袁亞平，孫啟山，周小倩，姚 潤，湛孝東，趙金紅，姜玉新，唐小牛

(1.皖南醫(yī)學院 醫(yī)學寄生蟲學教研室，安徽 蕪湖 241002；2.嘉興學院醫(yī)學院 病原生物學與免疫學教研室，浙江 嘉興 314001)

肝纖維化是世界范圍內(nèi)的一個重大疾病，發(fā)病率高，發(fā)病機制尚不完全明確，缺乏有效的治療方法[1]。肝纖維化的特點是由慢性肝損傷引起細胞外基質(zhì)(extracellular matrix secretion，ECM)的過度積累[2]，而慢性肝損傷原因可能有病毒、飲酒及非酒精性脂肪等[3-4]。研究顯示：肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)參與酒精誘導(dǎo)的肝纖維化過程[5-6]，其激活后，分化為具有強大分泌能力的肌成纖維細胞，大量合成并分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白(Col-Ⅰ、Col-Ⅲ)等[7]，是形成肝纖維化的基礎(chǔ)[8]。體外研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1和α-SMA在激活的LX-2細胞中高表達，表明LX-2細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，提示這兩種蛋白可作為LX-2細胞激活的重要標志物[9]。MMP-1作為一種鋅依賴性的內(nèi)肽酶，參與肝臟各種狀態(tài)下ECM的重建[10-11]，在慢性肝損傷及肝臟修復(fù)中發(fā)揮重要作用[12]，但MMP-1的活性可以被TIMP-1抑制和調(diào)控[13]，肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展由MMP-1與TIMP-1之間含量的變化和活性的大小決定[14]。

草烏甲素(bulleyaconitine A,BLA)作為一種二萜生物堿[15]，具有抗炎、抗風濕、鎮(zhèn)痛等多種功能。本課題組前期研究表明，BLA能抑制LX-2細胞的增殖，促進其凋亡。本研究擬用乙醛在體外激活人LX-2細胞，誘導(dǎo)ECM的分泌，探討B(tài)LA對乙醛誘導(dǎo)的LX-2細胞ECM及其相關(guān)蛋白的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 LX-2細胞株購自南京科佰生物科技有限公司，胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基、CCK-8細胞毒性檢測試劑盒購自美國Gibco公司，TGF-β1、MMP-1、TIMP-1及α-SMA購自美國CST公司，青霉素-鏈霉素購自美國Hyclone公司，Col-Ⅰ、Col-Ⅲ檢測試劑盒、RIPA裂解液、乙醛、異丙醛購自生工生物工程上海股份有限公司，BCA蛋白定量檢測試劑盒購自上?？道噬锟萍加邢薰?，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器 超純水儀(美國Millipore公司)，超低溫冰箱(美國莫賽飛世爾科技有限公司)，二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(日本SANYOMCO公司)，XDS-100倒置顯微鏡(上海蔡康光學儀器有限公司)，熒光顯微鏡(日本奧林巴斯)，多功能酶標儀(瑞士Tecan集團公司)、超靈敏多功能成像儀(美國GE公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將LX-2細胞株置于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的培養(yǎng)基DMEM中，5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)，每24 h用PBS清洗后更換培養(yǎng)液，觀察細胞貼壁生長狀況。當貼壁細胞生長達70%～90%時，胰酶消化收集細胞再進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8細胞毒性檢測 取對數(shù)生長期的LX-2細胞，胰酶消化后收集細胞懸液并計數(shù)，將細胞濃度調(diào)至5×104mL，添加BLA至終濃度分別為0、1.17、2.34、4.69、9.38、18.75、37.50、75、150、300和600 μg/mL后，分別孵育24、48 h，在此兩階段分別經(jīng)CCK-8細胞毒性試驗(按試劑盒說明書進行)，多功能酶標儀檢測450 nm吸光度，計算兩個時間段細胞半抑制濃度(IC50)。使用不同濃度乙醛(0、15、30、60、120、200、400、600、800 μmol/L)激活LX-2細胞24 h，探索乙醛最佳有效增值濃度，用于后續(xù)的實驗研究。

1.2.3 LX-2細胞的形態(tài)學評價和DAPI染色 將對數(shù)生長期的LX-2細胞隨機分為空白對照組和BLA組(濃度為18.75 μg/mL)。48 h后，在100倍顯微鏡下觀察BLA處理后細胞的形態(tài)學變化。LX-2細胞在6孔板中培養(yǎng)，直到黏附至孔的底部。然后取出培養(yǎng)基，使用PBS洗滌細胞3次，接著用正常培養(yǎng)基或含有18.75 μg/mL BLA的培養(yǎng)基洗滌細胞48 h。然后，PBS細胞洗滌3次，在室溫下用4%多聚甲醛固定15 min，再用PBS額外洗滌后，用100 μL預(yù)制備的10 μg/mL DAPI染色，平板被鋁箔包裹在37℃下孵育20 min。PBS再次洗滌3次后，熒光顯微鏡觀察拍攝圖像。本實驗凋亡細胞的認定是指細胞核呈致密濃染、熒光強烈的細胞。

1.2.4 ELISA實驗 使用ELISA檢測試劑盒檢測各組Col-Ⅰ和Col-Ⅲ膠原的濃度。

1.2.5 Western blot實驗 用RIPA緩沖液和添加了苯甲基磺酰和蛋白酶抑制劑的混合物將細胞在冰上裂解，收集裂解液，以BSA為標準，采用增強型BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳，然后在300 mA的恒定電流下轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)120min后，用5%脫脂牛奶在TBST中封閉PVDF膜。將封閉后的PVDF膜分別加α-SMA、TGF-β1、MMP-1、TIMP-1抗兔一抗孵育，4℃下過夜。TBST洗膜3次后加入辣根過氧化物酶(1∶1 000稀釋)標記的二抗，室溫下孵育1h，再用TBST洗滌3次，每次10 min。最后用多功能成像儀分析條帶。使用Image J軟件計算各條帶灰度值的平均值，使用β-肌動蛋白作為加載對照來計算目的蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 BLA對LX-2細胞活力的影響 經(jīng)不同濃度BLA處理的LX-2細胞在24、48 h的IC50值分別為20.89、19.20 μg/mL。隨后實驗使用BLA的相對安全濃度為18.75 μg/mL。見圖1。

A.24 h；B.48 h。

2.2 BLA對LX-2細胞形態(tài)的影響 對照組LX-2細胞外形呈星形，細胞密度相對較高，貼壁生長較好。BLA組星形細胞較少，相對密度較低，貼壁生長較差(圖2)。對照組細胞核大小相近、卵圓形或圓形，數(shù)量較多，熒光強度較弱；BLA組細胞核大小不等，形態(tài)多樣，數(shù)量較少，熒光強度較強(圖3)。

A.NC組；B.BLA組(18.75 μg/mL)。

A.NC組；B.BLA組(18.75 μg/mL)。

2.3 乙醛對LX-2細胞增殖的影響 不同乙醛濃度對細胞增殖均較對照組升高(P<0.05，見圖4)，對LX-2細胞增殖最有效的乙醛濃度是400 μmol/L。

與NC組比較，*P<0.05。

2.4 各組Col-Ⅰ、Col-Ⅲ檢測比較 乙醛組Col-Ⅰ、Col-Ⅲ含量高于對照組(P<0.05)，而BLA組Col-Ⅰ、Col-Ⅲ含量低于乙醛組(P<0.05)，見圖5。

與NC組比較，*P<0.05；與乙醛組比較，#P<0.05。

2.5 各組α-SMA、TGF-β1、MMP-1、TIMP-1標志蛋白的檢測比較 乙醛組TGF-β1、α-SMA和TIMP-1蛋白含量均高于對照組(P<0.05)，MMP-1蛋白含量低于對照組(P<0.05)；BLA組TGF-β1、α-SMA和TIMP-1蛋白含量均低于乙醛組(P<0.05)，BLA組MMP-1蛋白含量高于乙醛組(P<0.05)，見圖6。

與NC組比較，*P<0.05；與乙醛組比較，#P<0.05。

3 討論

肝纖維化是由多種原因在人體內(nèi)通過某種途徑誘導(dǎo)激活HSCs過度增殖、活化而引起大量分泌多種ECM而產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，肝臟細胞外基質(zhì)中主要包括膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型，另外還有如層黏連蛋白、纖維蛋白等，它們是肝內(nèi)形成纖維支架及肝細胞生長、遷移、信號傳導(dǎo)的基礎(chǔ)[8]。然而，當不同原因誘發(fā)肝病變時，ECM的各成分含量將會發(fā)生很大變化尤其是各種膠原蛋白，其中主要是Col-Ⅰ、Col-Ⅲ大量分泌在肝臟內(nèi)沉積導(dǎo)致肝臟的纖維化[16-17]。本研究使用乙醇的代謝物乙醛作為誘導(dǎo)劑在體外激活LX-2細胞，使其進一步活化，進而分泌大量的ECM，構(gòu)建高表達ECM的細胞模型來探討B(tài)LA對乙醛誘導(dǎo)的LX-2細胞ECM及其相關(guān)蛋白的影響。研究結(jié)果表明，安全濃度BLA處理的LX-2細胞，對細胞活力、細胞生長具有明顯的抑制作用，且對細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯的破壞作用；對不同濃度乙醛誘導(dǎo)LX-2細胞增殖結(jié)果顯示，乙醛能明顯促進LX-2細胞的增殖，其對LX-2細胞增殖最有效的乙醛濃度是400μmol/L。進一步研究顯示，BLA能明顯降低乙醛誘導(dǎo)的LX-2細胞模型Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的分泌水平及α-SMA、TGF-β1及TIMP-1蛋白含量，提高了MMP-1含量，從而提高了MMP-1/TIMP-1的比例，說明BLA能明顯降低肝纖維化形成的基礎(chǔ)物質(zhì)，進而抑制肝纖維化的形成。其可能機制是BLA通過干預(yù)TGF-β1信號通路而抑制人LX-2細胞活化和增殖，提高MMP-1/TIMP-1的比例，加強Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的降解，從而降低ECM的沉積。