徐 童，周智麗，李鐵臣，孫 青

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；2.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 婦產(chǎn)科，安徽 蕪湖 241001)

卵巢癌在女性惡性腫瘤中病死率最高[1]，其惡性程度高、預(yù)后差，患者5年生存率低于50%[2-3],大多數(shù)卵巢癌患者化療后復(fù)發(fā)，迫切需要新的治療策略[4-5]。

泛素結(jié)合酶E2T(ubiquitin-conjugating enzyme E2T,UBE2T)屬于泛素結(jié)合酶E2家族成員[6]。研究表明UBE2T與細(xì)胞的增殖、凋亡、腫瘤的發(fā)生發(fā)展等密切相關(guān)，在肺癌[8]、胃癌[9]、乳腺癌[10]、肝癌[11]、鼻咽癌[12]、結(jié)直腸癌[13]及前列腺癌[14]等組織中均表達(dá)上調(diào)。但UBE2T在卵巢癌中的表達(dá)情況尚不明確，需要進(jìn)一步探究。本研究旨在探究沉默UBE2T對卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人正常卵巢上皮細(xì)胞系IOSE80和人卵巢癌細(xì)胞系HO8910和A2780均購自湖南豐輝有限公司。IOSE80在DMEM培養(yǎng)基(Gibco,美國)中培養(yǎng)；HO8910和A2780在1640培養(yǎng)基(Gibco,美國)中培養(yǎng)，均添加10%的胎牛血清。在細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國)中5%CO2和37℃條件下培養(yǎng)。小干擾RNA(si-UBE2T)以及對應(yīng)的轉(zhuǎn)染試劑均購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司，其序列如下：ATCCGATTTCTCACTCCAA；按照轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。

1.2 實(shí)時熒光定量PCR(qRT-RCR) 使用TRIzol試劑(Invitrogen,美國)抽提細(xì)胞總RNA，使用oligo dT(Thermo，美國)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用SYBR Green qPCR Mix試劑盒(biosharp，上海)進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。β-actin作為UBE2T內(nèi)參，均由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計。其序列如下，β-actin引物上游：5′-GTC-ATTCCAAATATGAGATGCGT-3′，下游：5′-GCTATCACCTCCCCTGTGTG-3′；UBE2T引物上游：5′-ATCCCTCAACATCGCAACTGT-3′，下游：5′-CAGCC-TCTGGTAGATTATCAAGC-3′。

1.3 免疫印跡法(Western blot) 用RIPA裂解液(Biosharp，中國上海)提取轉(zhuǎn)染48 h的卵巢癌細(xì)胞的總蛋白。制備10%SDS-PAGE凝膠用于分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。封閉后用一抗(1∶1 000)在4℃下孵育過夜，然后用二抗(1∶2 000)在室溫下孵育2 h，然后進(jìn)行曝光分析。以β-actin(Beyotime，中國上海)作為內(nèi)參抗體,UBE2T購自美國Cell signaling Technologies公司。

1.4 Cell Counting Kit-8(CCK-8)實(shí)驗(yàn) 調(diào)整細(xì)胞密度為2×104細(xì)胞/mL,按100μL每孔接種于96孔板,每組均設(shè)置6個復(fù)孔,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24、48、72、96 h后加入CCK-8檢測試劑(Keygenbio,中國南京)，每孔10 μL,繼續(xù)培養(yǎng)2 h,設(shè)置酶標(biāo)儀于波長450 nm處檢測各孔吸光度(OD)。

1.5 劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)至完全融合。隨后，用10 μL移液槍槍頭垂直劃線,盡量保證每組劃痕寬度一致。用PBS沖洗去除細(xì)胞碎片，用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，分別在0 h和24 h用顯微鏡觀察并拍照(Olympus,日本)(×40)。用Image J軟件測量劃痕寬度，計算遷移率。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn) Transwell遷移實(shí)驗(yàn)是應(yīng)用8 μm濾膜Transwell小室(Corning corporation,美國)，轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞24 h后，將200 μL用無血清培養(yǎng)基稀釋的細(xì)胞接種于上室，600 μL含10%FBS的培養(yǎng)基加入下室。細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下孵育48 h后，用4%多聚甲醛固定，用0.1%結(jié)晶紫染色，最后用棉簽去除上腔室細(xì)胞。在熒光倒置顯微鏡下統(tǒng)計5個隨機(jī)區(qū)域(×100)的遷移細(xì)胞數(shù)量。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)是在小室中鋪上Matrigel基質(zhì)凝膠(BD Biosciences,美國)將細(xì)胞接種于上室進(jìn)行的。

2 結(jié)果

2.1 UBE2T在卵巢細(xì)胞系中的表達(dá) qRT-RCR實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，HO8910(4.827±0.152)和A2780(4.567±0.768)中UBE2TmRNA的表達(dá)量高于IOSE80(1.000±0.368)(n=3，F(xiàn)=55.020，P<0.001)，故選取HO8910和A2780進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 沉默UBE2T對卵巢癌細(xì)胞增殖的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示，在HO8910和A2780中，與對照組相比，si-UBE2T組細(xì)胞的UBE2T蛋白表達(dá)降低(t=14.450、9.719,P<0.001),見圖1A。CCK8實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，在HO8910和A2780細(xì)胞中，與對照組相比，si-UBE2T組細(xì)胞增殖能力降低(48 h:t=3.294、7.871,P<0.05;72 h:t=6.336、6.754,P<0.01;96 h:t=10.350、6.475,均P<0.01)，見圖1B。

A.Western blot檢測轉(zhuǎn)染si-UBE2T后卵巢癌細(xì)胞UBE2T蛋白的表達(dá)；B.CCK8比較對照組與si-UBE2T組卵巢癌細(xì)胞的增殖能力。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.3 沉默UBE2T對卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，劃痕后培養(yǎng)24 h，在HO8910和A2780細(xì)胞中，si-UBE2T組的細(xì)胞遷移率低于對照組(t=12.430、8.829,P<0.001)，見圖2A。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HO8910和A2780細(xì)胞中，si-UBE2T組的細(xì)胞遷移數(shù)量低于對照組(t=12.560、9.958,P<0.001)，見圖2B。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HO8910和A2780細(xì)胞中，si-UBE2T組的細(xì)胞侵襲數(shù)量低于對照組(t=7.788、5.065,P<0.01)，見圖2C。

A.劃痕愈合實(shí)驗(yàn)比較對照組和si-UBE2T組細(xì)胞遷移能力(×40)；B.Transwell遷移實(shí)驗(yàn)比較對照組和si-UBE2T組細(xì)胞遷移能力(×100)；C.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)比較對照組和si-UBE2T組細(xì)胞侵襲能力(×100)。**P<0.01，***P<0.001。

3 討論

根據(jù)全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2020年全球新增31.39萬卵巢癌病例，20.72萬例死于卵巢癌[15]。臨床上手術(shù)聯(lián)合化療仍為當(dāng)前卵巢癌的主要治療方式，但由于多數(shù)患者發(fā)展到晚期才被確診，且多數(shù)伴隨遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，這些治療仍預(yù)后不佳。因此，找到新的治療靶點(diǎn)對卵巢癌的治療有重要意義。

UBE2T是泛素蛋白酶體系統(tǒng)的成員之一，參與真核細(xì)胞中大多數(shù)蛋白質(zhì)的降解，并與細(xì)胞信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞增殖凋亡有關(guān)[16]。研究表明UBE2T在多種癌癥中呈高表達(dá)，且高表達(dá)水平與部分惡性腫瘤患者的腫瘤大小、轉(zhuǎn)移等惡性特征及不良預(yù)后密切相關(guān)。Perez-Pea等發(fā)現(xiàn)，UBE2T在乳腺癌中高表達(dá)并與乳腺癌患者不良預(yù)后密切相關(guān)[10]。Hu等發(fā)現(xiàn)，UBE2T可以通過AKT/GSK-3β/β-catenin通路促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。Luo等發(fā)現(xiàn)，沉默UBE2T通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖[13]。Wen等發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)UBE2T可通過作用于Vemintin介導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的增殖、EMT和轉(zhuǎn)移[14]。Zhu等發(fā)現(xiàn)，UBE2T過度表達(dá)可能導(dǎo)致膽囊癌患者預(yù)后不佳[17]。而UBE2T在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制還未被研究。本研究發(fā)現(xiàn)，UBE2T在人卵巢癌細(xì)胞系中呈高表達(dá)，下調(diào)UBE2T在HO8910和A2780細(xì)胞中的表達(dá)后，抑制了卵巢癌細(xì)胞的遷移、增殖和侵襲能力，這些數(shù)據(jù)均表明UBE2T與卵巢癌的發(fā)展可能密切相關(guān)。

綜上所述，沉默UBE2T的表達(dá)能抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，可能是卵巢癌的潛在治療靶點(diǎn)。但本研究僅通過體外實(shí)驗(yàn)分析了UBE2T對卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)活性的影響，未深入探究其分子機(jī)制，這是本研究的不足之處，仍需進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)，探討UBE2T在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的可能機(jī)制。