◎ 馬小筱

（廣州市番禺質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)所，廣東 廣州 511400）

沙門氏菌（Salmonellaspp.）是一種常見的人畜共患病原菌，對(duì)人類和動(dòng)物都有極大危害。食物傳播是人類感染沙門氏菌的主要途徑，尤其是近年來，方便快餐、快熟食品、冷凍食品的盛行，在增加沙門氏菌污染可能性的同時(shí)也加大了沙門氏菌檢出的難度，因此通過參加能力驗(yàn)證來提高檢測(cè)人員素質(zhì)，增加檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，準(zhǔn)確分離出沙門氏菌，找出污染源，降低感染此病菌的潛在危險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 樣品的來源

大連海關(guān)技術(shù)中心PTC—T542乳粉中沙門氏菌能力驗(yàn)證樣品：凍干粉PTC213和PTC221；沙門氏標(biāo)準(zhǔn)菌株。傷寒沙門氏（FSCC215009(CMCC(B)50071)）標(biāo)準(zhǔn)菌株，將此傷寒沙門氏標(biāo)準(zhǔn)菌復(fù)蘇后用瓷珠保存于-18 ℃冰箱，此標(biāo)準(zhǔn)菌株的本實(shí)驗(yàn)室編號(hào)為WB1，本次實(shí)驗(yàn)取一株編號(hào)為WB1的標(biāo)準(zhǔn)菌珠進(jìn)行復(fù)蘇做陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)用（實(shí)驗(yàn)編號(hào)為：WB1-2A）。

1.2 儀器與試劑

緩沖蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（TTB）、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、沙門氏顯色培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂（XLD）和沙門氏菌干制生化鑒定試劑盒，以上試劑均來自廣州陸橋；沙門氏菌O多價(jià)血清（A-F）（寧波天潤(rùn)，批號(hào)20210101）；生化培養(yǎng)箱；生物安全柜等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理與預(yù)增菌

本次能力驗(yàn)證樣品為采用西林瓶包裝的凍干粉，來樣編號(hào)分別為PTC213、PTC221。根據(jù)指導(dǎo)書說明，用75%的滅菌酒精棉球擦試西林瓶外包裝，小心開啟西林瓶，先用3 mL滅好菌的0.85%的生理鹽水對(duì)西林瓶中的干粉進(jìn)行水化，待溶解后，吸出放入無菌瓶中，用生理鹽水反復(fù)沖洗西林瓶，共收集清洗液25 mL，加入225 mL BPW，進(jìn)行預(yù)增菌。同時(shí)取一株本實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存菌珠進(jìn)行復(fù)蘇，同步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，作陽性對(duì)照。將以上測(cè)試樣品輕輕搖勻分別標(biāo)注為PTC213、PTC221、WB1-2A，置于（36±1）℃的培養(yǎng)箱中，預(yù)增菌8～18 h，8 h后每隔1 h觀察增菌液的變化，并分別在8 h、12 h、16 h、18 h分別進(jìn)行一次增菌培養(yǎng)及后續(xù)實(shí)驗(yàn)，從分離在選擇性培養(yǎng)基上的目標(biāo)菌生長(zhǎng)性情況來看，前增菌16～18 h的結(jié)果比較理想，接下來的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均取自前增菌18 h的緩沖液作為最終結(jié)果。

1.3.2 選擇性增菌

輕搖盛裝編號(hào)為PTC213，PTC221及WB1-2A BPW緩沖液的三角瓶，分別吸1 mL培養(yǎng)混合物加入10 mL SC和10 mL TTB中，將SC置于（36±1）℃的 培 養(yǎng) 箱；TTB置于（42±1）℃培養(yǎng) 箱，培 養(yǎng)（18～24）h。培養(yǎng)24 h菌液均有輕微的渾濁現(xiàn)象。

1.3.3 劃線分離

分別用3 mm的接種環(huán)取一環(huán)SC的培養(yǎng)物分別劃線于一個(gè)BS平板和一個(gè)沙門氏顯色平板和一個(gè)XLD平板；TTB中的培養(yǎng)物做同樣操作。置于（36±1）℃培養(yǎng)箱，BS平板培養(yǎng)40～48 h，沙門氏顯色平板和XLD平板培養(yǎng)18～24 h。結(jié)果如表1及圖1所示。

表1 選擇性增菌液SC中分離在各平板上的菌落形態(tài)表

圖1 沙門氏菌典型菌落在各選擇性培養(yǎng)基上的圖示

1.3.4 純培養(yǎng)及生化實(shí)驗(yàn)

（1）挑取PTC213選擇性培養(yǎng)基上①②③（圖1 圖片中序號(hào)）所描述的典型菌落3個(gè)分別接種三糖鐵（生化反應(yīng)現(xiàn)象如圖2示）及營(yíng)養(yǎng)瓊脂做純培養(yǎng)，（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h，挑24 h內(nèi)新鮮純培養(yǎng)的菌落做相應(yīng)的生化實(shí)驗(yàn)和血清學(xué)鑒定（生化實(shí)驗(yàn)按陸橋干制生化鑒定試劑盒操作說明書進(jìn)行操作）。

（2）對(duì)PTC221選擇性培養(yǎng)基上Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ所描述的典型菌落及WB1-2A標(biāo)準(zhǔn)菌株同步進(jìn)行如（1）中試驗(yàn)操作。結(jié)果描述如表2、圖2；各生化反應(yīng)結(jié)果列舉如表3所示。

2 結(jié)果與分析

由以上實(shí)驗(yàn)得出結(jié)果如表2、圖2所示，結(jié)合表3 生化反應(yīng)現(xiàn)象，依照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.4—2016）[1]中表2、 表3得 出：PTC221+BPW+SC-PTC-Ⅰ號(hào) 為A3型可疑沙門氏，依照國(guó)標(biāo)ONPG的生化反應(yīng)應(yīng)為陰性，本實(shí)驗(yàn)得出ONPG為陽性，血清實(shí)驗(yàn)為自凝菌落，可判為非沙；依照GB4789.4—2016表2可得出PTC221+BPW+SC-PTC-Ⅲ和PTC213+BPW+TTB—③為非沙；PTC213+BPW+TTB－①/②及WB1-2A標(biāo)準(zhǔn)菌株生化反應(yīng)現(xiàn)象完全符合典型沙門氏生化現(xiàn)象，結(jié)合血清學(xué)鑒定判定為沙門氏檢出。

表2 可疑菌落在三糖鐵上呈現(xiàn)的結(jié)果表

圖2 可疑菌落在三糖鐵上呈現(xiàn)的圖示

表3 生化現(xiàn)象及結(jié)果判定表

3 要點(diǎn)分析

3.1 關(guān)于預(yù)增菌和增菌

隨著現(xiàn)代方便食品的盛行，食品加工工藝也隨之變化，而食品加工過程中的加熱、干燥、冷凍、機(jī)械處理等加工工藝使得沙門氏菌細(xì)胞膜遭到了不同程度的損傷，使其處于比較弱的活性或?yàn)l死狀態(tài)，緩沖蛋白胨水（BPW）具有較高的pH緩沖體系且為非選擇性培養(yǎng)基，有助于修復(fù)受損的細(xì)胞膜，還能復(fù)蘇處于冷凍休眠狀態(tài)的細(xì)菌，但同時(shí)其他雜菌也同樣得到修復(fù)與生長(zhǎng)，雜菌太多往往會(huì)掩蓋住目標(biāo)菌，因此控制好預(yù)增菌的時(shí)間是非常關(guān)鍵的一個(gè)程序。

選擇性增菌液會(huì)促進(jìn)相應(yīng)種群的沙門氏菌生長(zhǎng)，同時(shí)抑制其他菌落的生長(zhǎng)，而目前已知的沙門氏菌血清分型已有2 500多種[2]，因此沙門氏菌選擇性增菌液最好多選擇幾種增菌液進(jìn)行增菌，本文按國(guó)標(biāo) GB 4789.4—2016中的方法分別選擇TTB和SC兩種增菌液進(jìn)行增菌，本次能力驗(yàn)證試驗(yàn)中編號(hào)為PTC213的樣品，自SC增菌液中分離在3種選擇性培養(yǎng)基上均無菌落生長(zhǎng)，自TTB增菌液中分離在沙門氏顯色及XLD培養(yǎng)基上均有典型菌落生長(zhǎng)。如果本次實(shí)驗(yàn)只選擇一種增菌液進(jìn)行增菌，就會(huì)造成沙門氏漏檢的可能性。SC比較適合傷寒沙門氏菌的生長(zhǎng)，而對(duì)其他沙門氏菌具有抑制的作用。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，本實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株在SC中生長(zhǎng)良好，三糖鐵上表現(xiàn)為不發(fā)酵糖不產(chǎn)氣，產(chǎn)少量的硫化氫，符合典型的傷寒沙門氏菌生化反應(yīng)特征，而本次能力驗(yàn)證試驗(yàn)PTC213檢出沙門氏菌雖然生化反應(yīng)與典型沙門氏菌生化完全吻合，但是其在BS上完全不生長(zhǎng)，周正等[3]研究用鼠傷寒沙門氏和傷寒水氏在BS上均生長(zhǎng)良好，另外其在三糖鐵上有大量的H2S產(chǎn)出，由此可以排除編號(hào)PTC213檢出沙門氏菌為非鼠傷寒沙門氏、非傷寒沙門氏，具體哪種沙門氏菌還需要進(jìn)一步研究。

3.2 關(guān)于生化實(shí)驗(yàn)

（1）關(guān)于商品化生化配套試劑盒。本實(shí)驗(yàn)室連續(xù)10年均采用廣州陸橋的生化試劑盒作為生化鑒定的方法，從驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，目前還比較滿意，需要注意以下4點(diǎn)。①菌懸液的濃度不要太高，太高容易引起假陽性。②由于各個(gè)生化孔是連在一起的，加液和取放均要小心，避免因加液及晃動(dòng)的過程中引起試劑間的交叉污染，從而造成結(jié)果偏差。③按照說明書進(jìn)行操作并注意額外添加物的添加量及培養(yǎng)時(shí)間。④選擇純培養(yǎng)24 h左右的新鮮菌苔進(jìn)行生化及血清學(xué)試驗(yàn)，因?yàn)榇藭r(shí)的菌落處于活躍期，生化反應(yīng)最為靈敏。

（2）關(guān)于檢測(cè)方法的討論。目前對(duì)沙門氏的檢驗(yàn)有實(shí)時(shí)熒光PCR方法、酶聯(lián)免疫（ELISA）方法、人工培育等方法[4-5]。食品中的微生物需要在一定條件和一定的機(jī)制下產(chǎn)生腸毒素或是代謝產(chǎn)物或是其繁殖生長(zhǎng)到一定的量才能引起人或動(dòng)物的中毒或疾病，這就要求這些病菌具有一定的活性，人工培育的方法檢測(cè)的準(zhǔn)確率是目前各方法中最好的，但需要檢測(cè)人員具有豐富的經(jīng)驗(yàn)，而目前PCR及ELISA方法已經(jīng)得到較好的發(fā)展，但對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求較高，對(duì)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)來說實(shí)現(xiàn)的難度也比較大，因而在有關(guān)致病菌檢測(cè)研究的文章中稱經(jīng)典的細(xì)菌培養(yǎng)方法是致病菌檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)[4]。

3.3 關(guān)于菌體抗原的要點(diǎn)分析

GB 4789.4—2016中要求，血清學(xué)分型為選做項(xiàng)目本次試驗(yàn)不做考究，對(duì)沙門氏血清鑒定中的菌體抗原：首先排除自凝現(xiàn)象，再進(jìn)行相應(yīng)的血清抗原實(shí)驗(yàn)[6]。

（1）O多價(jià)抗原。多數(shù)沙門為O抗原，在O多價(jià)血清中有明顯的沙粒狀凝集現(xiàn)象，如果O多價(jià)不凝也不能輕易放棄，尤其選擇性培養(yǎng)基典型菌落特征明顯，生化現(xiàn)象也符合的情況下，此時(shí)需排除是否因莢膜的原因?qū)е翺多價(jià)不凝，可將菌苔接種在高瓊脂含量的培養(yǎng)基（2%～5%），反復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)，目的因菌株在高瓊脂含量的培養(yǎng)基上，莢膜發(fā)育不良，這樣反復(fù)培養(yǎng)就可以破壞其莢膜，暴露其菌體抗原，本次試驗(yàn)PTC213+BPW+TTB－①號(hào)菌就是這種情況，在接種3%瓊脂含量的培養(yǎng)基做二次純培養(yǎng)后，O多價(jià)血清出現(xiàn)了明顯的凝集現(xiàn)象。

（2）Vi抗原的排除。Vi抗原又稱表面抗原，目前已知的存在Vi抗原的沙門氏有傷寒、丙型副傷寒、都柏林沙門氏菌[7]。當(dāng)Vi抗原存在于細(xì)菌表面，阻止了O多價(jià)血清的凝聚時(shí)，應(yīng)挑取菌苔于1 mL的生理鹽水中制成濃度高的菌懸液，在沸水中煮沸 10～60 min后，再進(jìn)行O多價(jià)血清凝聚實(shí)驗(yàn)。

（3）多價(jià)H抗原。H抗原又稱鞭毛抗原，大部分沙門氏都周身鞭毛，H抗原發(fā)育不良會(huì)造成H抗原血清不凝集，國(guó)標(biāo)中采用接種菌體至半固體中做純培育，使鞭毛生長(zhǎng)良好后再進(jìn)行H抗原的試驗(yàn)，由于血平板營(yíng)養(yǎng)更豐富，本人通過多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)點(diǎn)種哥倫比亞血平板的方法，其鞭毛生長(zhǎng)更加迅速旺盛，試驗(yàn)效果更好。