可能是調(diào)控基因的表達(dá)不同導(dǎo)致性狀出現(xiàn)了差別。本試驗(yàn)中，IGF1、H-FABP基因具有相同的表達(dá)規(guī)律，不管在肝臟還是肌肉組織中，沃金黑牛的表達(dá)量均最高。與之相反的是，GH、GHR、PPARγ和LPL基因在草原紅牛肝臟組織中的表達(dá)量均高于沃金黑牛，而在肌肉以及脂肪組織中沃金黑牛的表達(dá)量更高。在肝臟組織中這些基因的作用不單單具有調(diào)節(jié)生長(zhǎng)及肉質(zhì)性狀的功能，更多是能夠行使其他生理作用［4］。而這些基因在能夠發(fā)揮實(shí)際作用的組織中呈現(xiàn)出相反的表達(dá)，與實(shí)際測(cè)量的生產(chǎn)數(shù)據(jù)吻合。Myf5、MSTN、ACSL1基因也出現(xiàn)相似的結(jié)果。在發(fā)揮作用的組織中，沃金黑牛表達(dá)量更高。有趣的是，上述基因沒有在肝臟組織中檢測(cè)出來，可能是因?yàn)楸磉_(dá)量較低?；蛟趧?dòng)物發(fā)育的不同時(shí)間段其表達(dá)量可能存在較大差異。如果將試驗(yàn)樣本擴(kuò)大到6，12，24月齡可能會(huì)有更全面的表達(dá)譜，這將是課題組以后要探索的方向。