史文清

（北京市畜牧總站，北京 100107）

豬精子質(zhì)量直接關(guān)系到精子受精能力和配種受胎率?？陀^地評價精子質(zhì)量是人工授精和生產(chǎn)的前提條件。從20世紀70年代開始，從豬冷凍精液被證實能夠獲得健康后代以來，很多冷凍解凍優(yōu)化方案被提出，人工授精技術(shù)措施不斷地被優(yōu)化。最近10年來豬冷凍精液大規(guī)模使用，雖然產(chǎn)仔數(shù)還不夠理想，但是足以證明此技術(shù)真正達到了生產(chǎn)使用的要求。精子檢測技術(shù)的發(fā)展迅速，對豬精子冷凍解凍后的質(zhì)量評價提供了很多可以參考借鑒之處，檢測方式從常規(guī)評價［1］發(fā)展到更多細胞生物學(xué)手段，結(jié)構(gòu)上從質(zhì)膜深入到染色體。文章從精液常規(guī)分析、質(zhì)膜完整性、運動參數(shù)、染色質(zhì)、獲能和繁殖產(chǎn)仔情況六個方面闡述豬冷凍精液的質(zhì)量評價。

1 精液常規(guī)分析

在冷凍精液樣品分析前，外觀檢查評價不能忽視。豬的冷凍精液貯存在液氮溶液里也會有安全風(fēng)險，要確保冷凍精液所處溫度不高于-130℃，否則可能造成精子損傷［2］。對于細管凍精，首先要檢查細管的顏色，如果發(fā)現(xiàn)細管不透明（或者變?yōu)榘咨┚鸵獧z查貯存記錄、購買與運輸各環(huán)節(jié)。所用細管一般采用可熱封的離子型樹脂制成，以保證在-196℃低溫下維持其抗漏、防菌、防病毒污染及機械抗性［3］。檢查外包裝無誤后，再開展精液的常規(guī)分析（SRA），包括精子計數(shù)、活力分析與形態(tài)分析三方面。

1.1 精子計數(shù)

精子計數(shù)常用的血細胞計數(shù)板也叫改良牛鮑計數(shù)板，計數(shù)通過計數(shù)池中間的精子，可重復(fù)使用。為避免污染精液中潛在的傳染因子，計數(shù)板需要及時消毒、清洗。

還有使用較多的Makler精子計數(shù)板，其專用精子計數(shù)池也可以反復(fù)使用，池深10μm，是一種方便精子計數(shù)的設(shè)備，用于快速、精確地進行精子計數(shù)及活動性和形態(tài)學(xué)評價，可使用未稀釋的樣品，無需校正。

Cell-VU CBC（milennium inc，USA）血細胞計數(shù)板專門用于細胞手工計數(shù)，整個裝置是一次性的，省去了清洗環(huán)節(jié)，降低了檢驗人員暴露的機會。它有雙計數(shù)池，載玻片表面支持2個蓋玻片，每個蓋玻片含一個在背面激光-蝕刻的網(wǎng)格，每個Cell-VU可進行2個測試項目。

1.2 活力檢查

精子活力評定的實施，應(yīng)在可加熱至37℃的載物臺的顯微鏡下進行檢查，精液標本也應(yīng)該在同樣溫度下孵育，載玻片和蓋玻片也需要預(yù)熱。

精子活力指的是前向運動（PR）精子，即a級（精子運動速度＞15μm／s）與b級（精子運動速度10～15μm／s）精子的百分率，精子主動地呈直線或沿大圈運動，不管其速度如何；非前向運動（NP）精子是指以小圓周泳動，幾乎不能移動，或者只尾部擺動；不活動（IM）精子即是沒有運動的精子。精子活率一般指精子（PR＋NP）活動率。

1.3 形態(tài)檢測

在檢查頂體完整率時，通常采用姬姆薩染色方法進行評價，比如使用姬姆薩染色套裝（Solarbio），檢查方法附在套裝說明書上，比較簡單。

2 質(zhì)膜完整性檢查

質(zhì)膜是精子的基本組成部分，在維持細胞內(nèi)環(huán)境和保持精子活力上起重要作用。在冷凍精液解凍過程中，會對精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性造成損傷。異常染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)會導(dǎo)致受精后胚胎發(fā)育異常，因此精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性的檢測也是評估精子質(zhì)量的重要指標之一。質(zhì)膜完整性檢查包括低滲膨脹檢驗（HOST）與活性染色。

2.1 低滲膨脹檢驗方法

低滲膨脹試驗是一種滲透壓檢驗方式。膜的完整是精卵融合的必要條件，HOST可在一定程度上反映精子的受精能力。在低滲溶液中，精子質(zhì)膜具有生物活性，水分子向內(nèi)流入精子胞質(zhì)內(nèi)，導(dǎo)致精子尾部的質(zhì)膜向外周膨脹，尾部發(fā)生彎曲腫脹，通過顯微鏡可以觀測到精子質(zhì)膜對低滲液的膨脹反應(yīng)；若精子損傷或者質(zhì)膜失去生物活性，水分子可以自由通過質(zhì)膜，胞質(zhì)內(nèi)不會積聚水，不會出現(xiàn)明顯的腫脹和尾部彎曲［4］。HOST方法簡單、迅速，對檢驗質(zhì)膜的完整性非常實用。檢測時，將豬細管冷凍精液于37℃水浴解凍，在新制備的膨脹液中37℃孵育10 min，在200倍（或400倍）顯微鏡視野下計算彎尾精子的百分率。通過精子尾部形態(tài)判斷膨脹精子，如精子尾部有膨脹即為存活精子。詳細方法可以參照人類精子檢查方法［1］。

2.2 吖啶橙染色方法

吖啶橙（acridine orange，AO）能夠與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)出綠色熒光，而與單鏈DNA結(jié)合發(fā)出紅色或黃色熒光，當精子受到損傷時DNA會變性解鏈，產(chǎn)生單鏈DNA。因此，可根據(jù)熒光顯微鏡下綠色熒光強度區(qū)分成熟和不成熟精子，計算呈綠色熒光的精子比率，即為精子DNA完整率。

2.3 碘化丙啶染色

碘化丙啶（PI）是死精子特異性熒光染料，當精子質(zhì)膜完整時染料不能進入精子內(nèi)部，在熒光顯微鏡下精子不發(fā)熒光；如精子質(zhì)膜受損，染料可進入精子內(nèi)部，在熒光顯微鏡下發(fā)出紅光。實驗室常用的死精子特異性熒光染料還有Hoechst33258、溴化乙錠（EB）。PI染色操作不當常常會造成假陰性精子，通常的做法是采用二乙酰熒光素（FDA）和PI共同染色，F(xiàn)DA會把活精子標記為綠色。雙染色較好地解決了假陽性和假陰性問題，紅色熒光標記的為死精子，綠色熒光標記的為活精子。

3 運動參數(shù)分析

3.1 運動速度與分級

豬的正常精子長度約為55μm，分頭部、頸部、尾部，尾部又分為中段、主段、末段。其中尾部細長，頭部呈扁圓型。計算機輔助精子分析（CASA）技術(shù)是借助計算機進行精子活力、動（靜）態(tài)圖像等的檢測，以獲得精子動態(tài)、靜態(tài)各項參數(shù)，也稱計算機輔助精液分析。原理是借助高速攝像機把顯微鏡下觀察到的精子圖像傳輸?shù)诫娔X上，通過精子動力學(xué)分析軟件對精子運動軌跡進行捕捉，計算精子的各種運動速度，對精子活力進行分級；精子形態(tài)學(xué)分析軟件比照正常精子形態(tài)圖像，對視野下精子的畸形數(shù)、畸形類別及畸形率等指標進行自動識別，分類統(tǒng)計。

3.2 新鮮精液與冷凍精液運動參數(shù)的比較

筆者在CASA分析中把豬精子分成四類：A類精子標記為紅色，運動速度≥15μm／s；B類精子標記為綠色，運動速度≥10～＜15μm／s；C類精子標記為黃色，運動速度5～＜10μm／s；D類精子標記為白色，運動速度＜5μm／s。豬新鮮精子與冷凍解凍后精子的運動軌跡見圖1，在精子活力從72.72%降低到46.03%時候，直線速度（VSL）、曲線速度（VCL）、平均路徑速度（VAP）、直線性（LIN）、前向性（STR）、精子頭側(cè)擺幅度（ALH）、鞭打頻率（BCF）等運動參數(shù)均發(fā)生顯著或極顯著變化。

圖1 豬新鮮精子與冷凍解凍后精子的運動軌跡（×100）Fig.1 The movement track of fresh and frozen-thawed porcine spermatozoa（×100）

4 染色質(zhì)評價

4.1 精子DNA碎片化分析

DNA是精子遺傳信息的載體。精子DNA碎片指數(shù)（DFI）作為一個精子質(zhì)量評估的檢測指標，與畸形精子指數(shù)呈顯著正相關(guān)，與精子活動率、PR精子百分率及形態(tài)正常精子百分率呈顯著負相關(guān)。有正常生育能力男子的DFI值小于30%［5］。有研究表明，早期自然流產(chǎn)組的精子DFI比例顯著高于對照組，說明精子DFI可能與早期自然流產(chǎn)密切相關(guān)［6］。

精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析試驗（SCSA）和精子染色體擴散試驗（SCD）均對精子質(zhì)量有較高的分析價值［7］。精子染色質(zhì)完整與否對精子的正常功能至關(guān)重要，SCSA在流行病學(xué)研究和臨床分析中具有重要價值［8］，被認為是檢測精子DNA碎片化的金標準。目前主要使用吖啶橙染色方法進行SCSA分析，未受損精子發(fā)出綠色熒光，而受損精子發(fā)出紅色或黃色熒光，通過流式細胞儀可以做出判定。

4.2 彗星試驗

彗星試驗指單細胞凝膠電泳（SCGE），可直接在熒光顯微鏡下觀察單個細胞DNA損傷，是檢測精子DNA損傷程度的有效手段。由于電泳時損傷的DNA從核中溢出，朝陽極方向泳動，產(chǎn)生的尾狀帶形似“慧星”，“慧星”長度指示的是DNA遷移距離，“慧星”熒光強度代表了遷移DNA的量，從而可以定量檢測精子中的DNA損傷程度。

4.3 精子TUNEL分析

TUNEL指用DNA聚合酶和末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）標記DNA鏈斷端的核酸，進行的末端反應(yīng)又稱為ISEL技術(shù)。TUNEL分析特異性強、敏感性高，可以檢測精子凋亡所致的DNA損傷情況。需要通過激光共聚焦熒光顯微鏡對采集的圖像進行分析。

5 精子獲能的評價

精子膜的獲能狀態(tài)改變很容易引起頂體反應(yīng)的提前發(fā)生及精子受精能力的喪失。尤其對冷凍解凍后的精子，溫度、滲透壓和冷凍稀釋劑等因素會破壞精子膜和精子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，引起精子的獲能狀態(tài)變化。精子獲能是一系列的生理生化反應(yīng)過程，步驟大致分為激活、獲能與頂體反應(yīng)三個環(huán)節(jié)。

5.1 倉鼠卵母細胞穿透試驗

倉鼠卵母細胞穿透（HOP）試驗，也稱精子穿透試驗。常規(guī)穿卵試驗是依賴精子的自發(fā)性頂體反應(yīng)而實現(xiàn)的。統(tǒng)計帶有尾巴的精子和與精子尾部有解聚的精子總數(shù)。

5.2 頂體反應(yīng)分析

頂體指精子頭部的帽狀結(jié)構(gòu)，在受精之前應(yīng)該是完整的，可以穿過卵子透明帶與卵質(zhì)膜融合；而當精子失去頂體或頂體破損時，精子無法進入卵子，不能進行受精。因此頂體完整性的檢測是評價精子冷凍效果的重要指標。

頂體狀態(tài)的熒光評價方法較簡單，更具重復(fù)性，并且能得到非常清晰的圖像?？捡R斯亮藍染色常用來分析精子頂體完整性。利用原位免疫熒光技術(shù)，即用異硫氰酸熒光素標記的免疫結(jié)合物更能準確地檢測精子頂體狀態(tài)。

5.3 透明帶結(jié)合檢測

由于精子與透明帶結(jié)合是由受體和配體介導(dǎo)的，透明帶結(jié)合檢測檢測精子分子水平上的損傷，是常規(guī)精子檢測分析技術(shù)無法實現(xiàn)的。目前精子結(jié)合透明帶能力有兩種檢測方法［9］，一種是透明帶結(jié)合檢測（ZBA），另一種是利用半透明帶檢測（HZA）。ZBA方法：使用屠宰場的卵巢分離出卵母細胞與精子，進行共同培養(yǎng)，然后使用相差顯微鏡或者熒光顯微鏡測定結(jié)合到透明帶上的精子數(shù)量。HZA方法：利用顯微操作方法，將卵母細胞切割為兩半，去掉細胞質(zhì)，然后兩半透明帶分別與對照組和試驗組的精液樣本孵育，最后使用相差顯微鏡測定結(jié)合的精子數(shù)量。新鮮精液和冷凍精液都可以使用HZA方法，缺點是費時和需要復(fù)雜技術(shù)。當然利用體外受精（IVF）技術(shù)來檢測精子對卵母細胞的體外受精能力更接近體內(nèi)的受精過程，能更好地檢測出精子的真實質(zhì)量水平。

6 繁殖效率評價

豬冷凍精液質(zhì)量的優(yōu)劣最終要靠人工授精后母豬的產(chǎn)仔情況和仔豬成活數(shù)來檢驗。豬冷凍精液應(yīng)用評價中還要注意冷凍劑型、母豬類型、精液處理方法及人工授精方法等因素對繁殖效果產(chǎn)生的影響。

6.1 精液冷凍劑型和母豬類型的影響

1973年S.Salamon等［10］的研究表明，用冷凍顆粒精液人工輸精使5頭母豬妊娠，分娩后平均產(chǎn)仔數(shù)達到7.6頭的成績，同時發(fā)現(xiàn)初配母豬的產(chǎn)仔數(shù)低于經(jīng)產(chǎn)母豬。1989年鄧強強等［11］的研究表明，用磁盤凍裂成碎片冷凍豬精子，70頭經(jīng)產(chǎn)母豬獲得76.5%配種分娩率，平均產(chǎn)仔數(shù)達到8.2頭，接近鮮精人工授精的效果。隨后細管逐漸成為凍精的主流劑型，1991年日本有4 008頭母豬使用豬冷凍精液輸精，配種分娩率僅達39.6%，產(chǎn)仔數(shù)為8.0頭［12］。

為了尋找更適合的冷凍精液承載體，2002年B.M.Eriksson等［13］使用了扁平袋（Flat Packs）凍精承載物，205頭經(jīng)產(chǎn)母豬的配種分娩率為72.3%，平均產(chǎn)仔數(shù)達11.3頭。2009年還有研究報道了塑料袋豬冷凍精液取得不錯的效果［14］。

6.2 冷凍精液處理方法的影響

2012年O.Tetsuji等［15］報道，在解凍后精子中添加精漿可以提高母豬妊娠率和產(chǎn)仔數(shù)。2015年T.Monika等［16］報道，在冷凍液中添加丁基羥基甲苯可以提高母豬妊娠率和產(chǎn)仔數(shù)。

6.3 授精方式的影響

2008年R.Bathgate等［17］在之前的人手術(shù)法深部輸精技術(shù)的基礎(chǔ)上，研發(fā)了冷凍精液非手術(shù)法深部輸精，節(jié)省了精子用量。豬子宮深部人工授精技術(shù)的普及與推廣，可以保障較低精子數(shù)授精后的效果。2020年鄧雙義等［18］采用國內(nèi)某公司的加系長白、大白和杜洛克豬細管冷凍精液（0.5 mL細管約含2億個有效精子），用子宮內(nèi)深部輸精8億個有效精子，得到與鮮精相近的情期受胎率和分娩率。

通過以上六方面評價，可以對豬冷凍精液產(chǎn)品有一個全面評估。當然，隨著精液檢測技術(shù)的進一步發(fā)展，質(zhì)量評價將會出現(xiàn)更多方法和更便捷的手段。人們對精子經(jīng)過冷凍造成的傷害了解得越透徹，冷凍精液生產(chǎn)程序就會越優(yōu)化、冷凍精液在育種生產(chǎn)中越能夠發(fā)揮出潛力。