1.濟(jì)南大學(xué)-山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院（山東 濟(jì)南 250200）

2.山東省罕少見病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心,山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院(山東 濟(jì)南 250062)

左清利1,2 魯艷芹1,2 韓金祥1,2

·胸部疾病·

呼吸道感染樣本中IFITMs引物優(yōu)化

1.濟(jì)南大學(xué)-山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院（山東 濟(jì)南 250200）

2.山東省罕少見病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心,山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院(山東 濟(jì)南 250062)

左清利1,2魯艷芹1,2韓金祥1,2

目的優(yōu)化干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白（Interferon induced transmenmbrane proteins,IFITMs）的五個(gè)亞型基因，即IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5和IFITM10。方法提取呼吸道感染樣本中核酸，通過RT-qPCR篩選出具有特異性的引物且Ct值在[15,35]之間，再利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)引物的特異性進(jìn)行近一步的驗(yàn)證。結(jié)果RT-qPCR結(jié)果顯示IFITM1相關(guān)引物中IFITM1-3具有特異性；IFITM2相關(guān)引物中IFITM 2-2具有特異性；IFITM3相關(guān)引物IFITM3-2有較好特異性；IFITM5相關(guān)引物中IFITM5-4具有特異性；IFITM10相關(guān)引物中IFITM10-1、IFITM10-2、IFITM10-3具有特異性。具有特異性的所有引物的瓊脂糖凝膠電泳條帶單一明亮。結(jié)論IFITM1-3優(yōu)于該基因的其它引物；IFITM2-2優(yōu)于IFITM2-1；IFITM3-2優(yōu)于IFITM3-1；IFITM10-1、 IFITM10-2 和IFITM10-3均適用。

呼吸道感染；引物；IFITMs

全球近二百萬的兒童死亡病例是由于急性呼吸道感染(ARI)導(dǎo)致的[1]。病毒是呼吸道感染的主要病原體，如呼吸道合胞病毒、腺病毒和偏肺病毒等[2]。小兒支原體肺炎也是兒科常見疾病，利用阿奇霉素序貫療法進(jìn)行治療能迅速緩解患兒臨床癥狀[3]。干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白(interferon inducible transmembrane proteins，IFITM)[4]在人類中包括5個(gè)基因，分別是IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5和IFITM10，位于11號(hào)染色體上。IFITM1、IFITM2和IFITM3的抗病毒效應(yīng)一直是研究的熱點(diǎn)，但I(xiàn)FITM5和IFITM10在呼吸道病毒感染中的研究尚未報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料呼吸道感染患者的肺泡灌洗液來源于山東省濟(jì)南市兒童醫(yī)院。

1.2 試劑儀器QIAamp MinElute Virus Spin Kit，購于QIAGEN。One Step SYBR PrimeScript PLUS RT-PCR Kit、6xLoading Buffer、DL2000 DNA marker均購于TAKARA。Nanodrop2000，購于Thermo Scientific。LightCycler480，購于Roche。EB核酸染料，購于中生泰瑞。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)：查找GENEBANK中IFITMs基因序列設(shè)計(jì)引物：IFITM1(NM_003641)，IFITM1-1上游引物：5’-GAGAGAGGCCTGCGACAA-3’，下游引物：5’-CGTTTCAGTTTCTCAGAAGTGTG-3’；IFITM1-2上游引物：5’-AGGCCTGCGACAAGTGAG-3’，下游引物：5’-TGGAACCTTGGAAGGATGGT-3’；IFITM1-1上游引物：5’-GAGAGAGGCCTGCGACAA-3’，下游引物：5’-CGTTTCAGTTTCTCAGAAGTGTG-3’；IFITM1-2上游引物：5’-AGGCCTGCGACAAGTGAG-3’，下游引物：5’-TGGAACCTTGGAAGGATGGT-3’；IFITM1-3上游引物：5’-TCGCCTACTCCGTGAAGTCT-3，下游引物：5’-ATGAGGATGCCCAGAATCAG-3’；IFITM1-4上游引物：5’-CCGTGAAGTCTAGGGACAGG-3’，下游引物：5’-GTCATGAGGATGCCCAAGAAT-3’。

IFITM2(NM_006435)，IFITM2-1上游引物：5’-GCCTGGGCTTCATAGCATT-3’，下游引物：5’-CATGGGGTGAAGTCACCTGT-3’；IFITM2-2上游引物：5’-CTCCGTGCCTGACCATGT-3’，下游引物：5’-ACGTCGCCAACCATCTTC-3’。IFITM3(NM_021034)，IFITM3-1上游引物：5’-GCCTGGGCTTCATAGCATT-3’，下游引物：5’-CATGGGGTGAAGTCACCTGT-3’；IFITM3-2上游引物：5’-TCCCTGTTCAACACCCTCTT-3’，下游引物：5’-CGCCAACCATCTTCCTGT-3’。

IFITM5(NM_001025295)，IFITM5-1上游引物：5’-TTGATCTGGTCGGTGTTCAG-3’，下游引物：5’-CAGGTCACCAACCACCTTCT-3’；IFITM5-2上游引物：5’-GGTGTTCAGCACCCTCTACC-3’，下游引物：5’-CAGGTCACCAACCACCTTCT-3’；IFITM5-3上游引物：5’-CGGTGTTCAGCACCCTCTAC-3’，下游引物：5’-CCAACCACCTTCTGATCTCG-3’；IFITM5-4上游引物：5’-GGTGTTCAGCACCCTCTACC-3’，下游引物：5’-TGTAGCACTTGGCTTTGGAG-3’。

IFITM10(NM_001170820)，IFITM10-1上游引物：5’-GCCATGCATCCTCAGCTT-3’，下游引物：5’-CTCCAGCTCCCACTGAGC-3’；IFITM10-2上游引物：5’-CCACCGAGGTGAACGACTAT-3’，下游引物：5’-TCGCACTTTGAGGGAGTAGG-3’；IFITM10-3上游引物：5’-TGGTCCATCTTCAACTTCGTC-3’，下游引物：5’-TCGCACTTTGAGGGAGTAGG-3’；IFITM10-4上游引物：5’-TGGTCCATCTTCAACTTCGTC-3’，下游引物：5’-TCTTGTCTCGCACTTTGAGG-3’。

1.3.2 核酸提取及定量：通過QIAamp MinElute Virus Spin Kit提取肺泡灌洗液中的游離核酸。用60μl洗脫兩次，并分別用Nanodrop2000核酸蛋白檢測(cè)儀進(jìn)行核酸定量，標(biāo)記后于-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 RT-qPCR：應(yīng)用One Step SYBR PrimeScript PLUS RT-PCR Kit，10μl體系，每個(gè)反應(yīng)加2xOne Step SYBRRT-PCR Buffer 5μl；PrimeScript Rtase 0.2μl； Mix TaKaRa Ex Taq HS Mix 0.6μl；上游、下游引物(10μm)均為0.5μl；Template，20ng；RNase- free ddH2O，補(bǔ)充至10μl。

首先反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在42℃下反應(yīng)5min；其次預(yù)變性，在95℃下反應(yīng)10s；然后引物擴(kuò)增反應(yīng)45個(gè)循環(huán)(95℃，10s；60℃，10s；72℃，10s)，熔解曲線反應(yīng)1個(gè)循環(huán)(95℃，5s；65℃，1min；97℃，0.11℃/ s)。冷卻40℃，30s。

2 結(jié) 果

IFITM1熔解曲線見圖1。IFITM1-1重合度不好，IFITM1-2無擴(kuò)增，IFITM1-4無特異性。IFITM2熔解曲線見圖2。IFITM2-1引物Ct值為38.06＞35。IFITM3熔解曲線見圖2。IFITM3-1引物無擴(kuò)增，IFITM3-2平行反應(yīng)引物重合度好，無雙峰。

IFITM5熔解曲線見圖3。IFITM5-1、IFITM5-2特異性差，有雙峰。除IFITM5-4Ct值為24.96，其余引物Ct值均大于35。IFITM10熔解曲線見圖4。除IFITM10-4無特異性外，其余引物特異性均較好。

3 結(jié) 論

IFITM家族蛋白之間的功能有區(qū)別，如Everitt等[5]發(fā)現(xiàn)IFITM3尤其對(duì)甲型流感病毒有顯著限制作用。本實(shí)驗(yàn)通過設(shè)計(jì)IFITMs相關(guān)引物，利用呼吸道感染患者肺泡灌洗液中的游離核酸，根據(jù)Ct值大小及熔點(diǎn)曲線峰特異性等結(jié)果篩選擴(kuò)增引物。旨在為分析呼吸道感染樣本中IFITM家族在mRNA水平上的表達(dá)提供依據(jù)。

通過分析IFITM1-3優(yōu)于該基因的其它引物；IFITM2-2優(yōu)于IFITM2-1；IFITM3-2熔解曲線特異性好，而IFITM3-1無擴(kuò)增，IFITM3-2優(yōu)于IFITM3-1；IFITM5-4熔解曲線特異性好。IFITM10-1、IFITM10-2和IFITM10-3均有較好特異性，而IFITM10-4特異性差，出現(xiàn)了雙峰且Ct＞35。

另外，在呼吸道感染患者的肺泡灌洗液中發(fā)現(xiàn)了IFITM5在mRNA水平上亦有表達(dá)，這與文獻(xiàn)中IFITM5僅在骨骼中表達(dá)的說法不一 致[6]，這種現(xiàn)象還未得到明確解釋。IFITM蛋白抵抗病毒入侵的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)旨在為呼吸道感染樣本中IFITM家族在抵抗病毒分子機(jī)制額研究提供依據(jù)。

[1] Rowlinson E, Dueger E, Mansour A, et al. Incidence and etiology of hospitalized acute respiratory infections in the Egyptian Delta[J]. Influenza & Other Respiratory Viruses,2016,11(1): 23-32.

[2] 劉潔,李醫(yī),李輝,等.128例急性上呼吸道感染患兒病原學(xué)檢測(cè)分析[J].醫(yī)學(xué)信息,2015, (33): 356-357.

[3] 曾遠(yuǎn)輝.阿奇霉素序貫療法治療小兒支原體肺炎的臨床療效及安全性分析[J]. 罕少疾病雜志, 2015, 22(3): 17-19.

[4] Diamond M SFarzan M. The broad-spectrum antiviral functions of IFIT and IFITM proteins[J]. Nature Reviews Immunology,2013, 13(1): 46-57.

[5] Everitt A, Clare S, Pertel T, et al. IFITM3 restricts the morbidity and mortality associated with influenza[J]. Nature,2012, 484(7395): 519.

[6] Moffatt P, Gaumond M H, Salois P, et al. Bril: a novel bonespecific modulator of mineralization[J]. Journal of Bone & Mineral Research the Official Journal of the American Society for Bone & Mineral Research, 2008, 23(9): 1497.

（本文圖片見封二）

Optimization of IFITMs Primers in Respiratory Tract infection Samples

ZUO Qing-li, LU Yan-qin, HAN Jin-xiang. University of Jinan-Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250200, Shandong Province, China

ObjectiveTo optimize the five subtypes of interferon inducible transmembrane proteins, namely IFITM1, IFITM2, IFITM3, IFITM5 and IFITM10.MethodsExtraction of nucleic acids from respiratory tract infection samples. Specific primers were screened by qRT-PCR and Ct value was between (15,35), and the specificity of primers was verified by agarose gel electrophoresis.ResultsIFITM1-3 was specific in the IFITM1 primers. IFITM 2-2 was specific in the IFITM2 primers. IFITM3-2 was specific in the IFITM3 primers. IFITM5-6 was specific in the IFITM5 primers. IFITM10-1, IFITM10-2 and IFITM10-3 were specific in the IFITM10 primers. Agarose gel electrophoresis bands of all primers with specificity were single bright.ConclusionIFITM1-3 was superior to other primers of IFITM1 primers. IFITM 2-2 was superior to other primers of IFITM2 primers. IFITM3-2 was superior to other primers of IFITM3 primers. IFITM5-4 was superior to other primers of IFITM5 primers. IFITM10-1, IFITM10-2 and IFITM10-3 were superior to other primers of IFITM10 primers.

Respiratory Tract Infection; Primer; IFITMs

R373.1

A

DOI:10.3969/j.issn.1009-3257.2017.02.009

2017-04-07

左清利，男，藥學(xué)專業(yè)，碩士研究生，主要研究方向：呼吸道感染樣本中IFITMs的表達(dá)差異

韓金祥