侯銀芬，查曉娟，吳昌凡，張鵬飛，王 娟，季 霞，謝 平

(1.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 眼科，江蘇 南京 210029；2.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 a.健康管理中心；b.眼科，安徽 蕪湖 241001)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)被認(rèn)為是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥，也是發(fā)達(dá)國(guó)家中可預(yù)防性失明的主要原因，影響全球約9 500萬(wàn)人。DM的患病率正在增加，預(yù)計(jì)到2035年將影響5.92億人[1]。在疾病發(fā)展的早期，DR一般是無(wú)癥狀的。但如果治療不及時(shí)，DR會(huì)對(duì)視力造成不可逆的損傷，并最終發(fā)展為失明[2]。由于人們生活水平的不斷提高，糖尿病的發(fā)病率在不斷上升，另外DR的潛在發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且尚未明確，因此阻礙了特定、有效治療方式的發(fā)展。因此，我們從分子學(xué)機(jī)制探究DR的發(fā)病，對(duì)于未來(lái)DR的診斷和治療有著重要的意義。

糖尿病視網(wǎng)膜疾病包括視網(wǎng)膜血糖損傷的一系列后果，表現(xiàn)為導(dǎo)致新生血管形成和視網(wǎng)膜脫離的微血管DR、糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema,DME)和加速的潛在神經(jīng)細(xì)胞變性。MicroRNAs(miRNAs)是小的非編碼RNA，與mRNA的3′非翻譯區(qū)(un-translated regions,UTR)相互作用，直接調(diào)節(jié)mRNA的降解和翻譯,并調(diào)節(jié)基因表達(dá)。已有報(bào)道m(xù)iRNAs具有廣泛的調(diào)控功能,包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、自噬等生理病理過(guò)程,可能間接影響機(jī)體的生理功能和病理過(guò)程[3]。miRNAs參與DR相關(guān)的微血管形成和能夠逆轉(zhuǎn)血脂異常和減緩DR進(jìn)展，并且有可能成為DR治療策略。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-129-5p相關(guān)的機(jī)制：miR-129-5p通過(guò)抑制COL1A1抑制胃癌細(xì)胞侵襲和增殖[4]，miR-129-5p通過(guò)TCF4抑制骨形成[5]。miR-129-5p已被報(bào)道為癌癥和神經(jīng)疾病的調(diào)節(jié)劑[6]。多種miRNA可以在視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中大量表達(dá)[8]，因?yàn)閙iR-129-5p已被證明可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡和血管生成[4,9-10]。這些研究表明，對(duì)miR-129-5p的功能和機(jī)制研究將有助于開(kāi)發(fā)潛在的糖尿病視網(wǎng)膜病變治療策略。

1 材料與方法

1.1 大鼠糖尿病模型 經(jīng)過(guò)12 h禁食后，將鏈脲佐菌素等體積注射于所有麻醉后的大鼠腹腔中(STZ；Sigma-Aldrich Corp.,Louis,MO,USA)(65 mg/kg)。對(duì)照組大鼠腹腔注射相同體積的檸檬酸鹽緩沖液。注射前及注射后7 d、1個(gè)月和3個(gè)月，用血糖儀測(cè)量大鼠清晨的空腹血糖。本研究使用血糖水平超過(guò)11.1 mmol/L的大鼠。

1.2 人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng) 人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human retinal microvascular endothelial cells,HRECs)購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所，置于含5%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素和1%內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充劑的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(endothelial cell culture medium,ECM)中，培養(yǎng)在37℃、5% CO2濕潤(rùn)環(huán)境中。

1.3 miRNA的實(shí)時(shí)定量RT-PCR 使用TRIzol試劑(Invitrogen)從視網(wǎng)膜組織或細(xì)胞中提取總RNA。SYBR Green PCR試劑盒(廣東銳博有限公司)用于進(jìn)行qRT-PCR。U6用作miRNA定量的內(nèi)部對(duì)照。通過(guò)2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-129-5p(mimic)模擬物及其陰性對(duì)照(mimic-NC)由Genechem公司構(gòu)建。將細(xì)胞置于6孔板中，根據(jù)說(shuō)明書(shū)，使用lipofectamine 2000 TM進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將miR-129-5p mimic及mimic-NC轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，37℃、5% CO2下孵育48 h。然后，采用定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。

1.5 細(xì)胞增殖 使用EdU和CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖(RiboBio，中國(guó)廣州)。將處理過(guò)的細(xì)胞接種在96孔板中，并在37℃下與50 μmol/L EdU孵育2 h。4%多聚甲醛固定后，將細(xì)胞暴露于100 μL 1×Apollo?反應(yīng)混合物中，細(xì)胞核染色采用5 μg/mL Hoechst 33342。使用熒光顯微鏡(日本東京奧林巴斯)拍攝圖像。EdU陽(yáng)性細(xì)胞的百分比定義為增殖率。對(duì)于CCK-8分析，將處理過(guò)的細(xì)胞接種在96孔板中，每孔接種2×103個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)2～4 h后加入CCK-8培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)孵育2 h；使用酶標(biāo)儀測(cè)量420 nm波長(zhǎng)處的吸光度，重復(fù)測(cè)量3次；第2天開(kāi)始，連續(xù)5 d在相同時(shí)間按上述步驟換含10% CCK-8的培養(yǎng)基，孵育2 h后酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。根據(jù)所測(cè)數(shù)據(jù)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.6 視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞Matrigel管形成實(shí)驗(yàn) 按照文獻(xiàn)[7]方法檢測(cè)HRECs的小管形成。將基質(zhì)膠基質(zhì)(Corning)置于24孔板的底部，在其上接種HRECs。倒置顯微鏡(Nikon)下觀察毛細(xì)管狀結(jié)構(gòu)。每孔至少隨機(jī)選擇6個(gè)不同視野進(jìn)行觀察。使用Image J軟件(MD，USA)分析毛細(xì)管狀結(jié)構(gòu)的網(wǎng)格、分支和分支長(zhǎng)度。

2 結(jié)果

2.1 miR-129-5p在細(xì)胞及組織中的表達(dá) 與基于qRT-PCR測(cè)定的對(duì)照相比，DM大鼠的視網(wǎng)膜miR-129-5p表達(dá)下調(diào)(t=5.989，P<0.01)(圖1A)。為了進(jìn)一步探索miR-129-5p在DM視網(wǎng)膜中的作用，在高濃度葡萄糖(HG)培養(yǎng)基(30 mmol/L)中培養(yǎng)RMECs以模擬體外糖尿病狀況。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，HG處理24、48 h后均抑制了miR-129-5p的水平(P<0.01)(圖1B)。

A.對(duì)照組和DM大鼠視網(wǎng)膜中通過(guò)qRT-PCR測(cè)定的miR-129-5p表達(dá)水平；B.在5 mmol/L葡萄糖(正常葡萄糖，NG)、5 mmol/L葡萄糖加25 mmol/L甘露醇(甘露醇)和30 mmol/L葡萄糖(HG)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24、48 h的RMECs中miR-129-5p水平的變化(F24 h和48 h=51.659和117.374，P24 h和48 h<0.001；**P<0.01)。

2.2 miR-129-5p抑制HG誘導(dǎo)的HRECs增殖 本研究通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，過(guò)表達(dá)組處理后miR-129-5p表達(dá)量增加(t=12.899，P<0.001)(圖2A)。關(guān)于評(píng)估m(xù)iR-129-5p在體外糖尿病條件下的作用，HG處理后相比于未處理組，細(xì)胞EdU增殖能力升高(P<0.01)；與miR-NC處理相比，HG處理后細(xì)胞EdU增殖能力在miR-129-5p過(guò)表達(dá)下降低(P<0.01)。在CCK8實(shí)驗(yàn)中，HG處理1～4 d相比于未處理組，細(xì)胞增殖能力升高(P<0.01)；與miR-NC處理相比，HG處理1～4 d miR-129-5p過(guò)表達(dá)組細(xì)胞增殖能力降低(P<0.01)(圖2B、C)。

A.miR-129-5p模擬物處理的HRECs細(xì)胞中miR-129-5p的qRT-qPCR結(jié)果；B.轉(zhuǎn)染miR-129-5p模擬物或?qū)φ漳M物的HRECs細(xì)胞增殖能力的EdU分析及轉(zhuǎn)染HRECs細(xì)胞中EdU陽(yáng)性細(xì)胞比率的統(tǒng)計(jì)分析；C.轉(zhuǎn)染miR-129-5p模擬物或?qū)φ漳M物的HRECs細(xì)胞增殖能力的CCK-8分析(Fedu=110.438，Pedu<0.001；Fcck8/1～4 d=82.016、39.867、86.299、327.028，Pcck8/1～4 d<0.001；**P<0.01)。

2.3 miR-129-5p過(guò)表達(dá)減少視網(wǎng)膜新生血管形成 鑒于miR-129-5p在DM視網(wǎng)膜組織中表達(dá)下調(diào)，在HG誘導(dǎo)的HRECs中受到抑制。本課題組研究了miR-129-5p過(guò)表達(dá)對(duì)體內(nèi)視網(wǎng)膜新生血管的影響。小管形成實(shí)驗(yàn)表明，HG暴露加速了HRECs的遷移和新生血管形成(P<0.01)，其作用被miR-129-5p模擬物逆轉(zhuǎn)(P<0.01)(圖3)。

F=40.839，P<0.001；**P<0.01。

3 討論

DR對(duì)患者的生活產(chǎn)生多種負(fù)面影響，這在很多國(guó)家已被認(rèn)為是導(dǎo)致失明的主要原因[11]。miRNAs是包含22核苷酸堿基對(duì)的小型非編碼RNA，能夠調(diào)控基因表達(dá)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本降解或翻譯抑制，在整個(gè)基因組中，約30%的基因受到miRNAs的調(diào)控[12]，包括增殖、遷移和分化等。如miRNA-200b靶向VEGFA基因?qū)R發(fā)生發(fā)展的影響[13]；miR-365通過(guò)抑制Timp3和增加氧化應(yīng)激促進(jìn)DR[14]；miR-409-5p促進(jìn)DR的視網(wǎng)膜新生血管形成[15]。因此，在目前的研究中，我們重點(diǎn)研究了HRECs視網(wǎng)膜內(nèi)皮血管形成的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)一種新的miRNA，miR-129-5p抑制了HRECs新生血管的形成。從而，miR-129-5p過(guò)表達(dá)降低了DR引起的視網(wǎng)膜損傷。根據(jù)我們的研究結(jié)果，我們提出miR-129-5p在DR進(jìn)展過(guò)程中起到保護(hù)作用。盡管仍需要更多證據(jù)，但我們的研究結(jié)果為預(yù)防DR進(jìn)展提供了一個(gè)新靶標(biāo)。

首先本研究通過(guò)使用qRT-PCR測(cè)量了DM大鼠視網(wǎng)膜組織和HG誘導(dǎo)的HRECs中miR-129-5p的表達(dá)，這些樣本中miR-129-5p的降低表明miR-129-5p作為DR進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器。miR-129-5p在眾多細(xì)胞器中都擔(dān)任著重要的角色[16]，有研究報(bào)告顯示，miR-129-5p與DM及其并發(fā)癥的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)。miR-129-5p過(guò)表達(dá)減輕了DR引起的視網(wǎng)膜損傷。根據(jù)我們的研究結(jié)果，我們提出miR-129-5p在DR進(jìn)展過(guò)程中起到保護(hù)作用。值得注意的是，研究表明，miRNA可以被另一種非編碼RNA，即長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long chain non-coding RNA,LncRNA)吸收，從而消除miRNA對(duì)下游靶標(biāo)mRNA的抑制作用。miR-129-5p是否可以被其他LncRNA吸收以調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜新生血管，值得進(jìn)一步研究。

miR-129-5p是一種很少被研究的miRNA，尤其是在DR中。在目前的研究中揭示了miR-129-5p在抑制HRECs細(xì)胞增殖和血管形成方面的新功能。盡管如此，本研究中也存在一些限制，應(yīng)予以考慮。例如，我們未對(duì)下游靶基因做進(jìn)一步的研究。此外，我們只進(jìn)行了轉(zhuǎn)染miR-129-5p模擬物后相關(guān)功能方面研究，未進(jìn)行敲低后驗(yàn)證其功能實(shí)驗(yàn)。后續(xù)我們會(huì)在這幾個(gè)方面進(jìn)一步探討其相關(guān)機(jī)制。

總之，我們的研究表明miR-129-5p在DM大鼠的視網(wǎng)膜組織和HG誘導(dǎo)的HRECs中表達(dá)下調(diào)，糖尿病條件下miR-129-5p的上調(diào)抑制視網(wǎng)膜新生血管形成，miR-129-5p療法可能代表未來(lái)DR的一種新治療策略。