寇美玲，謝佳芮，楊佳萍，苗海生

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650224；2.施甸縣畜牧獸醫(yī)中心，云南保山 678200)

冠狀病毒屬于單股正鏈RNA病毒，基因組長(zhǎng)度約為30 000 bp，為目前已知的最大的RNA病毒。冠狀病毒家族根據(jù)形態(tài)、基因組結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)情況分為2個(gè)亞科，即冠狀病毒亞科(Coronavirinae)和凸隆病毒亞科(Torovirinae)[1]。在遺傳和血清學(xué)特性基礎(chǔ)上，Coronavirinae亞科又被劃分成4個(gè)屬，即α、β、γ和δ冠狀病毒屬[2]。每個(gè)屬再根據(jù)pp1ab復(fù)制酶結(jié)構(gòu)域不同劃分成不同物種。其中β冠狀病毒是分型比較復(fù)雜的一個(gè)屬，現(xiàn)在分為 4 個(gè)亞群(A、B、C 和 D)。目前流行的新型冠狀病毒COVID-19和2003年發(fā)生的SARS病毒均為β病毒屬B亞群[3]。

牛冠狀病毒(Bovine coronavirus，BCoV)可以引起新生犢牛腹瀉、成年牛的冬季血痢和呼吸道疾病，呈世界性分布。BCoV屬于β病毒屬A亞群，有囊膜，基因組主要包括2個(gè)開(kāi)放閱讀框ORF1a、ORF1b和5個(gè)編碼結(jié)構(gòu)蛋白的基因。結(jié)構(gòu)蛋白分別為血凝素酯酶蛋白(HE)、纖突蛋白(S)、小衣殼蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣殼蛋白(N)[4]。HE蛋白主要參與病毒的早期吸附作用[5]；S蛋白介導(dǎo)細(xì)胞的吸附和病毒與膜的融合，與病毒的毒力和組織受體識(shí)別有關(guān)，是病毒感染宿主范圍和跨物種感染的重要決定因素[6]；N蛋白與RNA組成核糖核蛋白復(fù)合體，可作為診斷CoV檢測(cè)的靶點(diǎn)，也可作為診斷抗原用于BCoV流行病學(xué)調(diào)查[7-8]；M蛋白在病毒裝配中起重要作用，N蛋白與其羧基末端親水氨基酸結(jié)合，影響和決定病毒的出芽過(guò)程[9]。

云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室對(duì)2019年1月～12月采集的牛食道-咽喉部分泌物(OP液)樣品進(jìn)行BCoV核酸篩查，檢出核酸陽(yáng)性樣品1份，該樣品采集自云南省景洪市勐龍鎮(zhèn)曼景勐村委會(huì)，經(jīng)調(diào)查該牛是經(jīng)景洪市中緬邊境入境的緬甸黃牛，在該村短期育肥，其他牛未檢出BCoV核酸，緬甸來(lái)源地已無(wú)法查證。本文對(duì)檢出的BCoV進(jìn)行全基因測(cè)序和遺傳進(jìn)化分析，并對(duì)HE、S、M、N基因片段分別進(jìn)行分析，以期對(duì)國(guó)內(nèi)的BCoV預(yù)防和控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 2019年1月～12月在景洪市采集黃牛食道咽喉部分泌物(OP液)214份，置于10 mL離心管中，并向離心管中加入保存液(生理鹽水+甘油)混勻，置-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 核酸提取試劑盒，ABI Magmax磁珠法，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI)公司產(chǎn)品；一步法RT-PCR檢測(cè)試劑盒和化學(xué)試劑，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 旋渦混合器(QL861),江蘇其林貝爾公司產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增儀(9700)，凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI)公司產(chǎn)品；多功能水平電泳槽(HE-120)，上海天能公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 參照ABI Magmax磁珠法核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)OP液樣品提取RNA，將所提取的RNA存放于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒鑒定引物合成 根據(jù)GenBank中公開(kāi)發(fā)表的BCoV S基因序列設(shè)計(jì)引物，由昆明擎科公司合成引物(表1)[4]。

表1 BCoV S基因引物序列Table 1 Primer sequences of BCoV S gene

1.2.3 BCoV全基因引物序列 根據(jù)BCoV-giraffe coronavirus US/OH3/2006(EF424624.1)毒株全基因序列設(shè)計(jì)20對(duì)引物，引物由昆明擎科公司合成(表2)。

表2 BCoV全基因引物序列Table 2 BCoV full length primer sequences

1.2.4 病毒鑒定 針對(duì)BCoV S蛋白基因片段進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系25 μL：RNA 5 μL，2×1 step Buffer(Dye Plus) 12.5 μL，PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1.0 μL，BCoV S基因引物各0.5 μL，RNase free dH2O 5.5 μL。反應(yīng)條件：50℃ 6 min；94℃ 2 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，32個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。10 g/L瓊脂糖電泳檢查擴(kuò)增條帶。

1.2.5 病毒全基因組序列擴(kuò)增 經(jīng)RT-PCR對(duì)S蛋白基因片段檢測(cè)、測(cè)序鑒定為BCoV的樣品進(jìn)行全基因組測(cè)序。應(yīng)用一步法RT-PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)體系25 μL：RNA 5 μL，2×1 step Buffer(Dye Plus) 12.5 μL ，PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1.0 μL，各基因引物各0.5 μL，RNase free dH2O 5.5 μL。反應(yīng)條件：50℃ 6 min；94℃ 2 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1.5 min，32個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行正反雙向測(cè)序，應(yīng)用Seqman軟件進(jìn)行拼接，獲得全基因組序列。

1.2.6 BCoV S基因、全基因序列分析 在NCBI上進(jìn)行序列比對(duì)，并從GenBank上下載冠狀病毒基因組序列，應(yīng)用MAEGA6.0進(jìn)行多個(gè)序列比較分析。分析內(nèi)容涉及全基因組和HE、S、M、N結(jié)構(gòu)蛋白基因片段。

2 結(jié)果

2.1 樣品鑒定

2.1.1 樣品RT-PCR鑒定 應(yīng)用RT-PCR方法對(duì)牛OP液樣品進(jìn)行BCoV S蛋白基因片段鑒定，同時(shí)設(shè)置陰性、陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照為含有目的片段的質(zhì)粒。電泳結(jié)果顯示，樣品片段大小為622 bp，與目的片段大小一致(圖1)，初步斷定為冠狀病毒β屬A亞群的BCoV。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陽(yáng)性對(duì)照；2.陰性對(duì)照；3.樣品M.DNA Marker DL 2000；1.Positive control；2.Negative control；3.Sample圖1 S基因部分片段電泳圖Fig.1 S Gene fragment electrophoresis map

2.1.2 BCoV S基因遺傳進(jìn)化 采用Mega 6.0軟件對(duì)云南景洪檢測(cè)到的1株BCoV與GenBank中11株BCoV一起構(gòu)建S基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)，對(duì)比結(jié)果顯示，本次檢測(cè)到的樣品與中國(guó)、越南、美國(guó)、瑞典等國(guó)家分離的樣品形成一個(gè)大簇，歸為冠狀病毒β屬A亞群；中國(guó)分離到的BCoV可形成2個(gè)獨(dú)立的簇，歸為冠狀病毒β屬B亞群和D亞群；再次判定該樣品為β屬A亞群的BCoV。

圖2 冠狀病毒S基因部分片段遺傳進(jìn)化分析Fig.2 Genetic evolution analysis of the S gene fragment of coronavirus

2.2 全基因組序列分析

應(yīng)用一代測(cè)序方法對(duì)病毒進(jìn)行全基因組測(cè)序，并在GenBank下載冠狀病毒不同亞型全基因代表毒株進(jìn)行比對(duì)和遺傳進(jìn)化分析。全基因組分析結(jié)果顯示，本次檢出的BCov/YNJH/CHA/96/2019毒株屬典型的Beta CoV A亞群,cDNA與美國(guó)毒株US/OH3/2006相似性最高，為99.33%，與美國(guó)2018年毒株Bovine coronavirus 4-17-08相似性為99.29%，與人源HCoV OC43毒株親緣關(guān)系較近，但保持一定距離，與COVID-19和SARS毒株無(wú)關(guān)聯(lián)。

2.3 HE基因組序列分析

HE基因序列分析顯示，該毒株與美國(guó)毒株US/OH3/2006、Sable antelope US/OH1/2003、Giraffe US/OH3-TC/2006相似性最高，均為99.29%。該基因相似度與全基因組比較結(jié)果類似，屬美國(guó)BCoV基因群，但HE基因組出現(xiàn)變異。

2.4 S蛋白基因組序列分析

S蛋白基因全序列分析顯示，該病毒與中國(guó)四川奶牛SWUN/LN2/2018毒株和美國(guó)賓夕法尼亞州黃牛4-17-08毒株S基因相似性最高，均為99.36%，其次與美國(guó)US/OH1/2003相似性為99.02%。由于未找到SWUN/LN2/2018全基因組數(shù)據(jù)，因此不能斷定二者的同緣關(guān)系，由于S蛋白是冠狀病毒重要的受體結(jié)合和膜活性結(jié)構(gòu)蛋白，因此判斷該毒株在毒力上與上述2種毒株可能最為接近。

圖3 冠狀病毒全基因遺傳進(jìn)化分析Fig.3 Genetic evolution analysis of full gene of coronavirus

圖4 BCoV HE蛋白基因序列遺傳進(jìn)化分析Fig.4 Genetic evolution analysis of BCoV HE protein gene sequence

圖5 BCoV S蛋白基因序列遺傳進(jìn)化分析Fig.5 Genetic evolution analysis of BCoV S protein gene sequence

圖6 BCoV M蛋白基因序列遺傳進(jìn)化分析Fig.6 Genetic evolution analysis of BCoV Mprotein gene sequence

圖7 BCoV N蛋白基因序列遺傳進(jìn)化分析Fig.7 Genetic evolution analysis of BCoV N protein gene sequence

2.5 M基因組序列分析

M基因與日本的TCG-7、IWT-23毒株和美國(guó)US/OH3-TC/2006等較為接近，相似性均為99.42%。說(shuō)明該毒株M基因與全基因組的變異相比更低。

2.6 N基因組序列分析

N基因組序列分析顯示，該毒株與美國(guó)毒株US/OH3/2006、Giraffe US/OH3-TC/2006毒株100%相似，與中國(guó)SWUN/LN2/2018毒株和美國(guó)2018年毒株 4-17-08相似性均為99.85%，與日本毒株TCG-1相似性為99.55%，與TCG-7相似性為99.26%，該片段總體變異度較小。

3 討論

國(guó)內(nèi)外均進(jìn)行了一些針對(duì)BCoV的病原學(xué)和血清學(xué)調(diào)查研究。國(guó)外研究結(jié)果顯示，在美洲、歐洲、亞洲均有牛冠狀病毒的發(fā)生，并且是引起小牛腹瀉的重要病因，約20%～26%的小牛腹瀉是由冠狀病毒感染引起的[10-13]。國(guó)內(nèi)牛冠狀病毒調(diào)查報(bào)道涉及黃牛、奶牛、牦牛，其中牦牛核酸檢出率高達(dá)69.05%，東北三省牛冠狀病毒抗體陽(yáng)性率達(dá)100%，山東牛群調(diào)查結(jié)果也顯示BCoV 陽(yáng)性率較高，新疆北部地區(qū)奶牛場(chǎng)119份犢牛糞便樣品中檢出BCoV核酸陽(yáng)性樣品12份，且檢測(cè)到冠狀病毒的犢牛均有顯著的腹瀉癥狀[14-18]。這些報(bào)道均來(lái)自北方寒冷地區(qū)或高海拔地區(qū)，國(guó)內(nèi)南方溫暖地區(qū)近年來(lái)未見(jiàn)報(bào)道。

經(jīng)調(diào)查，本次檢測(cè)到攜帶BCoV的黃牛是2019年4月初由緬甸勐拉地區(qū)的索累港入境中國(guó)，并在云南省景洪市勐龍鎮(zhèn)一村莊短期育肥，采樣時(shí)間是4月22日，距離進(jìn)入國(guó)境已有10余天，其同圈牛并未檢出核酸陽(yáng)性樣品，該牛是由緬甸帶毒進(jìn)入中國(guó)還是在中國(guó)本地感染的目前尚不清楚，需要持續(xù)加強(qiáng)對(duì)該區(qū)域的本地牛和入境牛的監(jiān)測(cè)。牛可能來(lái)源地和病毒核酸檢出地均為熱帶地區(qū)，常年日最高氣溫在30℃左右，本次檢出BCoV雖然為個(gè)例，但至少說(shuō)明該病毒已在東南亞熱帶亞熱帶地區(qū)存在。由于本實(shí)驗(yàn)室之前無(wú)該病毒的檢測(cè)和分離，可以排除實(shí)驗(yàn)室核酸污染因素影響。

全基因組序列分析顯示，本次檢出的樣品與美國(guó)毒株US/OH3/2006相似性達(dá)到99.33%，二者具有較高的同源性，但有基因變異。結(jié)構(gòu)蛋白HE、S、M、N 與US/OH3/2006毒株的相似性分別為99.29%、99.36%、99.42%和100%，說(shuō)明結(jié)構(gòu)蛋白基因主要變異位點(diǎn)在HE基因，其次為S基因。由于結(jié)構(gòu)蛋白E基因較短，僅約255個(gè)bp，經(jīng)序列比對(duì)與本文關(guān)聯(lián)毒株無(wú)差異，且對(duì)病毒的感染力影響意義不大，因此本文未做論述。