張芙蕊,陳璟恒,郭夢雅,張愛馨,李和平
(東北林業(yè)大學(xué) 野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院,哈爾濱 150040)
動(dòng)物的消化道和口腔中棲居著大量微生物,它們參與飼料的分解和轉(zhuǎn)化[1]??谇晃⑸锇?xì)菌、真菌、古細(xì)菌和病毒等全部微生物總和,具有復(fù)雜的微生物群落[2]。動(dòng)物口腔微生物多樣性的研究相對腸道較少。不同動(dòng)物口腔中穩(wěn)定的優(yōu)勢菌群不同,如倉鼠(Cricetidae)頰囊以德克斯氏菌屬(Derxia)為優(yōu)勢菌群[3],短尾猴(Macacathibetana)口腔中優(yōu)勢菌群主要為鏈球菌屬(Streptococcus)和奈瑟氏菌屬(Neisseria)[4],犬類(Canis lupus)口腔中卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)為主要菌群[5]。口腔微生物系統(tǒng)是動(dòng)物整體微生物系統(tǒng)的組成部分,其中含有致病菌群,可通過協(xié)同、頡頏和毒力因子中和作用等方式達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡或引發(fā)特定疾病,口腔微生物菌群間相互作用的穩(wěn)定機(jī)制對維持動(dòng)物機(jī)體健康起到至關(guān)重要的作用[6]。保守區(qū)域和高可變區(qū)域,因此16SrRNA分子是研究微生物群落最佳靶分子,可通過16S rRNA保守區(qū)序列設(shè)計(jì)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,利用可變區(qū)序列進(jìn)行細(xì)菌種屬鑒定分類[7]。目前,16S rRNA基因測序技術(shù)在微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[8],是目前研究腸道和口腔菌群的重要方法之一,該方法可以直接和全面地分析細(xì)菌的基因序列,對菌種進(jìn)行精確定量鑒定,是現(xiàn)階段研究微生物菌種豐度的主要方法之一[9-10]。
在家兔(Oryctolagus cuniculus)口腔中,細(xì)菌菌落棲居情況尚不清楚。因此,為了探究其口腔細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),本試驗(yàn)利用16S rRNA測序技術(shù),通過分析家兔口腔微生物菌種及豐度,確定家兔口腔內(nèi)細(xì)菌種類和優(yōu)勢種群,旨在為家兔的口腔微生物生理作用提供基礎(chǔ)的科學(xué)參考。
16S rRNA是原核和真核生物共有序列,具有高
體重3~4 kg的3只成年雄性家兔,2017年11月份購自哈爾濱市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖基地。
兔子固定器、OC-100 DNA樣本采集袋(含口腔拭子,購自BIORISE公司)、唾液DNA收集器、5 mL注射器、SAL 2 000 L唾液樣本采集管、Qubit dsDNA BR分析試劑盒、手術(shù)刀、液氮及液氮罐、棉花、蛋白酶K、十二烷基磺酸鈉(SDS)、75%乙醇、氯仿、異丙醇、TE緩沖液、TENS緩沖液,以上儀器和用品等來源于東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院營養(yǎng)學(xué)實(shí)驗(yàn)室和華大基因有限公司實(shí)驗(yàn)室。
1.3.1 口腔液體樣本的提取 使用兔子固定器將家兔固定,為其注射1 mL乙酰膽堿。10 min后使用注射器對兔耳緣靜脈注射空氣處死。處死后解剖家兔口腔,用OC-100DNA樣本采集袋(含口腔拭子)插入家兔口腔,并進(jìn)行擦拭,待口腔拭子沾滿口腔內(nèi)液時(shí)迅速將口腔拭子插入裝有1 mL唾液保存液的唾液DNA收集器中。
將被家兔口腔內(nèi)液體浸濕的口腔拭子插入SAL 2 000 L唾液樣本采集管中,讓拭子充分浸入唾液保存液中,之后立刻放入液氮罐中速凍,并送往生物公司進(jìn)行16S rRNA測序。
1.3.2 總DNA的提取以及定量混合 與D.Quinque等[11]提取DNA的方法相類似,采用改進(jìn)的方法提取口腔微生物樣本總DNA。將口腔拭子置于TENS緩沖液中,加入20 mg/mL蛋白酶K和10%SDS;將樣本放入水浴鍋中53℃水浴過夜保存;使用氯仿除去蛋白質(zhì);使用異丙醇沉淀提取DNA;在75%乙醇中洗滌后,將提取的DNA置于TE緩沖液中。用Qubit dsDNA BR分析試劑盒與Qubit熒光計(jì)對提取的DNA進(jìn)行定量混合。
1.3.3 細(xì)菌V3~V4區(qū)擴(kuò)增及文庫構(gòu)建 用提取的總DNA作為模板,以341F(5′-ACTCCTAGGGGGAGGCAG-3′)和806R(5′-GGACATCHVGGGTWTTCTAAT-3′)為引物,對細(xì)菌的16S rRNA V3~V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用Agencourt AMPure XP磁珠對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化,在洗脫緩沖液中洗脫并溶于Elution Buffer,完成建庫。使用Agilent 2 100 Bioanalyzer對文庫的片段范圍及濃度進(jìn)行檢測。合格文庫通過Illumina Miseq平臺進(jìn)行2×300 bp的雙端測序。
1.3.4 生物信息學(xué)分析 1)OTU統(tǒng)計(jì)。使用FLASH(v1.2.11)軟件[12]對序列進(jìn)行篩選拼接。使用UPARSE(v7.0.1090)軟件[13]將相似度大于97%的序列聚類成OTUs并使用UCHIME(v4.2.40)[14]將嵌合體序列與Gold基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較檢測。使用核糖體數(shù)據(jù)庫項(xiàng)目分類器對OTU序列進(jìn)行分類注釋,將最小置信閾值設(shè)置為0.6并由 QIIME(v1.8.0)[15]在Greengenes數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行檢測。在97%相似度下將樣品聚類為用于物種分類的OTU(operational taxonomic units),即可操作分類單元,統(tǒng)計(jì)樣品在每個(gè)OTU中的豐度信息,OTU的豐度初步說明了樣品的物種豐富程度。
2)繪制OTU Rank曲線。使用USEARCH global[16]將所有Tags與OTU進(jìn)行比較,以獲得樣本的OTU豐度統(tǒng)計(jì)表。計(jì)算每個(gè)OTU在樣品中的相對豐度,由高至低按豐度進(jìn)行排列,使用R(v3.1.1)軟件,以O(shè)TU的等級作為橫坐標(biāo)、以O(shè)TU的相對豐度作為縱坐標(biāo)繪制OTU Rank曲線,
3)構(gòu)建Shannon-Wiener曲線。利用樣品的測序量在不同測序深度時(shí)的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建香農(nóng)指數(shù)曲線(Shannon-Wiener),當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)說明測序數(shù)據(jù)量足夠大,可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物信息[17]。
4)物種多樣性分析。基于OTU和物種注釋結(jié)果進(jìn)行樣品物種復(fù)雜度分析,Alpha多樣性使用MOTHUR(v1.31.2)軟件[18]進(jìn)行估算。根據(jù)OTU劃分結(jié)果將樣品分為門(phylum)、綱(class)、目(order)、科(family)、屬(genus)、種(species)六個(gè)分類水平。
2.1.1 OTU統(tǒng)計(jì) 家兔樣品中能和OTU代表序列相對應(yīng),并且具有注釋結(jié)果的序列總數(shù)為57 904個(gè),共產(chǎn)生264個(gè)OTU。
2.1.2 OTU Rank曲線 OTU Rank曲線從物種豐富程度和物種均勻程度兩個(gè)方面反映了家兔口腔微生物多樣性,可以為兔口腔微生物研究提供依據(jù)。家兔口腔菌群OTU豐度等級曲線見圖1。
圖1 家兔口腔菌群OTU豐度等級曲線Fig.1 Curve of OTU rank cluster of rabbit’s oral bateria
2.1.3 Shannon-Wiener曲線 Shannon-Wiener曲線中OTU數(shù)量在500左右時(shí)曲線已經(jīng)趨于平緩,說明該測序深度下的測序結(jié)果已足夠反映當(dāng)前樣本所包含的微生物多樣性。家兔口腔菌群Shannon-Wiener曲線見圖2。
圖2 家兔口腔菌群Shannon-Wiener曲線Fig.2 The Shannon-Wiener index rarefaction plot of rabbit’s oral bacteria
家兔口腔內(nèi)細(xì)菌優(yōu)勢種類及其豐度優(yōu)勢種群見表1。其中變形菌門(Proteobacteria)占所鑒定菌群的74.18%,是最具優(yōu)勢的菌門。綱水平上,γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria)在所鑒定菌群中占比超過三分之二,為最優(yōu)勢綱。目水平上,巴斯德氏菌目(Pasteurellales)占比為38.34%,為高頻菌目,其他菌目比例較低。科水平上,巴斯德氏菌科(Pasteurellacece)占比38.38%,為高頻菌科。屬水平上,放線桿菌屬(Acti-nobacillus)、金氏菌屬(Kingella)、里氏桿菌屬(Riemerella)、莫拉克斯氏菌屬(Moraxella)是現(xiàn)已知分類的最具優(yōu)勢菌屬。家兔口腔優(yōu)勢菌種有莢膜放線桿菌(Actinobacillus capsulatus)、小韋榮氏球菌(Veillonella parvula)和脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis),其他菌種比例較低,莢膜放線桿菌最多,占比為36.86%。口腔微菌屬系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖3。
圖3 家兔口腔菌屬系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Genus species phylogeny tree of rabbit’s oral bateria
表1 家兔口腔內(nèi)細(xì)菌優(yōu)勢種類及其豐度Tab.1 The sorts and abundances of rabbit's oral bacteria
本試驗(yàn)采用二代測序技術(shù),以細(xì)菌16S rRNA的V3~V4可變區(qū)為模板構(gòu)建文庫,使用Illumina Hiseq測序系統(tǒng),運(yùn)用可逆鏈終止物和合成測序法進(jìn)行測序。測序公司未保留瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量試驗(yàn)結(jié)果、文庫質(zhì)檢結(jié)果,因此結(jié)果中未列出。與一代測序相比,二代測序技術(shù)讀取的堿基長度比一代測序短,但二代測序技術(shù)具有高通量、低成本和低錯(cuò)誤率等優(yōu)點(diǎn)[19]。16S rRNA測序法鑒定細(xì)菌種類克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法中的鑒定菌種特定性強(qiáng)、培養(yǎng)耗時(shí)長和鑒定率不穩(wěn)定等局限性[20]。因此,現(xiàn)階段二代測序技術(shù)廣泛應(yīng)用于實(shí)際研究中,能夠全面準(zhǔn)確地反映口腔菌群的結(jié)構(gòu)和豐度。
本試驗(yàn)中,分析了微生物物種豐富度及優(yōu)勢菌種,結(jié)果顯示家兔口腔微生物Simpson index和Shannon-Weiner index平均值分別為0.18和2.54,共檢測出57 904條合格序列,產(chǎn)生264個(gè)OUT。說明家兔口腔具有較高的微生物物種多樣性水平。因此,研究運(yùn)用16S rRNA測序法了解家兔口腔微生物多樣性具有精準(zhǔn)性和可靠性,能夠?yàn)榧彝每谇晃⑸锶郝浣M成和適應(yīng)性研究提供基礎(chǔ)的參考資料。研究表明,犬類口腔微生物中Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)平均數(shù)分別為0.08和3.40[5];短尾猴口腔微生物中Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)平均數(shù)分別為0.09和3.61[4]。因此,兔口腔微生物的豐富度低于犬類和靈長類,可能是由于草食動(dòng)物飼料單一導(dǎo)致微生物菌群豐富度比雜食動(dòng)物低。
家兔盲腸微生物種群在屬水平上主要組成為瘤胃球菌屬(Ruminococcus)5.070%、布勞特氏菌屬(Blautia)2.532%、擬桿菌屬(Bacteroides)2.436%和顫螺旋菌屬(Oscillospira)2.345%[21]。本試驗(yàn)檢測出屬水平上家兔口腔微生物與盲腸微生物共同菌屬為擬桿菌屬和瘤胃球菌屬,在家兔口腔中豐度分別為1.09%和0.80%。家兔屬于單胃草食動(dòng)物,主要食物為植物性飼料,具有營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)消化吸收的食糞特性[22]。因此,可能是食糞特性導(dǎo)致家兔部分腸道微生物在口腔中存留,使家兔口腔含有部分與盲腸相同的微生物種群。
菌群的組成和結(jié)構(gòu)與宿主息息相關(guān)。家兔口腔檢測出種水平上的優(yōu)勢菌群有莢膜放線桿菌、脆弱擬桿菌和小韋榮氏球菌。脆弱擬桿菌是定殖于哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)的共生菌,與炎癥性腸炎和結(jié)(直)腸癌形成密切相關(guān)[23],并且可間接促進(jìn)多糖代謝[24],脆弱擬桿菌對于維持家兔正常機(jī)能必不可少。小韋榮氏球菌大量存在于動(dòng)物的自然腔道,如口腔、咽部、消化道等[25-26],它可以有效地促進(jìn)乳酸代謝[27],防止家兔機(jī)體乳酸的積累。由此可推斷,家兔口腔微生物微生態(tài)系統(tǒng)中的微生物對其健康具有一定促進(jìn)作用,但由于環(huán)境和數(shù)量的限制,微生物在家兔口腔中的益生和致病作用沒有在腸道中發(fā)揮明顯,并且家兔口腔微生物對食物沒有直接的消化作用。
兔是口腔醫(yī)學(xué)模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一,常應(yīng)用于下頜骨愈合及修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究中[28-29]。吳芳等[30]研究的健康人類口腔菌群優(yōu)勢菌屬豐度與本研究中的家兔優(yōu)勢菌屬豐度差異顯著(P<0.05)。因此,雖然家兔是下頜骨愈合及修復(fù)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,但是家兔不適用于作為人類口腔微生物疾病的模型動(dòng)物。
本研究通過16S rRNA基因測序分析法測定了家兔口腔微生物組成結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢菌群,初步探討了家兔口腔微生物對維持機(jī)體健康的作用,為研究不同動(dòng)物口腔微生物結(jié)構(gòu)和家兔口腔生理機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。