張潔玲，鄭惠芬，李 凱，朱益平

(皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，安徽 蕪湖 241001)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是世界范圍內(nèi)發(fā)病率第三的惡性腫瘤，在癌癥相關(guān)病死率中排第二，僅2018年新增病例1 096 601例，死亡551 269例[1]。在中國CRC發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢[2]，患者生存質(zhì)量的下降和巨額的醫(yī)療費用給人類健康和社會發(fā)展帶來威脅。近年來CRC診療手段有了很大提高，但患者的五年生存率仍無明顯改善[3]，提高對該疾病確切機制的認識、開發(fā)新的靶向治療藥物迫在眉睫。

MicroRNAs(miRNAs)是長度約為22個核苷酸的微小非編碼RNA，通過結(jié)合靶mRNAs的3′-UTR區(qū)參與轉(zhuǎn)錄后基因表達的調(diào)控，導致mRNAs的降解或阻止其翻譯，調(diào)控著包括癌癥在內(nèi)的許多疾病的發(fā)生發(fā)展[4]。研究表明，miRNAs在多種癌癥中表達失調(diào)，失調(diào)的miRNAs在腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲和耐藥等過程中發(fā)揮作用，充當癌癥的促癌基因或者抑癌基因。miR-495-3p在多類腫瘤中報道有差異表達，如在食管癌[5]、骨肉瘤[6]、黑色素瘤[7]等中表達下調(diào)；Eun等報道m(xù)iR-495-3p通過調(diào)節(jié)多種表觀遺傳修飾因子在胃癌發(fā)生過程中發(fā)揮抑癌作用[8]。也有報道稱miR-495-3p在CRC中受到上游分子NEAT1的調(diào)控，在LncRNA促進CRC發(fā)展中起橋梁作用[9]。然而幾乎沒有關(guān)于miR-495-3p在CRC中是否存在差異表達的研究。本研究探討miR-495-3p在CRC組織及細胞中的表達及其對CRC細胞增殖、遷移和凋亡的影響，希望發(fā)現(xiàn)CRC診斷治療的新靶點。

1 材料和方法

1.1 材料 研究所用CRC組織及其癌旁組織均來自于弋磯山醫(yī)院22位未經(jīng)過放化療的CRC患者。在患者簽署知情同意書并得到醫(yī)學委員會和弋磯山醫(yī)院倫理委員會批準認可后，收集癌灶切除術(shù)中腫瘤組織及周圍0.5 cm內(nèi)的正常組織，并立即放入液氮中保存。

1.2 細胞培養(yǎng) 4種人CRC細胞系HT29、SW480、SW620、HCT116和人正常結(jié)腸上皮細胞FHC購自中國科學院上海細胞庫(中國上海)。細胞完全培養(yǎng)基含10%的胎牛血清(Gibco，美國)及RPMI-1640(Gibco,美國)或DMEM(HyClone，美國)。4種CRC細胞系培養(yǎng)在RPMI-1640的完全培養(yǎng)基，正常結(jié)腸上皮細胞FHC培養(yǎng)在DMEM。細胞培養(yǎng)箱的環(huán)境在恒溫37℃下保持5%的CO2。每1～2 d給予細胞換液或傳代等操作。

1.3 RNA提取和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-qPCR) 組織和細胞的RNA按照商家說明書用Trizol(Invitrogen,美國)提取。使用分光光度計NanoDrop 2000 Spectrophotometer(Thermo Fisher，美國)測量RNA濃度后，取2 μL進行逆轉(zhuǎn)錄從而得到對應(yīng)的cDNA(逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，Takara,中國)。采用莖環(huán)法qPCR檢測miRNA的表達(qPCR試劑盒，Takara,中國)。實驗中所用引物的序列如下：U6上游CTCGCTTCGGCAGCACA，下游AACGCTTCACG-AATTTGCGT；miR-495-3p上游AAACAAACAUGGUGCACUUCUU，下游GAAGUGCACCAUGUUUGU-UUUU。以上引物購自銳博生物(中國廣州)，其中U6作為miR-495-3p的內(nèi)參。采用2-ΔΔCt法分析組織或細胞中miR-495-3p的表達情況。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染 miR-495-3p模擬物和miR-495-3p阻斷劑及各自對照由銳博生物合成。待6孔板中細胞達60%～70%匯合度將原培養(yǎng)基置換為無血清培養(yǎng)基opti-MEM(Gibco)，按照廠家說明書使用Lipofectamine 3000 Kit(Invitrogen)進行轉(zhuǎn)染。6 h后將opti-MEM培養(yǎng)基置換為含2%胎牛血清的培養(yǎng)基或完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.5 細胞生存實驗(CCK-8) 使用Cell Counting Kit-8試劑盒(KeyGen Biotech Co.，中國南京)，分析轉(zhuǎn)染后細胞的生存能力。經(jīng)過相應(yīng)轉(zhuǎn)染處理后的HT29和SW480細胞按照每孔1×104個細胞接種在96孔板。在轉(zhuǎn)染后的12、24、36、48、60 h分別向每孔中加入10 μL CCK-8試劑。將細胞繼續(xù)放回培養(yǎng)箱中孵育2 h后分別測量在450 nm處的吸光度。

1.6 細胞增殖實驗(EdU) 轉(zhuǎn)染6 h后將細胞接種至24孔板，待細胞生長至70%～80%匯合度時每孔按照1∶1 000加入EdU試劑孵育2 h，之后對細胞進行固定及染色(EDU細胞增殖試劑盒，Ribo，中國廣州)，最后用熒光顯微鏡觀察細胞及成像。

1.7 細胞遷移實驗(Transwell) 轉(zhuǎn)染24 h后消化細胞，并用無血清RPMI-1640調(diào)整濃度為1×105個/mL，取100 μL加入Transwell小室的上室，而在下室中加入含20%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。放回細胞培養(yǎng)箱孵育48 h后，用4%多聚甲醛固定穿膜細胞，0.1%結(jié)晶紫染色，并用棉簽輕拭掉未穿膜細胞，最后用倒置顯微鏡觀察和成像。

1.8 細胞凋亡實驗(流式細胞術(shù)) 使用細胞凋亡檢測試劑盒(BD Biosciences,美國)檢測細胞凋亡率。轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，PBS清洗細胞3遍，適量binding buffer重懸細胞。加入1 μL annexin-V-fluorescein isothiocyanate(FITC)避光染色15 min后，再加入1 μL的 propidium iodide(PI)(每個細胞系都設(shè)有FITC單染、PI單染和空白對照來調(diào)試畫門)。最后使用流式細胞儀檢測凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 miR-495-3p在CRC組織和細胞系中低表達 RT-qPCR結(jié)果顯示，CRC組織中miR-495-3p水平表達低于癌旁組織(t=4.653，P<0.001;圖1A)。與正常腸上皮細胞相比,CRC細胞中miR-495-3p水平表達均降低(P<0.001;圖1B)。

A.RT-qPCR比較CRC組織與癌旁組織中miR-495-3p表達水平；B.RT-qPCR比較CRC細胞與正常腸上皮細胞中miR-495-3p表達水平(FB=46.800，PB<0.001；與正常腸上皮細胞比較，***P<0.001)。

2.2 miR-495-3p抑制CRC細胞的增殖 通過RT-qPCR驗證miR-495-3p mimic和inhibitor轉(zhuǎn)染成功(P<0.05;圖2)，后進行功能實驗CCK-8顯示，分別在24、36、48、60 h與各自對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-495-3p mimic后細胞活力降低，而轉(zhuǎn)染miR-495-3p inhibitor后細胞活力升高(P<0.05;圖3)。同時，EDU增殖實驗顯示，miR-495-3p高表達組增殖細胞減少，miR-495-3p低表達組增殖細胞增多(P<0.05;圖4)。以上結(jié)果表明miR-495-3p能夠抑制CRC細胞的增殖。

HT29:t=6.079、3.845，P<0.05;SW480:t=10.35、5.173，P<0.01。

圖3 CCK-8檢測過表達或敲減miR-495-3p對CRC細胞活力的影響

HT29:t=6.948、2.945，P<0.05；SW480：t=4.831、5.803，P<0.01。

2.3 miR-495-3p抑制CRC細胞的遷移 Transwell實驗探究miR-495-3p對CRC細胞遷移的影響。結(jié)果顯示，過表達miR-495-3p組遷移細胞少于對照組，低表達組遷移細胞高于其對照組(P<0.05;圖5)，表明miR-495-3p能夠抑制CRC細胞的遷移。

2.4 miR-495-3p促進CRC細胞凋亡 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，和對照組相比，miR-495-3p mimic組凋亡細胞增多，miR-495-3p inhibitor組凋亡細胞則減少(P<0.01;圖6)。說明miR-495-3p能夠促進CRC細胞的凋亡。

HT29:t=7.250、5.120，P<0.01;SW480:t=3.670、5.580，P<0.05。

HT29:t=6.066、8.786，P<0.01；SW480：t=5.977、12.890，P<0.01。

3 討論

miR-495-3p參與調(diào)節(jié)人體多種病理生理過程。有研究表明miR-495-3p通過靶向IL5RA抑制人髓核細胞炎癥和凋亡從而在椎間盤退變中發(fā)揮作用[10]，也有研究提示miR-495-3p可能與肺功能和慢性阻塞性肺氣腫有關(guān)[11]。當然，miR-495-3p在癌癥中的研究更為廣泛，在癌癥的發(fā)生發(fā)展以及耐藥方面均發(fā)揮作用。研究表明，miR-495-3p的功能缺失或抑制可觸發(fā)多種致癌表觀遺傳修飾因子的過表達，從而促進胃上皮細胞的惡性轉(zhuǎn)化和生長[8]；Chen等研究發(fā)現(xiàn)miR-495-3p通過GRP78/mTOR軸調(diào)節(jié)自噬來抑制胃癌的多藥耐藥[12]。但目前很少有研究人員報道m(xù)iR-495-3p在CRC組織和細胞中的表達以及對CRC細胞的具體作用。

在本研究中，首先使用RT-qPCR檢測miR-495-3p在22對CRC組織及其癌旁組織中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)癌組織中的miR-495-3p水平明顯低于癌旁組織。同時也檢測了4個CRC細胞系和1個正常腸上皮細胞系中miR-495-3p的表達，結(jié)果顯示CRC細胞中miR-495-3p表達降低。為了進一步探究miR-495-3p對CRC細胞功能的影響，我們使用CCK-8、EdU增殖實驗檢測了細胞的增殖能力；Transwell實驗檢測了細胞的遷移能力；流式細胞術(shù)檢測了細胞的凋亡率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達miR-495-3p后，CRC細胞的增殖和遷移能力下降、凋亡比例升高；而敲減miR-495-3p后細胞的增殖和遷移能力提高、凋亡比例減少。這些結(jié)果提示miR-495-3p在CRC中可能扮演著抑癌基因的角色。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)miR-495-3p在CRC組織和細胞中表達下降，且能夠抑制CRC細胞的增殖和遷移，促進CRC細胞的凋亡。揭示了miR-495-3p可作為CRC潛在治療靶點的希望。未來本課題組會在體內(nèi)驗證miR-495-3p在CRC中的抑癌作用，以及探究miR-495-3p發(fā)揮作用的具體分子機制和下游通路。