張芮琪，卿素珠

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物工程分院/動(dòng)物疫病防控陜西省高校工程研究中心，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

免疫應(yīng)激是指由外源免疫刺激引起的動(dòng)物免疫激發(fā)，會(huì)影響動(dòng)物的生長(zhǎng)和生產(chǎn)性能[1]。免疫系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)密切聯(lián)系、相互作用，形成了以下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸為最主要應(yīng)激軸的神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)[2]。皮質(zhì)醇是應(yīng)激損傷的關(guān)鍵激素，其含量升高代表著HPA軸的激活；c-fos基因是編碼核內(nèi)蛋白的原癌基因，普遍存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，表達(dá)水平很低，難以檢測(cè)，在受刺激的情況下可以迅速短暫地表達(dá)[3]。研究表明，c-fos基因在動(dòng)物對(duì)外界的刺激中有重要作用[4]。

朱砂七[(Polygonumciliinerve(Nakai) Ohwl]為蓼科蓼屬植物毛脈蓼的塊根，屬“太白七藥”之一。其味苦、微澀，性涼，具有清熱解毒、活血涼血、止血止瀉、去風(fēng)濕、強(qiáng)腰膝等功能[5]。朱砂七多糖(Polygonumciliinervepolysaccharides，PCP)是從朱砂七中提取出來(lái)的一種有效成分，在抗氧化、抗菌、抗病毒等方面具有重要的生物活性[6-7]。研究表明，PCP能顯著降低豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率，對(duì)TGEV有較好的抑制作用[8]。另外，PCP可提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的水平[9]，減弱過(guò)氧化氫對(duì)RAW264.7細(xì)胞的損傷，增強(qiáng)細(xì)胞免疫力[10]。多糖硫酸化后可以使其原有的生物活性提高或出現(xiàn)新的藥理活性，有研究顯示某些多糖經(jīng)硫酸化修飾后其免疫活性明顯增強(qiáng)[11-13]。高硫代度的紅芪多糖硫酸酯具有較好的體外抗凝血活性[14]。有關(guān)硫酸化朱砂七多糖在動(dòng)物生產(chǎn)和免疫應(yīng)激等方面的作用尚無(wú)資料報(bào)道，本試驗(yàn)以制備的朱砂七多糖和硫酸化朱砂七多糖(sulfatedPolygonumciliinervepolysaccharides，sPCP)為材料，通過(guò)雛雞體內(nèi)試驗(yàn)，用免疫組化方法檢測(cè)各組雛雞下丘腦及腎上腺組織c-fos表達(dá)水平、血清中皮質(zhì)醇含量，研究硫酸化朱砂七多糖對(duì)新城疫疫苗免疫應(yīng)激雞下丘腦與腎上腺c-fos表達(dá)及血清皮質(zhì)醇含量的影響，為中藥多糖在抗動(dòng)物免疫應(yīng)激方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中藥多糖 朱砂七多糖由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室提供，純度為72.2%。硫酸化朱砂七多糖參照文獻(xiàn)[15]試驗(yàn)方法制備，采用氯化鋇-明膠濁度法[16]測(cè)定硫酸化朱砂七多糖的硫酸基取代度為4.31。

1.1.2 疫苗和病毒 新城疫Ⅳ系(Newcastle disease virus La Sota strain Ⅳ,NDV-Ⅳ)滅活疫苗，購(gòu)自瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司。新城疫病毒由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院禽病研究室提供，HA試驗(yàn)測(cè)得病毒效價(jià)為26。

1.1.3 試驗(yàn)用動(dòng)物 1日齡非免疫健康海蘭褐蛋公雛雞60羽，購(gòu)自楊凌惠鳳蛋禽專業(yè)合作社。

1.1.4 主要試劑 免疫組化試劑盒及c-fos一抗，皮質(zhì)醇ELISA試劑盒，檸檬酸鈉抗原修復(fù)液，DAB顯色試劑盒，Solarbio公司產(chǎn)品。

1.1.5 主要儀器 Motic數(shù)碼顯微鏡，廈門(mén)Motic實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；GTK-2002自動(dòng)恒溫?cái)偪竞嫫瑱C(jī)，西安瑞豐儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 雛雞飼養(yǎng)管理與分組 雛雞飼養(yǎng)至14日齡，隨機(jī)均分為6組，除空白對(duì)照組外，其他各組分別用新城疫Ⅳ系疫苗進(jìn)行點(diǎn)眼、滴鼻首免，28日齡二免。在首免同時(shí)，2個(gè)PCP組分別注射高(8 mg/mL)、低劑量(4 mg/mL)的PCP，2個(gè)sPCP對(duì)照組注射高(8 mg/mL)、低劑量(4 mg/mL)的sPCP，每只均為0.5 mL，對(duì)照組注射等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)3 d。

1.2.2 樣品采集 分別于首免后第7天(D21)和二免后第7天(D35)每組隨機(jī)抽取4只雞經(jīng)翼下靜脈采血2 mL，收集血清。解剖雞只，取各組雞下丘腦和腎上腺組織以40 g/L多聚甲醛浸漬固定。

1.2.3 下丘腦和腎上腺石蠟切片制作 將固定好的各組雞下丘腦和腎上腺修整后放入40 g/L多聚甲醛中固定，固定好的組織按常規(guī)組織學(xué)方法進(jìn)行石蠟包埋、連續(xù)切片，切片厚度5 μm，水浴展片，黏附載玻片撈片，40℃烘干。

1.2.4 HE染色 烘干的切片脫蠟后，下行梯度乙醇溶液復(fù)水，按常規(guī)方法進(jìn)行HE染色，切片脫水、透明，中性樹(shù)膠封固。

1.2.5 c-fos免疫組化染色 切片脫蠟，PBS清洗；加入內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑，室溫下孵育20 min，PBS清洗；加入檸檬酸鹽抗原修復(fù)緩沖液中微波修復(fù)10 min，PBS清洗；加入非免疫動(dòng)物血清(羊)，室溫下孵育20 min；加入c-fos抗體(1∶100)，室溫下孵育1 h，PBS清洗；加入生物標(biāo)記素標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃孵育30 min，PBS清洗；加入LAP標(biāo)記鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶，37℃孵育30 min，PBS清洗；加入DAB顯色液呈色，蒸餾水終止反應(yīng)；腎上腺組織再以蘇木精復(fù)染胞核，脫水、透明、封片。陰性對(duì)照以0.01 mol/L PBS液代替一抗，其余步驟同上。

1.2.7 結(jié)果觀察與照相 顯微鏡下觀察各組雞下丘腦及腎上腺組織c-fos分布情況，Motic數(shù)碼顯微照相系統(tǒng)采集圖片。

2 結(jié)果

2.1 PCP和sPCP對(duì)雞下丘腦和腎上腺組織c-fos分布的影響

2.1.1 各組雞下丘腦c-fos分布情況 經(jīng)免疫組化染色的切片，背景無(wú)色或淺黃色，c-fos免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色。

D21，對(duì)照組可見(jiàn)到數(shù)量較少的弱陽(yáng)性神經(jīng)元，其余各組雛雞下丘腦均可見(jiàn)到不同程度的c-fos免疫陽(yáng)性反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物主要出現(xiàn)于室旁核，以神經(jīng)元胞核著色為主；D35，除對(duì)照組外，其余各組雛雞下丘腦均可見(jiàn)到不同程度的c-fos免疫陽(yáng)性反應(yīng)(圖1)。

A.對(duì)照組；B.疫苗組；C.高劑量PCP組；D.低劑量PCP組；E.高劑量sPCP組；F.低劑量sPCP組A.Control group;B.Vaccine group;C.PCP high -dose group;D.PCP low-dose group;E.sPCP high-dose group;F.sPCP low-dose group.圖1 D35各組雞下丘腦室旁核c-fos免疫陽(yáng)性反應(yīng)(×100)Fig.1 The positive reactions of C-fos in paraventricular nucleus of hypothalamus in 35-day chickens of six groups(×100)

A.對(duì)照組；B.疫苗組；C.高劑量PCP組；D.低劑量PCP組；E.高劑量sPCP組；F.低劑量sPCP組A.Control group;B.Vaccine group;C.PCP high -dose group;D.PCP low-dose group;E.sPCP high-dose group;F.sPCP low-dose group.*.與疫苗組相比差異顯著(P<0.05)。*.Significant difference compared with vaccine group (P<0.05).圖2 各組雛雞下丘腦室旁核內(nèi)c-fos陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量Fig.2 The number of c-fos positive neuron in paraventricular nucleus of hypothalamus of chickens in six groups

2.1.2 PCP和sPCP對(duì)雞腎上腺c-fos表達(dá)的影響 雞的腎上腺包括被膜、皮質(zhì)和髓質(zhì)，皮質(zhì)與髓質(zhì)相混，界限不清。在實(shí)質(zhì)的邊緣、被膜下方可見(jiàn)到交感神經(jīng)節(jié)。c-fos免疫組化染色結(jié)果顯示，除了對(duì)照組外，各組雞腎上腺皮質(zhì)以及交感節(jié)均有不同程度c-fos免疫陽(yáng)性反應(yīng)(圖3)。

A.對(duì)照組，呈c-fos陰性反應(yīng)；B.疫苗組，皮質(zhì)出現(xiàn)廣泛的c-fos強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)；C.高劑量PCP組，皮質(zhì)有較強(qiáng)的c-fos陽(yáng)性反應(yīng)；D.低劑量PCP組；E.高劑量sPCP組；F.低劑量sPCP組；D、E、F可見(jiàn)皮質(zhì)較弱的c-fos陽(yáng)性反應(yīng)。圖A.×400，圖B-圖F.×100。A.The control group shows the negative reaction of c-fos;B.Vaccine group shows the wide range of strong positive reactions of c-fos;C.PCP high-dose group shows the stronger positive reaction of c-fos in adrenal cortex;D.PCP low-dose group;E.sPCP high-dose group;F.sPCP low-dose group;D-F.The weak positive reactions of c-fos were shown in Fig D，F(xiàn)ig E and Fig.F.FigA.×400；FigB-FigF.×100圖3 PCP和sPCP對(duì)D35雞腎上腺組織中c-fos表達(dá)的影響Fig.3 Effects of PCP and sPCP on c-fos distributions in chicken adrenal glands at 35-day

各組雛雞腎上腺組織中c-fos陽(yáng)性反應(yīng)情況如表2所示。由表2可知，在D21和D35，與新城疫疫苗組相比，PCP組及sPCP組腎上腺皮質(zhì)c-fos陽(yáng)性反應(yīng)程度均有所下降，以低劑量sPCP組效果最好，表明PCP和sPCP均有一定的抗應(yīng)激作用，硫酸化修飾后PCP抗應(yīng)激效果有所增強(qiáng)。

2.2 各組雛雞血清中皮質(zhì)醇含量變化

按照ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程式為：y=0.0219x+0.539(圖4)。

圖4 雞血清皮質(zhì)醇含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of cortisol levels in chicken serum

按相應(yīng)的回歸方程，得出各組雛雞血清中皮質(zhì)醇含量如圖5所示。由圖可知，D21時(shí)，低劑量sPCP組和空白對(duì)照組皮質(zhì)醇含量與疫苗組相比，均差異顯著(P<0.05)，sPCP低劑量組及PCP組的血清皮質(zhì)醇含量均低于疫苗組，但彼此之間差異不顯著(P>0.05)；D35時(shí)，PCP組和sPCP組血清皮質(zhì)醇含量均低于疫苗組，差異也不顯著(P>0.05)。

A.對(duì)照組；B.疫苗組；C.高劑量PCP組；D.低劑量PCP組；E.高劑量sPCP組；F.低劑量sPCP組A.Control group;B.Vaccine group;C.PCP high -dose group;D.PCP low-dose group;E.sPCP high-dose group;F.sPCP low-dose group.*.與疫苗組相比差異顯著(P<0.05)*.Significant difference compared with vaccine group (P<0.05).圖5 各組雞血清皮質(zhì)醇含量Fig.5 Cortisol levels in chicken serum

3 討論

應(yīng)激發(fā)生時(shí)，首先作用于神經(jīng)系統(tǒng)，激活HPA軸，改變相應(yīng)腦區(qū)的內(nèi)分泌機(jī)能。下丘腦為間腦前臂，可以接受末端信息、調(diào)節(jié)交感神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌功能，影響與應(yīng)激有關(guān)的行為、神經(jīng)內(nèi)分泌免疫活動(dòng)。大多數(shù)細(xì)胞中的c-fos基因表達(dá)量低，神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)c-fos基因在各種外源或內(nèi)源性的刺激下，發(fā)生短暫迅速的高水平表達(dá)，將外界信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榛虮磉_(dá)，因其表達(dá)后的蛋白因子核內(nèi)磷酸化蛋白(fos)生物活性有類似的第二信使的作用，所以又被稱為第三信使。研究表明，存在空泡性損害的神經(jīng)元中檢測(cè)到c-fos蛋白的合成，c-fos蛋白表達(dá)的區(qū)域表明該部位存在不同程度的神經(jīng)元損害[18]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)各組雛雞下丘腦室旁核內(nèi)c-fos陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)可知，下丘腦c-fos陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量由高到低依次為疫苗組>高劑量PCP組>低劑量PCP組>高劑量sPCP組>低劑量sPCP組>對(duì)照組，說(shuō)明給予PCP和sPCP可減少疫苗免疫雛雞下丘腦室旁核c-fos陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目，其中低劑量sPCP組和疫苗組相比差異顯著(P<0.05 )，說(shuō)明低劑量的sPCP對(duì)疫苗應(yīng)激引起的下丘腦c-fos表達(dá)有下調(diào)作用。腎上腺c-fos免疫組化染色結(jié)果顯示，除了對(duì)照組外，各組雞腎上腺皮質(zhì)以及交感節(jié)均有不同程度c-fos免疫陽(yáng)性反應(yīng)；在D21和D35，與疫苗組相比，PCP組及sPCP組腎上腺皮質(zhì)c-fos陽(yáng)性反應(yīng)程度均有所下降，以低劑量sPCP組效果最好，表明PCP和sPCP均有一定的抗應(yīng)激作用，硫酸化修飾后PCP抗應(yīng)激效果增強(qiáng)。

表1 PCP和sPCP對(duì)雞腎上腺組織中c-fos表達(dá)的影響Table 1 Effects of PCP and sPCP on c-fos expressions in chicken adrenal glands

皮質(zhì)醇是應(yīng)激損傷的關(guān)鍵激素，它的含量升高代表著HPA軸的激活。此外，皮質(zhì)醇的免疫抑制作用已廣為接受，皮質(zhì)醇可使淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，使單核吞噬細(xì)胞功能降低。有研究表明血清皮質(zhì)醇水平能在一定程度上代表慢性應(yīng)激對(duì)機(jī)體的損傷程度[17]。糖皮質(zhì)激素是HPA 軸的終末產(chǎn)物，因此常作為研究應(yīng)激的最經(jīng)典、最重要的指標(biāo)之一。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，D21時(shí)，低劑量sPCP組和空白對(duì)照組皮質(zhì)醇含量與疫苗組相比均差異顯著(P<0.05)，sPCP低劑量組及PCP組的血清皮質(zhì)醇含量均低于疫苗組，但差異不顯著(P>0.05)；D35時(shí)，PCP組和sPCP組血清皮質(zhì)醇含量均低于疫苗組，差異亦不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明PCP和sPCP具有一定的抗免疫應(yīng)激作用，且以低劑量sPCP效果最好。