劉英玉，張 妍，劉俊飛，吾買爾江·牙合甫，張曉紅，姚 剛*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.昌吉天康畜牧科技有限公司，新疆昌吉 831100)

大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)在自然界中廣泛存在，其抗原十分復(fù)雜，且變異性大，肉牛產(chǎn)業(yè)鏈中大腸埃希菌污染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是糞便、飼草料、屠宰加工環(huán)節(jié)，通過鑒定某地區(qū)肉牛產(chǎn)業(yè)鏈中大腸埃希菌的血清型和優(yōu)勢基因型，為該地區(qū)大腸埃希菌病的防治提供科學(xué)數(shù)據(jù)。目前常采用大腸埃希菌O抗原血清來進(jìn)行血清分型，常用的血清學(xué)檢測方法有玻片凝集試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)和ELISA。玻片凝集試驗(yàn)是通過抗血清與抗原發(fā)生凝集反應(yīng)，從而鑒定其血清型。郝彥龍等[1]報(bào)道新疆北疆地區(qū)致犢牛腹瀉大腸埃希菌的優(yōu)勢血清型為O101、O6、O114和O78。不同地域和不同時間段的大腸埃希菌血清型存在差異。表型易受環(huán)境變化而發(fā)生變異，從而給菌株分型鑒定帶來困難，可用基因分型方法獲得指紋圖譜，從而確定菌株之間的親緣關(guān)系。莊孝飛等[2]證實(shí)，腸桿菌基因間重復(fù)共有序列-聚合酶鏈反應(yīng)(Enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR,ERIC-PCR)對不同血清型具有快速、高效分型的優(yōu)勢，同時90株不同來源腸炎沙門菌也闡釋了ERIC-PCR對高同源性血清型菌株亞型分型的局限性。ERIC-PCR對于確定暴發(fā)流行，追蹤傳染源及可能的傳播途徑，確定同一病人反復(fù)感染是源于復(fù)發(fā)或再感染，明確某一菌株與某些臨床表現(xiàn)的相關(guān)性，增強(qiáng)對感染性疾病的流行病學(xué)認(rèn)識等方面有重要意義。本研究對伊犁地區(qū)某規(guī)?；馀ｐB(yǎng)殖場飼草料和糞便及屠宰加工環(huán)節(jié)中分離鑒定的224株大腸埃希菌采用O抗原多價血清進(jìn)行初步檢測，然后對多價4和多價5的大腸埃希菌進(jìn)行單價PCR(O7、O39、O5、O114、O116、O6、O9、O30、O55)的擴(kuò)增，同時進(jìn)行ERIC-PCR的基因分型。從整體上分析伊犁地區(qū)肉牛產(chǎn)業(yè)鏈中牛源大腸埃希菌的優(yōu)勢血清型分布情況，對比分析PCR檢測多價4和多價5大腸埃希菌中血清型和基因分型的存在情況和遺傳關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 大腸埃希菌CICC21530標(biāo)準(zhǔn)株，新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動醫(yī)學(xué)院況玲教授提供；試驗(yàn)菌株224株，均為前期試驗(yàn)[3]分離鑒定所得，其中糞樣中大腸埃希菌164株，飼草料中腸埃希菌48株，屠宰加工環(huán)節(jié)樣品[操作用具(刀、圍裙、手、傳送帶)，胴體表面，牛肉]中大腸埃希菌12株。

1.1.2 主要儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；YJ-875醫(yī)用凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備公司產(chǎn)品；THZ-02型臺式恒溫振蕩器，中國科學(xué)院新疆分院科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；Bio-rad T100梯度PCR儀、移液器、高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；三洋制冰機(jī)，日本三洋有限公司產(chǎn)品；微波爐，廣東美的電器有限公司產(chǎn)品；電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品；凝膠成像儀，美國伯樂公司產(chǎn)品；水平電泳槽、DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑 麥康凱培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；TaqMasterMix、DNA 100 Marker、瓊脂糖等，新疆偉博鑫生物有限公司產(chǎn)品；溴化乙錠(EB)，北京欣經(jīng)科生物技術(shù)公司產(chǎn)品。O抗原多價血清，天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化 大腸埃希菌的檢出率較高，參考GB/T18869—2002和GB/T4789.3—2016進(jìn)行分離，在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂中進(jìn)行鑒定和純化[3]。

1.2.2 玻片凝集試驗(yàn) 制備濃稠菌懸液，采用玻片凝集試驗(yàn)檢測牛源大腸埃希菌分離菌株的21種O抗原多價血清。同時做生理鹽水對照。1 min～2 min內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者為陽性反應(yīng)，呈均勻渾濁者為陰性。

1.2.3 PCR檢測

1.2.3.1 PCR擴(kuò)增引物和試劑 引物參考Atsushi的單價血清PCR引物設(shè)計(jì)方法[4]，參照曹蕓[5]的ERIC-PCR引物設(shè)計(jì)方法，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)，用1×TAE(10 mmol/L Tri-HCl，1 mmol/L EDTA，pH8.0)稀釋引物為使用濃度10 μmol/L或20 μmol/L。

1.2.3.2 PCR檢測 采用煮沸法制備細(xì)菌DNA模板，離心后收集上清。PCR反應(yīng)體系共25 μL：TaqMaster Mix 12.5 μL，上游引物和下游引物各1 μL，細(xì)菌DNA 2 μL，滅菌雙蒸水8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，共35個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物保存于16℃。

ERIC-PCR 反應(yīng)體系25 μL：12.5 μLTaqMaster Mix，1.5 μL 20 μmol/L ERIC1R，1.5 μL 20 μmol/L ERIC2，2 μL模板，7.5 μL滅菌雙蒸水。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min;94℃ 30 s，50 ℃ 1 min，72 ℃ 2min，共35個循環(huán);72 ℃ 10 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。

表1 單價血清PCR引物序列和ERIC-PCR引物序列及擴(kuò)增長度

注：-.無此項(xiàng)內(nèi)容。

Note: -.None of this content.

1.2.3.3 瓊脂糖凝膠電泳 PCR產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，電壓180 V。ERIC-PCR產(chǎn)物于1.5 g/L瓊脂糖凝膠電泳，電壓70 V。凝膠用EB染色，通過凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照并掃描保存。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用Bio Numerics軟件的非加權(quán)配對平均法(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean，UPGMA)對ERIC-PCR指紋圖譜進(jìn)行分析，條件位置差異容許度選擇1.5%，優(yōu)化值1.5%，相似系數(shù)使用Dice系數(shù)(F值)表示。公式為：F=2nxy/(nx+ny)。其中，nx表示菌株X的條帶數(shù)，ny表示菌株Y的條帶數(shù)，nxy表示菌株X和Y相同的電泳條帶數(shù)，F(xiàn)值得數(shù)在0～1之間，值越大則表示同源程度越高。同源度80%以上者為同一亞型，小于80%者為不同的基因亞型[6-7]。

2 結(jié)果

2.1 O抗原多價血清菌株檢測

用大腸埃希菌O抗原多價血清分別檢測糞樣中大腸埃希菌164株、飼草料中大腸埃希菌48株及屠宰加工環(huán)節(jié)樣品中大腸埃希菌12株的血清型，檢測結(jié)果顯示，菌株存在較多的交叉血清型約50余株。有51株未檢出血清型，占O抗原多價血清檢出的18.40%(圖1)。檢測的大腸埃希菌以多價1和多價4、多價5、多價6、多價14、多價15、多價18、多價19的菌株較多，其中多價4、多價5、多價6、多價19均超過5%的檢測率。

圖1 牛源大腸埃希菌多價O抗原血清型的檢出率

2.2 單價血清型PCR擴(kuò)增多價4的檢測

用O7、O39、O5、O114、O116血清型的引物分別擴(kuò)增多價4血清型的16株大腸埃希菌，根據(jù)PCR檢測的目的條帶大小來判定。O7血清型的引物和O39血清型的引物沒有擴(kuò)增出陽性條帶。O5血清型的引物擴(kuò)增出目的條帶大小為566 bp，多價4的菌株中有2株菌(262n、354n)擴(kuò)增出目的條帶大小為566 bp的DNA片段(圖2A)。O114血清型的引物擴(kuò)增出目的條帶大小為553 bp，多價4的菌株中有3株菌(69n、203n、262n)擴(kuò)增出目的條帶大小為553 bp的DNA片段(圖2B)。O116血清型的引物擴(kuò)增出目的條帶大小為156 bp，發(fā)現(xiàn)多價4的菌株中有4株菌(203n、32n、105s、56s)擴(kuò)增出目的條帶大小為156 bp的DNA片段(圖2C)。

2.3 單價血清型PCR擴(kuò)增多價5的檢測

用O6、O9、O30、O55引物分別擴(kuò)增多價O抗原血清O5的22株菌，根據(jù)PCR檢測的目的條帶大小來判定。O6血清型的引物擴(kuò)增出目的條帶大小為783 bp(圖3)，多價5的菌株中有6株菌(262n、220n、73n、28n、354n、69n)擴(kuò)增出目的條帶大小為783 bp的DNA片段。O9血清型的引物擴(kuò)增出目的條帶大小為1 235 bp，多價5的菌株中有2株菌(295n和69n)擴(kuò)增出目的條帶大小為1 235 bp的DNA片段(圖3)。其中菌株69n屬于交叉血清型，同時擴(kuò)增出血清型的O6和O9。O30和O55血清型的引物沒有擴(kuò)增出目的條帶。

2.4 多價4和多價5大腸埃希菌的ERIC-PCR基因分型圖譜

將O抗原多價4和多價5血清型的38株大腸埃希菌進(jìn)行ERIC-PCR擴(kuò)增、電泳。ERIC-PCR指紋圖譜顯示有7株菌株沒有擴(kuò)增出條帶，其他菌株擴(kuò)增出2條～6 條條帶，大小在250 bp～2 000 bp，產(chǎn)生的DNA 指紋圖譜呈現(xiàn)出多態(tài)性(圖4和圖5)。

A.O5;B.O114;C.O116;M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;N.陰性對照;1.354n;2.203n;3.32n;4.105S;5.56S

A.O5;B.O114;C.O116;M.DNA Marker DL 2 000;N.Negetive control；1.354n;2.203n;3.32n;4.105S;5.56S

圖2引物擴(kuò)增的目的條帶

Fig.2 The target bands of primers amplification

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;N.陰性對照;1.295 n;2.354 n

M.DNA Marker DL 2 000;N.Negetive control；1.295 n;2.354 n

圖3血清型O6和O9大腸埃希菌引物擴(kuò)增的目的條帶

Fig.3 The target bands of O6 and O9E.coliserotypes by primers amplification

2.5 多價4和多價5大腸埃希菌的ERIC-PCR基因分型進(jìn)化分析

將產(chǎn)生的DNA指紋圖譜去除6株交叉血清型，通過Bio Numerics軟件繪制成UPGMA聚類樹產(chǎn)生了25種DNA指紋圖，并進(jìn)行遺傳進(jìn)化關(guān)系分析(圖6)。25株多價4和多價5血清型的大腸埃希菌有13種基因型，分成6簇，相似性在59%～100%。同種多價在一個簇，D簇包括12株菌，同源性在70%以上。加工環(huán)節(jié)5-w與糞便72n的同源性為100%，其來源相同菌株。而加工環(huán)節(jié)R-21與其他簇的菌株之間相似性小于40%，其親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

3 討論

在大腸埃希菌O抗原多價血清型檢測過程中，有些菌株的O抗原能夠與O抗原多價血清產(chǎn)生凝集反應(yīng)，且在進(jìn)行O抗原單價血清型的PCR檢測過程中，也存在一些菌株能夠同時擴(kuò)增出多個目的條帶。在鑒定過程中，發(fā)現(xiàn)有些菌株的O抗原能夠與多個單因子血清進(jìn)行凝集反應(yīng)，這和王文豪等[8]報(bào)道的一致。與多個多價血清發(fā)生凝集的菌株可能存在多種表面抗原，且這些表面抗原可能具有某種共同的特性。據(jù)報(bào)道，銀川地區(qū)的奶牛中存在較多O10、O53、O92、O101、O158 血清型的大腸埃希菌，內(nèi)蒙古奶牛場糞便樣品中大腸埃希菌以O(shè)18、O146和O152為優(yōu)勢血清型，新疆北疆地區(qū)致犢牛腹瀉中大腸埃希菌以O(shè)101、O6、O114、O78為優(yōu)勢血清型[1]。伊犁地區(qū)肉牛產(chǎn)業(yè)鏈中大腸埃希菌多價O血清以多價1和多價4、多價5、多價6、多價14、多價15、多價18、多價19為主，不同血清型的大腸埃希菌污染存在差異。其中多價4和多價5的菌株中以O(shè)5、O114、O116、O6和O9血清型為主。與新疆地區(qū)報(bào)道的犢牛腹瀉優(yōu)勢血清型的檢測結(jié)果存在相同血清型，但是個別菌株存在交叉血清型。

ERIC-PCR是目前常用的一種簡便、快速的基因分型技術(shù)，其分辨率較強(qiáng)，結(jié)果可與細(xì)菌分子生物學(xué)分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”PFGE分型有一定相關(guān)性[9-10]。在PFGE、Sau-PCR、ERIC-PCR等方法中，ERIC-PCR花費(fèi)的時間和成本最低，是基層單位進(jìn)行初期溯源分型的首選方法[11]。Warriner K等[12]成功地應(yīng)用ERIC-PCR來追蹤豬肉屠宰加工線上大腸埃希菌的污染源頭。Wang H等[13]也成功地應(yīng)用ERIC-PCR追蹤了雞肉屠宰加工線上沙門菌的污染源頭。高宇等[14]應(yīng)用ERIC-PCR技術(shù)分析了湖北省患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動物分離的91株嗜水氣單胞菌在各個地區(qū)之間的親緣關(guān)系和基因多樣性。本文中部分菌株沒有擴(kuò)增出ERIC-PCR指紋圖譜，Bio Numerics軟件分析多價4和多價5大腸埃希菌的遺傳進(jìn)化關(guān)系呈現(xiàn)多樣性。多價4和多價5大腸埃希菌存在13種基因型，同源性在59%～100%，可以分成6簇。整體上同種多價在一個簇，D簇有12株菌，同源性在70%以上。通過分析可以發(fā)現(xiàn)ERIC-PCR基于基因組上的特定重復(fù)序列能夠很好地把不同來源的大腸埃希菌進(jìn)行區(qū)分和歸類，進(jìn)而達(dá)到溯源的目的。本研究發(fā)現(xiàn)多價4和多價5菌株以O(shè)5、O114、O116、O6和O9的同種血清型的不同菌株其基因型不在一個簇內(nèi)，即某地區(qū)的是同種血清型其基因型存在差異是不同的。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 500； 1～14、16、17.大腸埃希菌多價4血清型的ERIC-PCR指紋圖譜；15.大腸埃希菌檢測出的O157的ERIC-PCR指紋圖譜

M.DNA Marker DL1 500； 1-14,16,17.E.colipolyvalent 4 serotypes of ERIC-PCR fingerprinting;15.O157E.colipolyvalent 4 serotypes of ERIC-PCR fingerprinting

圖4大腸埃希菌O抗原多價4的ERIC-PCR指紋圖譜

Fig.4 ERIC-PCR fingerprint of polyvalent 4 ofE.coliO antigen

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 500； 18～34.大腸埃希菌多價5血清型的ERIC-PCR指紋圖譜

M.DNA Marker DL 1 500;18-34.E.colipolyvalent 5 serotypes of ERIC-PCR fingerprinting

圖5大腸埃希菌O抗原多價5的ERIC-PCR指紋圖譜

Fig.5 ERIC-PCR fingerprint of polyvalent 5 ofE.coliO antigen

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