于昌盛，方 芳，陳劍平，董斌兵，李 琴，楊二龍

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 甲乳外科，安徽 蕪湖 241001)

在女性癌癥相關(guān)死亡病因中，乳腺惡性腫瘤位居第二[1]。近年來(lái)，乳腺癌的病死率一直在降低，但是乳腺癌的有效治療仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)[2]。microRNA是一種典型的內(nèi)源性非編碼RNA，大量實(shí)驗(yàn)表明，microRNA在腫瘤的血管生成的調(diào)節(jié)中起著重要作用[3]，miR-375引導(dǎo)自噬作用在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到不可忽視的調(diào)控作用[4-5]。本研究旨在探索miR-375在乳腺癌組織、癌旁組織中的表達(dá)差異與臨床一些預(yù)后指標(biāo)的相關(guān)性及對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖功能的影響，為乳腺癌患者的治療提供有價(jià)值的參考，并探索更為有效的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng) 所有細(xì)胞株均購(gòu)自美國(guó)菌種保存中心，使用DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))繁殖人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MDAMB-468，并且添加10%胎牛血清(Gibco，美國(guó))，使用DMEM培養(yǎng)基，其包含：氫化可的松(0.5 μg/mL)、馬血清(5%)、表皮生長(zhǎng)因子(20 ng/mL)、霍亂毒素(100 ng/mL)及胰島素(10 μg/mL)，繁殖人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF10A，細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程均在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行。

1.2 組織標(biāo)本 收集2018年6月1日～2019年6月1日 弋磯山醫(yī)院甲乳外科經(jīng)病理證實(shí)的乳腺癌患者45例，且均獲取癌組織(實(shí)驗(yàn)組)及作為對(duì)照組的癌旁組織。前期存放于-196℃液氮罐中，標(biāo)本存儲(chǔ)于標(biāo)本庫(kù)，并妥善保管?；颊邔?shí)施手術(shù)之前均未進(jìn)行新輔助治療。術(shù)前與患者及家人充分溝通，簽署知情同意書。該研究獲醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批。

1.3 液氮中取乳腺癌組織及癌旁組織 冷凍標(biāo)本，恢復(fù)室溫，組織研磨儀研磨后，通過(guò)Trizol試劑提取目標(biāo)組織內(nèi)的RNA，測(cè)定RNA濃度，通過(guò)RNA完成標(biāo)準(zhǔn)化的逆轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而獲取符合要求的cDNA，以此為基礎(chǔ)明確miR-375的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其下游引物：5′-ATCGAAGCTTACGCCTTGGAGCTTGTCC-3′，相應(yīng)的上游引物：5′-ATCGCTCGAGACAGACCCTGCTAAGCGACTC-3′；相關(guān)條件為：95℃ 10 min；95℃ 2 s；60℃ 20 s；70℃ 10 s；95℃ 15 s；60℃ 60s；95℃ 1 s，總共涉及到40個(gè) 循環(huán)。U6下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，上游引物：5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACATAT-3′。在反應(yīng)完成之后進(jìn)行確認(rèn)，以得到的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)繪制變量曲線，3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后，以U6 為內(nèi)參，獲取的數(shù)據(jù)結(jié)合2-ΔΔCt展開(kāi)計(jì)算和分析。miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、引物、熒光定量PCR試劑盒(廣州市銳博生物科技有限公司)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 人miR-375模擬物(miR-375 mimic)和陰性對(duì)照模擬物(NC mimic)，riboFECTTMCP轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)于廣州市銳博生物科技有限公司。提前24 h將MDA-MB-231和MDAMB-468細(xì)胞接種到6孔板中，根據(jù)說(shuō)明書使用轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。

1.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)細(xì)胞增殖的具體表現(xiàn)，過(guò)程中使用CCK8試劑盒(上海翌圣生物科技，中國(guó))。轉(zhuǎn)染目標(biāo)細(xì)胞24 h，消化后接種到96孔板中(2 000個(gè)/孔),細(xì)胞出現(xiàn)貼壁后，將10 μL的CCK8試劑加到每孔的細(xì)胞中，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光生長(zhǎng)2 h，在450 nm波長(zhǎng)下使用酶標(biāo)儀檢測(cè)的吸光度(OD)?？寺⌒纬蓹z測(cè)細(xì)胞增殖水平。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h，消化后接種到6孔板中(1 000個(gè)/孔)，培養(yǎng)10 d后去掉培養(yǎng)基，多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色15 min，PBS吹洗3次后拍照保存。

2 結(jié)果

2.1 miR-375在乳腺癌組織及癌旁組織、乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá) 熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織(1.130±0.067)低于癌旁組織的miR-375表達(dá)(2.180±0.123)(t=7.470，P<0.001)，見(jiàn)圖1A。miR-375在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MDAMB-468中的表達(dá)水平較低(P<0.001)，見(jiàn)圖1B。提示miR-375在乳腺癌中可能起到了抑制作用。

A.兩類組織內(nèi)(乳腺癌組織、癌旁組織)的miR-375表達(dá)差異(***P<0.001)；B.MDA-MB-231、MDAMB-468和MCF10A中的miR-375表達(dá)差異(F=118.000，P=0.000；***P<0.001)。

2.2 miR-375的表達(dá)情況與該癌癥臨床病理之間的關(guān)聯(lián) miR-375的表達(dá)與患者的腫瘤直徑、年齡、組織學(xué)分級(jí)、HR和Her-2狀態(tài)無(wú)關(guān)聯(lián)性(P>0.05)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在關(guān)聯(lián)性(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同臨床病理參數(shù)與乳腺癌患者miR-375的表達(dá)

2.3 miR-375在癌組織的表達(dá)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目的關(guān)系 miR-375在癌組織的表達(dá)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目無(wú)關(guān)聯(lián)性(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目與miR-375的表達(dá)

2.4 miR-375抑制乳腺癌細(xì)胞增殖 NC和miR-375 mimic轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MDA-MB-468進(jìn)行比較，熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-375 mimic組與對(duì)照組相比其miR-375表達(dá)均分別增加(t=15.348，P<0.01；t=17.969，P<0.01)，見(jiàn)圖2A。CCK-8法顯示，轉(zhuǎn)染后的miR-375 mimic組乳腺癌細(xì)胞的增殖能力均弱于NC組(P<0.01)，見(jiàn)圖2B?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-375 mimic組中的乳腺癌細(xì)胞克隆數(shù)目減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.260，P<0.01；t=8.084，P<0.01)，見(jiàn)圖2C。

A.RT-qPCR檢測(cè)miR-375在miR-375 mimic組與對(duì)照組乳腺癌細(xì)胞中的差異(**P<0.01)；B.CCK-8法 miR-375 mimic組與對(duì)照組的細(xì)胞增殖能力的分析對(duì)比(***P<0.001) ；C.克隆形成實(shí)驗(yàn)對(duì)比miR-375 mimic組與對(duì)照組的細(xì)胞增殖能力(**P<0.01)。

3 討論

研究證實(shí)，miR-375位于14號(hào)染色體上，是非常具有代表性的單鏈短序列小RNA，其總共涵蓋19～25個(gè)核苷酸序列，不具有編碼蛋白質(zhì)的作用，大量涵蓋于真核細(xì)胞內(nèi)，在進(jìn)化方面表現(xiàn)出較強(qiáng)的保守性，miRNA不能與之對(duì)應(yīng)的靶mRNA的3′非編碼區(qū)相互配對(duì)，進(jìn)而導(dǎo)致靶mRNA出現(xiàn)一定的降解，在轉(zhuǎn)錄過(guò)程完成之后，與靶基因存在負(fù)調(diào)控的關(guān)系[6]。

miR-375與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Yang等研究發(fā)現(xiàn)miR-375通過(guò)阻斷索拉非尼誘導(dǎo)的自噬作用，使肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼敏感降低，ATG14是miR-375的直接自噬相關(guān)靶點(diǎn)[7]。有研究表明，對(duì)37例小腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤手術(shù)患者的42個(gè)腫瘤進(jìn)行了miRNA譜分析，發(fā)現(xiàn)miR-375的下調(diào)可改變Wnt信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，生存分析顯示miR-375的下調(diào)與總生存期縮短相關(guān)，可作為預(yù)后生物標(biāo)志物[8]。一項(xiàng)臨床標(biāo)本的研究發(fā)現(xiàn)，在食道癌患者中，miR-375出現(xiàn)高表達(dá)，其生存率往往高于miR-375低表達(dá)的患者，通過(guò)下調(diào)的miR-375可明顯促進(jìn)食道癌細(xì)胞增殖及集落形成，促進(jìn)食道癌的進(jìn)展[9]。miR-375也在腎透明細(xì)胞癌進(jìn)展中發(fā)揮腫瘤抑制作用，部分通過(guò)調(diào)節(jié)YWHAZ。本研究擴(kuò)展了miR-375的抗腫瘤特性，并支持其作為治療中潛在治療靶點(diǎn)的作用[10]。

我們查閱相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，miR-375可能與患者內(nèi)分泌治療耐藥緊密聯(lián)系，通過(guò)聯(lián)合抑制EGFR和c-ABL可以抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，miR-375在其過(guò)程調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬作用[11]。有細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明miR-375是乳腺中一個(gè)重要的癌基因，EZH2是其上游調(diào)節(jié)因子，而FOXO1是miR-375的下游靶mRNA，通過(guò)介導(dǎo)STAT3的甲基化和激活p53信號(hào)通路以抑制癌細(xì)胞的增殖[12]。Ali等對(duì)絕經(jīng)前后的婦女血液樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miRNA-182和miRNA-375可以作為潛在的無(wú)創(chuàng)性標(biāo)記物用于乳腺癌患者的隨訪[13-14]。上述結(jié)果仍有爭(zhēng)論，僅停留在細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，沒(méi)有對(duì)組織學(xué)進(jìn)行研究。本研究結(jié)果表明，miR-375在癌旁組織內(nèi)的表達(dá)水平相對(duì)較高，而且其超過(guò)乳腺癌組織內(nèi)的表達(dá)水平。這表明miR-375 也可能發(fā)揮抑制癌癥發(fā)展的作用。

我們?cè)跓晒舛縋CR檢測(cè)乳腺癌和正常組織內(nèi)miRNAs的表達(dá)程度之后，得到的結(jié)果表明該物質(zhì)在乳腺癌組織內(nèi)的表達(dá)水平為1.130±0.067，癌旁組織中為2.180±0.123，兩者比較差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。提示乳腺癌發(fā)生與miR-375存在關(guān)聯(lián)性，乳腺癌組織內(nèi)miR-375表達(dá)顯著低于癌旁組織，我們可以分析出在乳腺癌某靶基因演變進(jìn)程中miR-375能夠起到特定的生物學(xué)作用，然而其機(jī)理還尚待進(jìn)一步探究。本研究中乳腺癌miR-375表達(dá)水平與患者病理特征關(guān)系存在一定聯(lián)系，但與患者年齡、激素受體、腫瘤體積、病理級(jí)別無(wú)明顯的關(guān)聯(lián)性。不同的是Cheng等[15]的研究表明通過(guò)檢測(cè)miR-375的表達(dá)與ER-Q陽(yáng)性有相關(guān)性，且miR-375的表達(dá)可以區(qū)分患者有無(wú)局部復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。分別對(duì)其陽(yáng)性、陰性及不同組之間進(jìn)行miR-375表達(dá)水平的差異分析，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、人類表皮生長(zhǎng)因子受體-2(HER2)存在著明顯差異。通過(guò)數(shù)據(jù)分析miR-375在癌組織的表達(dá)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目的關(guān)系(≤3，27例；>3，18例)，P>0.05，相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以認(rèn)為miR-375在癌組織的表達(dá)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目無(wú)相關(guān)性?？梢约僭O(shè)miR-375不參與乳腺癌細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。與此同時(shí)采用CCK-8及克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-375后，乳腺癌細(xì)胞的增殖能力明顯減弱。這些結(jié)果表明miR-375可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。

然而，本研究也存在一些局限性：樣本量較少，沒(méi)有施行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、蛋白印染實(shí)驗(yàn)等，進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)才能更好了解miR-375通過(guò)何種路徑調(diào)控腫瘤的增殖，其結(jié)果將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中研究。綜上所述，miR-375在乳腺癌患者預(yù)后分析與預(yù)測(cè)方面具有作為重要分子標(biāo)志物的潛力。