姜 輝，任維聃，劉桂偉，冶浩鵬，郭慶金，耿學(xué)辰，姜國(guó)勝

(1.河北省滄州市人民醫(yī)院肛腸外科，河北 滄州 061000 2.河北省滄州市中心醫(yī)院結(jié)直腸肛門(mén)外科，河北 滄州 061000)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是一種多發(fā)于40歲以上中老年人的癌癥，由于飲食及生活習(xí)慣的改變，其發(fā)生率逐年上升[1]。因此，尋找與CRC相關(guān)，且可評(píng)估CRC患者預(yù)后的標(biāo)志物尤為關(guān)鍵。微小RNA(microRNA,miRNA)和長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)均是不能編碼蛋白的RNA分子，兩者均可能參與CRC發(fā)生發(fā)展[2,3]。近期報(bào)道顯示，lncRNA腫瘤抑制候選基因7(lncRNA tumor suppressor candidate 7,lncRNA TUSC7)在CRC中呈低表達(dá)，與CRC患者預(yù)后密切相關(guān)[4]；微小RNA-1270(microRNA-1270,miR-1270)在胃癌中表達(dá)上調(diào)，高表達(dá)miR-1270與患者不良預(yù)后相關(guān)，miR-1270可能是診治胃癌的潛在靶標(biāo)[5]?；谏鲜鲅芯?，本文檢測(cè)了miR-1270在CRC組織中的表達(dá)情況，分析其與lncRNA TUSC7、CRC預(yù)后關(guān)系，為臨床診治CRC提供新參考。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2018年6月至2019年1月本院診治的CRC患者130例進(jìn)行研究，年齡42～70歲，平均年齡(58.07±10.66)歲，<60歲67例，≥60歲63例；低分化45例，中、高分化85例；男71例，女59例；浸潤(rùn)深度：T1～T2 78例，T3～T4 52例；病理類(lèi)型：浸潤(rùn)型15例，隆起型26例，潰瘍型89例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例，淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移82例；腫瘤直徑：< 5cm 61例，≥5cm 69例；TNM分期：Ⅲ～Ⅳ期54例，Ⅰ～Ⅱ期76例。本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)本研究，受試者和家屬對(duì)此研究知情同意。CRC患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合CRC診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，經(jīng)病理診斷為原發(fā)性CRC；②患者病例及檢查資料齊全；③入院前未行放化療、靶向治療等抗腫瘤治療；④除CRC外，不伴有其他原發(fā)性腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：①隨訪資料缺失、病理類(lèi)型難以判定者；②合并嚴(yán)重臟器病變者。

1.2方 法

1.2.1lnCAR數(shù)據(jù)庫(kù)檢索:采用lnCAR數(shù)據(jù)庫(kù)(https://lncar.renlab.org/#1st-screen)檢索CRC和正常結(jié)直腸組織中l(wèi)ncRNA TUSC7表達(dá)情況。

1.2.2標(biāo)本收集:收集130例CRC患者行根治性手術(shù)切除的CRC組織、癌旁組織(距腫瘤邊緣≥5 cm)，生理鹽水清洗，立即放入液氮罐(凍存24h)，移至-80℃冰箱。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法檢測(cè)lncRNA TUSC7、miR-1270表達(dá)水平:取出-80℃冰箱儲(chǔ)存的CRC和癌旁組織，無(wú)菌條件下，研缽中研碎，添加Trizol Reagent(簡(jiǎn)石生物技術(shù)有限公司，CT2001)以提取CRC和癌旁組織中的總RNA；使用MultiMACS(TM) cDNA Synthesis Kit(美國(guó)Miltenyi公司，130-094-410)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；最終，應(yīng)用SYBR Green qPCR Master Mix(美國(guó)MCE公司，HY-K0501)、qRT-PCR儀(美國(guó)ABI公司，PRISM?7900HT)擴(kuò)增cDNA，讀取各基因循環(huán)閾值(CT值)。擴(kuò)增參數(shù)：98.4℃預(yù)變性8min；97.6℃變性15s，64.5℃退火10s，68.2℃延伸15s，40個(gè)循環(huán)。GAPDH、U6分別是lncRNA TUSC7、miR-1270的內(nèi)參基因(引物序列見(jiàn)表1)。lncRNA TUSC7、miR-1270相對(duì)表達(dá)量以2-△△CT法計(jì)算。

表1 lncRNA TUSC7 GAPDH miR-1270 U6引物序列

1.2.4生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)lncRNA TUSC7與miR-1270的關(guān)系:使用生物信息學(xué)網(wǎng)站(http://starbase.sysu.edu.cn/)預(yù)測(cè)lncRNA TUSC7與miR-1270間的關(guān)系。

1.3隨訪:以電話、入戶等方式跟蹤隨訪CRC患者6～36個(gè)月，以CRC患者手術(shù)后次日作為隨訪起點(diǎn)，隨訪截至CRC患者死亡或2022年1月。

2 結(jié) 果

2.1lnCAR數(shù)據(jù)庫(kù)中CRC組織與正常結(jié)直腸組織lncRNA TUSC7表達(dá)水平比較:lnCAR數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，CRC組織lncRNA TUSC7表達(dá)水平較正常結(jié)直腸組織降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 lnCAR數(shù)據(jù)庫(kù)中CRC和正常結(jié)直腸組織中l(wèi)ncRNA TUSC7表達(dá)水平比較

2.2癌旁和CRC組織中l(wèi)ncRNA TUSC7、miR-1270表達(dá)水平比較:CRC組織中l(wèi)ncRNA TUSC7表達(dá)水平較癌旁組織降低(P<0.05)，miR-1270表達(dá)水平較癌旁組織升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 癌旁/CRC組織中l(wèi)ncRNA TUSC7 miR-1270表達(dá)水平比較

2.3CRC組織lncRNA TUSC7、miR-1270表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系:以CRC組織lncRNA TUSC7、miR-1270表達(dá)水平的中位數(shù)(0.39、2.67)為界值，以低于lncRNA TUSC7、miR-1270表達(dá)水平中位數(shù)的CRC患者為lncRNA TUSC7低表達(dá)組(66例)、miR-1270低表達(dá)組(62例)，以高于或等于lncRNA TUSC7、miR-1270表達(dá)水平中位數(shù)的CRC患者為lncRNA TUSC7高表達(dá)組(64例)、miR-1270高表達(dá)組(68例)。結(jié)果顯示，CRC組織lncRNA TUSC7、miR-1270表達(dá)水平與年齡、病理類(lèi)型、性別、腫瘤直徑無(wú)關(guān)(P>0.05)，與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度、分化程度、TNM分期相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 CRC組織lncRNA TUSC7 miR-1270表達(dá)水平與臨床病理特征關(guān)系n(%)

2.4CRC組織中l(wèi)ncRNA TUSC7表達(dá)水平與miR-1270的相關(guān)性:Pearson法分析顯示，CRC組織中l(wèi)ncRNA TUSC7表達(dá)水平與miR-1270呈負(fù)相關(guān)(r=-0.578，P<0.05)，見(jiàn)圖2；生物信息學(xué)分析顯示，lncRNA TUSC7與miR-1270存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖3。

2.5CRC組織lncRNA TUSC7、miR-1270表達(dá)水平與CRC患者預(yù)后的關(guān)系:跟蹤隨訪CRC患者6～36個(gè)月，死亡45例，生存85例。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，lncRNA TUSC7低表達(dá)組平均生存時(shí)間為27.77個(gè)月(95%CI：25.53～30.02)，短于lncRNA TUSC7高表達(dá)組平均生存時(shí)間34.34個(gè)月(95%CI：23.10～35.59)，log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示，lncRNA TUSC7低表達(dá)組、lncRNA TUSC7高表達(dá)組累積生存率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=30.459，P=0.000)，見(jiàn)圖4；miR-1270低表達(dá)組平均生存時(shí)間為33.90個(gè)月(95%CI：32.54～35.27)，長(zhǎng)于miR-1270高表達(dá)組平均生存時(shí)間28.37個(gè)月(95%CI：26.15～30.58)，log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-1270低表達(dá)組與miR-1270高表達(dá)組累積生存率相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.172，P=0.000)，見(jiàn)圖5。

圖2 CRC組織中l(wèi)ncRNA TUSC7表達(dá)水平與miR-1270的相關(guān)性

圖3 生物信息學(xué)分析lncRNA TUSC7與miR-1270的靶向結(jié)合位點(diǎn)

圖4 CRC組織lncRNA TUSC7表達(dá)水平與CRC患者預(yù)后的關(guān)系

圖5 CRC組織miR-1270表達(dá)水平與CRC患者預(yù)后的關(guān)系

3 討 論

CRC患者可出現(xiàn)便血、大便性狀變化、腹痛等癥狀，臨床多以手術(shù)治療CRC為主，但治療效果不容樂(lè)觀，CRC患者預(yù)后較差[7]。因此，尋找與CRC有關(guān)的生物學(xué)靶點(diǎn)，對(duì)及時(shí)有針對(duì)性干預(yù)，提高CRC患者治愈率，降低病死率有積極意義。

lncRNA作為一類(lèi)非編碼RNA，其雖不可編碼蛋白，但可調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響CRC等癌癥細(xì)胞增殖、凋亡，參與機(jī)體免疫逃逸等過(guò)程[8]。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA TUSC7在食管鱗癌中表達(dá)下調(diào)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，lncRNA TUSC7有望成為診治食管鱗癌的分子靶標(biāo)[9]；另外，Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)lncRNA TUSC7可抑制CRC細(xì)胞增殖、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)，lncRNA TUSC7在CRC發(fā)展中起抑癌作用。本研究顯示，CRC組織中l(wèi)ncRNA TUSC7表達(dá)水平較低，與lnCAR數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果及曹珊珊等[4]研究趨勢(shì)一致，提示lncRNA TUSC7可能與CRC病理發(fā)展相關(guān)。本文中CRC組織lncRNA TUSC7表達(dá)水平與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度、分化程度、TNM分期相關(guān)，提示lncRNA TUSC7可能與CRC嚴(yán)重程度有關(guān)，檢測(cè)CRC組織lncRNA TUSC7表達(dá)水平有助于臨床判斷CRC患者病情，對(duì)制定針對(duì)CRC患者的干預(yù)方案甚是有利。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA TUSC7低表達(dá)組CRC患者平均生存時(shí)間、累積生存率短于、低于lncRNA TUSC7高表達(dá)組，提示lncRNA TUSC7可能與CRC患者預(yù)后密切相關(guān)，lncRNA TUSC7表達(dá)水平越低，CRC患者預(yù)后越差，lncRNA TUSC7可輔助臨床判定CRC患者預(yù)后情況。分析可能原因，lncRNA TUSC7可能通過(guò)與靶基因結(jié)合進(jìn)而影響CRC細(xì)胞EMT、增殖、侵襲，從而影響CRC發(fā)展進(jìn)程，顯示出其與CRC患者TNM分期等臨床特征、預(yù)后相關(guān)[10]。

miRNA是一類(lèi)短鏈非編碼RNA，其可參與肝細(xì)胞癌、CRC等癌細(xì)胞異常增殖，調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，介導(dǎo)自噬，影響肝細(xì)胞癌、CRC等疾病發(fā)生發(fā)展[11]。近期報(bào)道顯示，miR-1270在食管癌、肝細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)，且miR-1270可能是診治食管癌、肝細(xì)胞癌的潛在靶標(biāo)[12,13]。而miR-1270在甲狀腺乳頭狀癌、膀胱癌中呈高表達(dá)，miR-1270在甲狀腺乳頭狀癌、膀胱癌中發(fā)揮促癌作用[14,15]。以上研究表明，miR-1270在不同腫瘤中的作用不同。本文中CRC組織miR-1270表達(dá)水平較高，與其在胃癌中的趨勢(shì)相同，提示miR-1270可能參與CRC發(fā)生發(fā)展，miR-1270可能是診治CRC的分子靶點(diǎn)。進(jìn)一步研究顯示，處于Ⅲ～Ⅳ期、T3～T4浸潤(rùn)深度、低分化，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CRC患者中miR-1270高表達(dá)患者占比較高，表明miR-1270可能與CRC發(fā)展程度相關(guān)，miR-1270有望成為評(píng)估CRC嚴(yán)重程度的標(biāo)志物。另外，本研究顯示，miR-1270低表達(dá)組CRC患者平均生存期、累積生存率長(zhǎng)于高于miR-1270高表達(dá)組，表示CRC組織中miR-1270表達(dá)水平越高，CRC患者發(fā)生不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)越大，miR-1270有望成為臨床評(píng)估CRC患者預(yù)后的潛在指標(biāo)。推測(cè)，miR-1270可能通過(guò)促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖、EMT，抑制CRC細(xì)胞凋亡，進(jìn)而在CRC發(fā)生發(fā)展中起促進(jìn)作用，從而顯示出miR-1270與CRC患者TNM分期等臨床特征、預(yù)后關(guān)系緊密[5]。

此外，生物信息學(xué)分析顯示，lncRNA TUSC7與miR-1270存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，故本文探討了CRC組織中l(wèi)ncRNA TUSC7表達(dá)水平與miR-1270相關(guān)性，結(jié)果顯示，lncRNA TUSC7表達(dá)水平與miR-1270呈負(fù)相關(guān)，提示lncRNA TUSC7可能與miR-1270共同影響CRC病理變化，推測(cè)lncRNA TUSC7可能與miR-1270靶向結(jié)合，進(jìn)而影響CRC細(xì)胞增殖、EMT等惡性生物學(xué)行為，從而協(xié)同影響CRC發(fā)展過(guò)程。

綜上，CRC組織中l(wèi)ncRNA TUSC7表達(dá)水平較低，miR-1270表達(dá)水平較高，二者呈負(fù)相關(guān)，且lncRNA TUSC7、miR-1270均與TNM分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、預(yù)后等顯著相關(guān)，為臨床診治CRC、判定CRC患者預(yù)后提供新方向。但本研究樣本有限，后期將延長(zhǎng)隨訪時(shí)間，擴(kuò)大樣本，從多角度探究lncRNA TUSC7、miR-1270與CRC的關(guān)系，以增加實(shí)驗(yàn)可靠性。