翟恒鈺，李文海，黨 乙，張 梁

(1.西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院胸腔外科，陜西 西安 710000 2.西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院胸外科，陜西 西安 710038)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是最常見的肺癌類型。盡管臨床治療方面取得了進(jìn)展，但預(yù)后仍然很差[1]。因此，闡明NSCLC的分子機(jī)制至關(guān)重要。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)被報(bào)道與致癌作用之間的關(guān)系密切[2]。肺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄物1(Lung cancer associated transcript 1,LUCAT1)是一種在NSCLC中上調(diào)的lncRNA[3]，但其潛在機(jī)制仍不清楚。已知，lnRNA可以充當(dāng)微小RNA(microRNA，miRNA)的海綿，抑制其對靶mRNA的調(diào)控[4]。鑒于本研究旨在闡明LUCAT1影響NSCLC進(jìn)展的機(jī)制，故經(jīng)生物學(xué)預(yù)測了與LUCAT1結(jié)合的miR-493-5p，同時(shí)篩選出了miR-493-5p的靶基因RAC1。另外，miR-493-5p可抑制NSCLC細(xì)胞的增殖和侵襲[5]。因此，推測LUCAT1可能通過靶向miR-493-5p并調(diào)控RAC1來影響NSCLC的進(jìn)展。

1 材料與方法

1.1材料:臨床樣本：從2019年9月至2020年9月在本院接受手術(shù)切除的NSCLC患者(年齡44～72歲：男性患者16例，女性患者14例)中獲得30例NSCLC組織和配對的相鄰正常肺組織。所有納入的患者在標(biāo)本采集前均未接受化療或放療。所有參與者在樣本采集前簽署知情同意書。在手術(shù)過程中收集的樣品在液氮中快速冷凍保存。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理與研究委員會(huì)批準(zhǔn)。細(xì)胞與主要試劑：正常人肺HBE、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H460、H520、A549和H1299細(xì)胞(均上海雅吉)；12只雌性BALA/c裸鼠(6～8周齡，18～22g)購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號：生產(chǎn)許可SCXK(滬)2018-0004；DEME培養(yǎng)基(上海欽誠生物)；雙熒光素酶報(bào)告基因(Dual luciferase reporter gene，DLRG)測試盒(SLDL)(北京Bioassay)；靶向LUCAT1(sh-LUCAT1)的短發(fā)夾RNA和其陰性對照(sh-NC)、miR-493-5p抑制劑(in-miR-493-5p)、miR-493-5p模擬物(miR-493-5p)和其陰性對照(miR-NC)以及RAC1過表達(dá)質(zhì)粒(RAC1)(均上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司)；Lipofectamine 3000(美國Invitrogen)；TRIzol試劑(上海信帆生物公司)；cDNA合成試劑盒(德國Roche)；SYBR Green Master Mix(美國Omege)；RIPA緩沖液(蘇州Amresco)；一抗RAC1和GAPDH(Abcam公司)；CCK-8試劑盒(武漢Abbkine)；Annexin V-FITC/PI試劑盒(上海Bioplatform)；Transwell和Matrigel(美國Corning)。

1.2方 法

1.2.1細(xì)胞的分組與處理：將A549細(xì)胞分為：對照(Control)組、sh-NC組、sh-LUCAT1組、sh-LUCAT1+in-miR-493-5p組和sh-LUCAT1+RAC1組。使用Lipofectamine 3000將sh-NC、sh-LUCAT1、in-miR-493-5p和RAC1分別轉(zhuǎn)入對應(yīng)組的A549細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2RT-qPCR檢測mRNA表達(dá)水平：用TRIzol試劑從組織和細(xì)胞中獲取RNA。通過cDNA合成試劑盒將2g RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-qPCR用SYBR Green Master Mix在ABI PRISM 7500PCR系統(tǒng)上進(jìn)行。GAPDH和U6分別作為對照基因?；蛞锏男蛄腥缦拢篖UCAT1引物：5'-AGCTCCACCTCCCGGGTTCACG-3'(正向)和5'-CGTGAACCCGGGAGGTGGAGCT-3'(反向)；miR-493-5p引物：5′-GCCGAGTTGTACATGGTAGG-3′(正向)和5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′(反向)；RAC1引物：5'-CTACCCGCAGACAGACGTG-3'(正向)和5'-AGATCAAGCTTCGTCCCCAC-3'(反向)；GAPDH引物：5′-CCACATCGCTCAGACACCAT-3′(正向)和5′-TGACAAGCTTCCCGTTCTCA-3′(反向)；U6引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′(正向)和5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′(反向)。

1.2.3DLRG檢測RAC1和miR-493-5p之間的關(guān)系：使用starBase在線軟件預(yù)測靶向LUCAT1的miRNA，miR-493-5p被預(yù)測為直接靶向LUCAT1的miRNA。隨后，利用TargetScan在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測了miR-493-5p的蛋白靶點(diǎn)，預(yù)測RAC1可能是miR-493-5p的推定蛋白靶標(biāo)。野生型(WT)或突變型(MUT)LUCAT1被亞克隆到pmiR-RB-Report載體中，構(gòu)建LUCAT1 WT或LUCAT1 MUT。隨后，通過Lipofectamine 3000將其分別與miR-493-5p或miR-NC共轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中。48h后通過DLRG測試盒對熒光素酶活性進(jìn)行測定。RAC1和miR-493-5p之間的相互作用也使用此方法進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.4Western blot檢測RAC1蛋白水平：通過冰溶的RIPA緩沖液裂解細(xì)胞，獲得蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)使用SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)到PVDF膜上。使用5%脫脂牛奶封閉2.5h后，將PVDF膜與抗體RAC1和GAPDH(稀釋比例1∶1 000)4℃孵育過夜。第2天，將膜與二抗在室溫下孵育2h，使用化學(xué)發(fā)光法對PVDF膜上的蛋白印跡進(jìn)行成像。并使用Image J軟件對蛋白印跡進(jìn)行量化。

1.2.5CCK-8檢測細(xì)胞增殖：進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)和集落形成實(shí)驗(yàn)以評估細(xì)胞增殖能力。對于CCK-8測定，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞重懸于DEME培養(yǎng)基后接種在96孔板(3×103個(gè)/孔)，48h后加入CCK-8溶液，2h后通過SpectraMax iD3多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices)測量450nm處吸光光度值(absorbance，A)。對于集落形成分析，將1×103個(gè)細(xì)胞接種在6孔板上并連續(xù)孵育14d，使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞集落，并用1%結(jié)晶紫染色。在CX41光學(xué)顯微鏡下觀察并手動(dòng)計(jì)數(shù)細(xì)胞集落數(shù)量(>50個(gè)細(xì)胞被認(rèn)為是一個(gè)集落)。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種在96孔板(3×103個(gè)/孔)，48h后分別用10μL FITC標(biāo)記的Annexin V和10 μL PI在黑暗下孵育20min。之后，用BD FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀檢測，通過Flowjo軟件分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲：關(guān)于侵襲測定，Transwell的上室表面涂有50mg/L的Matrigel并在4℃下風(fēng)干，將2×105個(gè)細(xì)胞(無血清DEME培養(yǎng)基重懸)添加到上室中，下室中補(bǔ)充含5%血清的DEME培養(yǎng)基。孵育48h后，將細(xì)胞在室溫下用結(jié)晶紫染色20min。通過光學(xué)顯微鏡拍照并對視野中可見細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。而遷移除了使用不含有Matrigel的Transwell小室，其余方法流程相同。

1.2.8腫瘤異種移植分析LUCAT1對體內(nèi)腫瘤生長的影響：將用sh-NC或sh-LUCAT1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞(2×106個(gè))皮下注射到裸鼠的左側(cè)(每組6只裸鼠)。4周后麻醉裸鼠，采集腫瘤組織稱重，并測量體積。RT-qPCR檢測LUCAT1、miR-493-5p和RAC1 mRNA表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1LUCAT1、miR-493-5p、RAC1在NSCLC組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平：見表1，與相鄰正常肺組織相比，NSCLC組織中LUCAT1和RAC1 mRNA表達(dá)上調(diào)，miR-493-5p表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。圖1顯示，NSCLC組織中miR-493-5p與LUCAT1、RAC1 mRNA均具有負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，而LUCAT1與RAC1 mRNA呈正相關(guān)(P<0.05)。與正常肺HBE細(xì)胞系相比，NSCLC細(xì)胞系表現(xiàn)出顯著上調(diào)的LUCAT1和RAC1 mRNA水平，同時(shí)miR-493-5p水平顯著下調(diào)(P<0.05)。鑒于NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549中LUCAT1表達(dá)最高，故后續(xù)均選擇A549細(xì)胞作為LUCAT1在NSCLC中的調(diào)控機(jī)制的研究對象，見表2。

表1 NSCLC組織中LUCAT1 miR-493-5p和RAC1

表2 NSCLC細(xì)胞中LUCAT1 miR-493-5p和RAC1

2.2LUCAT1競爭性結(jié)合miR-493-5p調(diào)控RAC1表達(dá)：圖2、表3顯示，轉(zhuǎn)染LUCAT1-WT后，miR-493-5p模擬物顯示出顯著抑制熒光素酶活性(P<0.05)，然而，轉(zhuǎn)染LUCAT1-MUT時(shí)，miR-493-5p模擬物未顯示出熒光素酶活性變化(P>0.05)。圖3、表4顯示在A549細(xì)胞系中沉默LUCAT1后，可顯著升高miR-493-5p表達(dá)，降低RAC1的表達(dá)(P<0.05)，然而在sh-LUCAT1+in-miR-493-5p組和sh-LUCAT1+RAC1組A549細(xì)胞中LUCAT1的表達(dá)無明顯變化(P>0.05)。

圖1 LUCAT1、miR-493-5p和RAC1 mRNA在NSCLC組織中相關(guān)性分析

圖2 生物信息學(xué)預(yù)測miR-493-5p與LUCAT1或RAC1結(jié)合位點(diǎn)

圖3 Western blot檢測RAC1蛋白水平

2.3LUCAT1調(diào)節(jié)miR-493-5p/RAC1軸對NSCLC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響：圖4、表5所示，與sh-NC組相比，sh-LUCAT1組A549細(xì)胞增殖、侵襲明顯受損，此外，LUCAT1的沉默增加了A549細(xì)胞凋亡(P<0.05)。與sh-LUCAT1組相比，抑制miR-493-5p或過表達(dá)RAC1可部分消除沉默LUCAT1對A549細(xì)增殖、侵襲的損傷，并降低了沉默LUCAT1對A549細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用(P<0.05)。

表3 DLRG實(shí)驗(yàn)檢測miR-493-5p與LUCAT1或RAC1相互作用關(guān)系

表4 各組細(xì)胞中LUCAT1 miR-493-5p和RAC1表達(dá)分析

表5 LUCAT1調(diào)節(jié)miR-493-5p/RAC1軸對NSCLC細(xì)胞增殖凋亡和侵襲的影響

圖4 LUCAT1調(diào)節(jié)miR-493-5p/RAC1軸對NSCLC細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響

圖5 注射4周后裸鼠中腫瘤組織代表性圖片

2.4LUCAT1沉默抑制體內(nèi)NSCLC腫瘤生長：圖5、表6實(shí)驗(yàn)表明，與sh-NC組相比，sh-LUCAT1組腫瘤體積和重量顯著減少(P<0.05)。此外，與sh-NC組相比，sh-LUCAT1組腫瘤組織中LUCAT1和RAC1 mRNA表達(dá)降低，而miR-493-5p表達(dá)增加(P<0.05)。

表6 LUCAT1對體內(nèi)NSCLC腫瘤生長的影響

3 討 論

近年來，許多研究揭示了lncRNA在調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和凋亡以及人類癌發(fā)生和發(fā)展等眾多生理和病理過程中的基本作用。目前，人們普遍認(rèn)為許多l(xiāng)ncRNA參與了NSCLC的進(jìn)展[6,7]，然而大多數(shù)lncRNA在NSCLC中的確切生物學(xué)功能和機(jī)制仍不清楚。

位于5號染色體14.3區(qū)的LUCAT1首次在吸煙相關(guān)的肺癌中被發(fā)現(xiàn)，與吸煙相關(guān)的NSCLC預(yù)后不良有關(guān)[8]。據(jù)報(bào)道，LUCAT1在胃癌中的表達(dá)水平與腫瘤直徑、組織分化等級以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)相關(guān)，促進(jìn)胃癌發(fā)展[9]。LUCAT1在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中高表達(dá)，并通過miR-375/YAP1軸促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[10]。以上研究說明，LUCAT1在人類癌中的生物學(xué)作用和機(jī)制在很大程度上是未知的。本研究旨在探討LUCAT1在NSCLC中的確切作用和潛在機(jī)制。首先，觀察到LUCAT1表達(dá)在臨床NSCLC組織和細(xì)胞系中上調(diào)。其次，評估了LUCAT1沉默對體外NSCLC細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲以及體內(nèi)腫瘤生長的生物學(xué)效應(yīng)。一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LUCAT1沉默抑制了LUCAT1的體外細(xì)胞惡性行為，且抑制了體內(nèi)腫瘤生長。

一些研究表明，lncRNA作為天然的海綿通過與miRNA相互作用以消除miRNA的抑制活性[11,12]。在本研究中，為了探索LUCAT1在NSCLC發(fā)展中的潛在機(jī)制，研究了LUCAT1的靶miRNA。使用生物信息學(xué)方法預(yù)測，miR-493-5p包含LUCAT1的結(jié)合位點(diǎn)。研究顯示，circ_PIP5K1A通過海綿化miR-493-5p上調(diào)ROCK1表達(dá)以促進(jìn)NSCLC中的順鉑耐藥和癌進(jìn)展[13]；推測LUCAT1海綿化miR-493-5p促進(jìn)NSCLC進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，miR-493-5p在NSCLC中低表達(dá)，且與LUCAT1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。DLRG分析證實(shí)了LUCAT1和miR-493-5p相互結(jié)合，并且miR-493-5p的表達(dá)因LUCAT1沉默而增強(qiáng)。此外，抑制miR-493-5p減弱了LUCAT1沉默對NSCLC細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響。這些數(shù)據(jù)表明LUCAT1可能以miR-493-5p依賴性方式促進(jìn)NSCLC的發(fā)展。在本研究中，發(fā)現(xiàn)RAC1被miR-493-5p直接靶向。本研究證實(shí)了LUCAT1通過海綿化miR-493-5p來調(diào)節(jié)RAC1的表達(dá)。此外，過表達(dá)RAC1可部分逆轉(zhuǎn)LUCAT1沉默對NSCLC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。這些數(shù)據(jù)表明，LUCAT1通過調(diào)節(jié)miR-493-5p/RAC1軸來影響NSCLC細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲。

目前的結(jié)果表明LUCAT1在NSCLC中高表達(dá)，其下調(diào)抑制了NSCLC的惡性活動(dòng)。在機(jī)制上，LUCAT1與miR-493-5p競爭性結(jié)合并調(diào)節(jié)RAC1表達(dá)。本研究為NSCLC的靶向治療提供了新的見解，并為探究NSCLC中l(wèi)ncRNA-miRNA-mRNA的機(jī)制提供參考。