丁 燕 木萬福 楊 龍 張 鵬 管俊嬌

（1 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，昆明 650205；2 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所，元謀 651300）

甘藍(lán)種（Brassica oleraceaL.）是十字花科蕓薹屬的二倍體種，起源于歐洲地中海沿岸，由甘藍(lán)野生種經(jīng)過自然和人工的雙重選擇形成了不同的栽培類型，如普通甘藍(lán)、羽衣甘藍(lán)、皺葉甘藍(lán)、紫甘藍(lán)、抱子甘藍(lán)、苤藍(lán)、青花菜、花椰菜以及芥藍(lán)等變種[1]?；ㄒ耍˙.oleraceavar.botrytis）和青花菜（B.oleraceavar.Italica）以其獨(dú)特的生殖器官花球?yàn)樯唐泛褪秤闷鞴?，含有多種維生素、礦物質(zhì)、粗纖維等，特別是富含萊菔硫烷，具有防癌、抗癌功效。我國(guó)是花菜生產(chǎn)大國(guó)，也是花菜消費(fèi)大國(guó)。然而，在我國(guó)花菜栽培歷史中，其生產(chǎn)用種主要依賴于國(guó)外進(jìn)口。目前生產(chǎn)中青花菜用種90%以上仍然為進(jìn)口，種子價(jià)格奇高。

種子純度是評(píng)價(jià)種子質(zhì)量的關(guān)鍵，在大面積種植之前快速準(zhǔn)確地鑒定種子質(zhì)量，是非常關(guān)鍵和必要的步驟[2]。傳統(tǒng)的種子純度鑒定方法是以播種后植株的田間形態(tài)觀察為依據(jù)，其周期長(zhǎng)、工作量大，且易受環(huán)境、季節(jié)因素影響。因此，開發(fā)快速、準(zhǔn)確的種子純度鑒定方法已成為種子科研單位和企業(yè)急需解決的問題。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，該技術(shù)已經(jīng)在花菜類品種純度鑒定中得到應(yīng)用，具有快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、安全、不受環(huán)境因素影響等優(yōu)點(diǎn)。其中，SSR 標(biāo)記具有操作簡(jiǎn)便和穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)，加之具有大量的等位差異，多態(tài)性十分豐富，在雜交種子純度檢測(cè)中有廣闊的應(yīng)用前景。然而，在以往的研究中，為解決少數(shù)雜交種的純度鑒定，往往需要進(jìn)行大量的引物篩選工作，才能找到適合的鑒定引物[3]。確定一套適于純度鑒定的核心引物，并構(gòu)建品種純度鑒定體系，對(duì)花菜類種子的純度鑒定至關(guān)重要。有了核心引物就不再需要進(jìn)行繁瑣的引物篩選，即使對(duì)未知品種，也只需進(jìn)行少量的篩選，就能迅速找到合適的鑒定引物[4]。本研究通過對(duì)70 個(gè)花椰菜和青花菜材料的DNA 指紋分析，確定適于花菜類雜交種純度鑒定的核心引物，構(gòu)建了花菜類雜交種純度鑒定 體系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料試驗(yàn)材料選取F1材料70 份，其中青花菜栽培品種22份，花椰菜47份，西蘭苔1份（表1），2020 年8 月在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所基地種植，采樣后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 70 份供試材料的基本信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 全基因組DNA 提取以改良CTAB 法[5]提取全基因組DNA，獲得的全基因組DNA 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)濃度并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR 引物依據(jù)前人研究公布的甘藍(lán)類SSR標(biāo)記[6-8]，合成引物100 對(duì)，經(jīng)過初篩，在每條染色體上選擇1～3 對(duì)引物，共選擇22 對(duì)引物進(jìn)行熒光標(biāo)記，用于遺傳多樣性檢測(cè)，引物詳細(xì)信息見表2。

表2 22對(duì)SSR 引物

1.2.3 標(biāo)記篩選采用22 對(duì)熒光引物對(duì)70 個(gè)雜交種全基因組DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 總反應(yīng)體系為10μL：5μL 2×mix 混合液、0.3μL 10μmol/L 正向引物、0.3μL 10μmol/L 反向引物，1μL 樣品DNA，3.4μL 超純水。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循環(huán)30 次；72℃延伸10min，4℃保存。引物及試劑均由北京擎科生物有限公司提供。擴(kuò)增產(chǎn)物在毛細(xì)管熒光電泳系統(tǒng)AB 3730XL DNA 分析儀（Applied Biosystems，USA）上檢測(cè)。

用GeneMapper Ver.3.7（Applied Biosystems，USA）對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和校正，讀出每個(gè)樣品各位點(diǎn)的等位變異片段大小數(shù)據(jù)。由于花菜是二倍體，以及SSR 標(biāo)記的共顯性特征，供試品種在每個(gè)引物位點(diǎn)上的基因型用X/X（純合）、X/Y（雜合）記錄，其中X、Y 為該位點(diǎn)上兩個(gè)不同的等位變異片段大小，小片段在前，大片段在后。無效等位變異的大小記錄為0/0。

評(píng)估引物多態(tài)性高低的指標(biāo)用多態(tài)性信息含量（PIC，polymorphism information content），評(píng) 估 引物位點(diǎn)雜合程度的指標(biāo)用雜合率[3]。

1.2.4 分子標(biāo)記有效性驗(yàn)證隨機(jī)選取2 個(gè)花菜雜交組合，分別提取父母親本、F1的DNA，并用篩選出的純度檢測(cè)核心SSR 分子標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)價(jià)所篩選出的核心SSR 分子標(biāo)記的有效性。

2 結(jié)果與分析

2.1 純度鑒定核心引物的篩選利用22 對(duì)SSR 引物建立了70 個(gè)花菜類雜交種的DNA 指紋圖譜，根據(jù)圖譜數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析引物的基因頻率、基因分布信息及多態(tài)性和雜合率表現(xiàn)。由表3 可知，在這70 份材料中，73%的引物位點(diǎn)的實(shí)際基因型數(shù)小于理論基因型數(shù)。多態(tài)性信息含量（PIC）的變化范圍為0.05～0.69，平均為0.43。根據(jù)衡量基因變異程度高低的多態(tài)性信息量指標(biāo)[9]，當(dāng)PIC ≥0.50 時(shí)，該引物為高度多態(tài)性信息引物；當(dāng)0.25 ≤PIC ＜0.50 時(shí)為中度多態(tài)性信息引物；當(dāng)PIC ＜0.25 時(shí)為低度多態(tài)性信息引物。22 對(duì)引物中有9 對(duì)高度多態(tài)性信息引物，9 對(duì)中度多態(tài)性信息引物，4 對(duì)低度多態(tài)性信息引物。雜合率的變化范圍為0～0.72，平均雜合率為0.36，表明這些雜交種遺傳背景狹窄，集中在幾個(gè)骨干親本的血緣關(guān)系上。

表3 22 對(duì)SSR 引物檢測(cè)到的遺傳多樣性信息

根據(jù)王鳳格等[3]提出的核心引物的篩選原則，把引物分為3 類：第1 類為多態(tài)性高，且雜合率高的引物，包括BoGMS0624、BoGMS0941 和OI11G11；第2 類為多態(tài)性高或中，且雜合率高或中的引物，如BoE607、BoE761、BoGMS2431、BoGMS0808 和BoGMS1530；其余引物歸為第3 類，多態(tài)性低或中，且雜合率低。

70 個(gè)雜交種中有68 個(gè)可以用BoGMS0624、BoGMS0941 和OI11G11 3 個(gè)引物找到雜合帶型，只有2 個(gè)品種（W131 和亞松20003）不具有雜合帶型，所以這3 個(gè)引物可作為花菜純度鑒定的核心引物。

2.2 花菜純度鑒定特異引物的確定表4 匯總了引物的最低頻率基因型，有22 個(gè)基因型僅出現(xiàn)一次，其中亞松20002 有2 個(gè)位點(diǎn)的基因型僅出現(xiàn)一次，最低頻率為0.014（1/70）。根據(jù)王鳳格等[3]對(duì)特異引物的定義，在指定品種范圍內(nèi)，利用某一引物檢測(cè)，指定品種的雜合基因型表現(xiàn)唯一，或者依據(jù)引物的基因頻率表，當(dāng)預(yù)測(cè)基因型頻率低于一定數(shù)值時(shí)，可將該引物視為該品種的特異引物。在本研究中有21 個(gè)品種具有特異性引物，但并不是所有的特異性引物都可為純度鑒定所用。如松1963 在BoGMS0624 位點(diǎn)的基因型327bp/335bp，在70 個(gè)品種中僅出現(xiàn)一次，且為雜合基因型，實(shí)際基因型頻率為0.014，但是其理論基因型頻率為0.039，即還有可能出現(xiàn)相同帶型的品種，該引物可用于鑒定松1963自交苗，但是不能用于異型株的鑒定，也就不能作為松1963的特異引物使用。在21 個(gè)品種中有8 個(gè)品種的實(shí)際基因型頻率小于理論基因型頻率，這些基因型的引物不能作為純度鑒定特異引物使用。此外，雅翠91（252bp/252bp）、貝綠美（254bp/254bp）和亞松20003（368bp/368bp）3 個(gè)基因型為純合基因型，這些位點(diǎn)也不適合作為純度鑒定特異引物。因此，本研究共篩選出浙青75、浙青80、蝴蝶等11 個(gè)品種（圖4 最后一列加粗品種）的純度鑒定特異引物，可以用于這些品種純度快速檢測(cè)。

表4 具有最低基因型頻率的基因型

2.3 花菜純度鑒定核心引物的有效性驗(yàn)證采用篩選出的3 個(gè)純度檢測(cè)核心SSR 分子標(biāo)記對(duì)隨機(jī)選取的2 個(gè)花菜雜交組合（MS048-1-2×C18232、MS048-1-2×C18199）的父母親本、F1的DNA 進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，2 個(gè)雜交組合都從核心引物中篩選到了互補(bǔ)型條帶。如圖1 所示，A 中為雜交 組 合MS048-1-2×C18232 及F1（松1821）在BoGMS0941 引物的擴(kuò)增條帶，a1 為母本MS048-1-2（234bp），a2 為父本C18232（224bp），a3 為F1出現(xiàn)了父母本的2 個(gè)互補(bǔ)條帶（224bp/234bp）。B 中為雜交組合MS048-1-2×C18199 及F1（松1963）在OI11G11 引物的擴(kuò)增條帶，b1 為母本MS048-1-2（129bp），b2 為父本C18199（154bp），b3 為F1出現(xiàn)了父母本的2 個(gè)互補(bǔ)條帶（129bp/154bp）。

3 結(jié)論與討論

SSR 標(biāo)記技術(shù)可以通過檢測(cè)待鑒定樣品是否具有某一品種的基因特異片段來辨別其真?zhèn)?，從而?duì)種子純度進(jìn)行檢測(cè)，具有快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、安全、不受環(huán)境因素影響等優(yōu)點(diǎn)。目前，SSR 標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于水稻、棉花、玉米等作物的雜交種純度鑒定。本研究中引物的實(shí)際基因型數(shù)普遍低于理論基因型數(shù)，多態(tài)性較低，平均PIC 值為0.43，雜合率也不高，平均雜合率為0.36，揭示了目前花菜的遺傳背景狹窄，主要集中在幾個(gè)骨干親本。這增加了雜交種的區(qū)分難度，也不利于雜交種純度 檢測(cè)。

雜交種純度鑒定一是檢測(cè)母本自交、父本誤收因素造成的雜交種混雜，二是鑒定由異源花粉污染或機(jī)械混雜等造成的異型株。檢驗(yàn)自交苗時(shí)需1 對(duì)雙親互補(bǔ)型引物，再利用特異引物或引物組合檢驗(yàn)異型株。引物雜合率高，更容易篩選到雙親互補(bǔ)型引物用于檢驗(yàn)自交苗；引物多態(tài)性高，可降低相同帶型出現(xiàn)頻率，有利于區(qū)分異型株。本試驗(yàn)篩選出了3 個(gè)共顯性SSR 標(biāo)記BoGMS0624、BoGMS0941 和OI11G11，作為花菜品種純度檢測(cè)的核心引物。這3個(gè)引物雜合率高，97%的品種均可以找到具有雜合帶型的引物，滿足檢驗(yàn)自交苗的需要，且這3 個(gè)引物多態(tài)性高，具有較高的驗(yàn)雜能力。因此，這3 個(gè)引物可以推薦作為純度鑒定的首選核心引物。其他5 個(gè)中等表現(xiàn)的引物BoE607、BoE761、BoGMS2431、BoGMS0808 和BoGMS1530 可作為純度鑒定的備選引物，補(bǔ)充解決上述3 個(gè)引物不能鑒定的品種。目前已有的研究多是針對(duì)特定品種的純度鑒定引物篩選[10]，從核心引物中選擇合適的引物用于特定品種的純度鑒定，極大地縮減了工作量，提高了檢測(cè)效率，降低了檢測(cè)成本。此外，本研究共篩選出浙青75、浙青80、蝴蝶等11 個(gè)品種的純度鑒定特異引物，不僅可鑒別自交株，還可鑒別異形株，大大加快了純度檢測(cè)速度。