陳文東，朱秀娟，何玉鵬，王 昱，徐永平

(1.隴南師范高等?？茖W(xué)校 農(nóng)林技術(shù)學(xué)院，甘肅成縣 742500；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

催產(chǎn)素(oxytocin,OT)是由9個氨基酸組成，在血液循環(huán)中以自由肽形式存在的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，主要在下丘腦視上核、室旁核的大細胞中合成。其發(fā)揮的多種作用都是通過催產(chǎn)素受體(oxytocin receptor,OTR)介導(dǎo)的。OTR是一種由9個氨基酸組成的含有7個跨膜結(jié)構(gòu)域的多肽,OTR與G蛋白藕聯(lián),激活磷脂酶C,通過細胞內(nèi)的磷酸肌醇信號系統(tǒng),誘導(dǎo)細胞質(zhì)Ca2+濃度的增加,從而導(dǎo)致分娩時子宮強烈收縮[1-2]。OT廣泛分布于黃體、卵巢、羊膜、絨毛、胎盤、蛻膜、睪丸、胸腺、腎上腺和胰腺等器官，通過與各部位的OTR結(jié)合發(fā)揮作用。其中在心臟、黃體、睪丸、胸腺還可以局部合成。此外，OT在腦內(nèi)亦有廣泛的受體結(jié)合位點，如下丘腦、海馬、杏仁核、紋狀體、伏隔核(nacc)、終紋床核(bnst)、腦干，參與痛覺調(diào)控、性行為、學(xué)習(xí)、社會交往、記憶等高級神經(jīng)活動[3]。

頸中神經(jīng)節(jié) (middle cervical ganglion,MCG) 是交感節(jié)后神經(jīng)元的聚合體，其發(fā)出分支主要支配心臟及附近大血管[4]。有研究表明，OT被當(dāng)作一種心血管激素，可調(diào)節(jié)血管張力和控制心臟功能發(fā)揮內(nèi)分泌調(diào)節(jié)作用，OT亦可在大血管和心臟處合成釋放，與心臟上的OTR結(jié)合發(fā)揮降低心率和收縮力的旁分泌作用[5]。OT作為下丘腦—垂體—性腺軸上一種重要的激素，除了可以發(fā)揮內(nèi)分泌和自分泌作用外，是否可以通過外周神經(jīng)通路對心血管系統(tǒng)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，以及OT對心血管的激素調(diào)節(jié)和經(jīng)頸中神經(jīng)節(jié)的交感節(jié)后纖維對心血管的神經(jīng)調(diào)節(jié)這兩種調(diào)節(jié)方式之間是否存在聯(lián)系，缺乏相關(guān)的研究資料。本試驗采用免疫組織化學(xué)SP法，檢測山羊頸中神經(jīng)節(jié)內(nèi)OTR的表達分布特點，為探索山羊頸中神經(jīng)節(jié)是否具有成為OT對內(nèi)臟器官進行內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和通過自主神經(jīng)對內(nèi)臟器官進行神經(jīng)調(diào)節(jié)兩者相互協(xié)調(diào)作用節(jié)點的條件提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 楊凌農(nóng)戶養(yǎng)殖的成年關(guān)中奶山羊，雌雄各5只，臨床健康，雌性未孕。全部試驗在西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)實驗室完成。

1.1.2 主要試劑 免疫組化SP超敏試劑盒(貨號KIT-9706)和內(nèi)源性生物素阻斷試劑盒(貨號BLK-0001)，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品；兔抗OTR多克隆抗體(貨號BA23081)，北京康為世紀生物科技有限公司產(chǎn)品；四鹽酸3,3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(貨號M1417-1)，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 石蠟切片機(RM2235)，德國Leica公司產(chǎn)品；生物顯微鏡(BA310)，Motic實業(yè)集團有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 切片染色 將健康非妊娠成年山羊頸總動脈放血處死，迅速取出其頸中神經(jīng)節(jié)，置于40 g/L多聚甲醛磷酸緩沖液中固定12 h，自來水沖洗12 h，經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，包埋，石蠟切片機7 μm連續(xù)切片。切片分4套，第1套做HE染色，用于觀察神經(jīng)節(jié)的形態(tài)結(jié)構(gòu)。第2套做免疫組織化學(xué)染色用于圖像分析，切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精復(fù)水，然后進行抗原修復(fù)，SP試劑盒A、B、C、D液分別孵育20 min，并在B液之后用1∶250稀釋的兔抗OTR多克隆抗體孵育，空白對照用PBS代替，4℃下過夜，最后DAB顯色5 min、梯度酒精脫水、中性樹膠封片。第3套做空白對照，并用蘇木素復(fù)染，用于檢測非特異性染色。第4套在DAB顯色后用蘇木素復(fù)染，用于定位觀察神經(jīng)節(jié)內(nèi)各陽性結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 頸中神經(jīng)節(jié)的光鏡結(jié)構(gòu)特點

山羊頸中神經(jīng)節(jié)表面包裹一層結(jié)締組織被膜，其與神經(jīng)節(jié)內(nèi)結(jié)締組織相連。山羊頸中神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)元多成群分布。由圖1可見，頸中神經(jīng)節(jié)中可見神經(jīng)細胞成群分布，相對于其他細胞，神經(jīng)細胞(圖1-A)體積較大，胞體結(jié)構(gòu)各異，各神經(jīng)細胞之間及神經(jīng)細胞與周圍組織之間邊界清晰，結(jié)構(gòu)完整，還可見部分無核神經(jīng)細胞。頸中神經(jīng)節(jié)內(nèi)神經(jīng)細胞大小不等，最大神經(jīng)細胞直徑達47.87 μm，最小直徑為19.95 μm(測量有核神經(jīng)細胞，Image-pro plus 6.0測量)。神經(jīng)細胞胞質(zhì)(圖1-C)著色為紫紅色；胞核(圖1-B)呈圓形或卵圓形，在神經(jīng)細胞的邊緣或正中央位置，著色為藍色，少部分胞核內(nèi)可見核仁結(jié)構(gòu)，染色較核質(zhì)顏色更深。神經(jīng)細胞周邊有支持細胞(圖1-G)環(huán)繞，其形態(tài)扁平狀，結(jié)構(gòu)清晰。在眾多神經(jīng)細胞之間有神經(jīng)纖維(圖1-D)和微血管(圖1-E)通過，神經(jīng)纖維上包裹有雪旺細胞(圖1-H)，胞核呈長卵圓狀；微血管內(nèi)壁上的血管內(nèi)皮細胞(圖1-F)清晰可見，微血管管腔內(nèi)可見有少量血細胞存在，著色為紅色。

Ⅰ.山羊頸中神經(jīng)節(jié)HE染色。Ⅱ.山羊頸中神經(jīng)節(jié)HE染色。A.神經(jīng)細胞；B.細胞核；C.細胞質(zhì)；D.過路纖維；E.微血管；F.血管內(nèi)皮細胞；G.支持細胞；H.雪旺細胞Ⅰ.HE staining of the middle cervical ganglion in goat;Ⅱ.HE staining of the middle cervical ganglion in goat.A.Nerve cells;B.Nuclei;C.Cytoplasm;D.Passing nerve fibers;E.Microvassel;F.Vascular endothelial cells;G.Sertoli cells;H.Schwan cells圖1 山羊頸中神經(jīng)節(jié)的微細結(jié)構(gòu)(400×)Fig.1 Microscopic structure of middle cervical ganglion of goats (400×)

2.2 OTR的免疫組織化學(xué)染色

對照組切片復(fù)染結(jié)果(圖2-1)可見，神經(jīng)細胞胞體著色為淺紫色，神經(jīng)細胞胞核著色為深紫色，整個切片背景淺藍色，沒有其他著色。切片復(fù)染結(jié)果(圖2-2)可見，神經(jīng)細胞胞體著色為棕褐色或黃褐色，其他非神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)胞核著色為紫色，證明本試驗免疫組化SP染色結(jié)果沒有非特異性著色。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(圖2-3、圖2-4)可見，頸中神經(jīng)節(jié)各種細胞著色深淺不一，根據(jù)著色深淺將OTR表達分為4個等級，棕褐色為強陽性，黃褐色為中等陽性，淡黃色為弱陽性，無著色或淺黃色為陰性反應(yīng)。試驗組免疫組化SP染色結(jié)果顯可見，OTR在雌雄山羊頸中神經(jīng)節(jié)內(nèi)的分布未見明顯差異，山羊頸中神經(jīng)節(jié)內(nèi)OTR免疫陽性產(chǎn)物分布廣泛，神經(jīng)細胞、過路神經(jīng)纖維、血管內(nèi)皮細胞、支持細胞和雪旺細胞均有不同程度的著色。OTR免疫陽性產(chǎn)物在神經(jīng)細胞的胞質(zhì)(圖2-C)和細胞核核膜(圖2-B)著色最深，為棕褐色，呈強陽性。大部分神經(jīng)細胞胞質(zhì)著色為黃褐色，呈中等陽性，這部分神經(jīng)細胞胞質(zhì)約占神經(jīng)細胞總數(shù)的91%。血管內(nèi)皮細胞(圖2-F)、細胞膜，以及一小部分神經(jīng)細胞胞質(zhì)和少量神經(jīng)纖維(圖2-D)著色較淺，為淡黃色，呈弱陽性。大部分的過路神經(jīng)纖維著色極淺或不著色，為陰性。

2.3 頸中神經(jīng)節(jié)中OTR的相對表達量

圖像分析結(jié)果表明，頸中神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)細胞內(nèi)的OTR相對表達量極顯著大于非神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)(P<0.01，表1)。

表1 頸中神經(jīng)節(jié)中OTR的表達量分析Table 1 The expression of OTR in the middle cervical ganglion

3 討論

動物體內(nèi)OT與OTR特異性結(jié)合是其發(fā)揮生物學(xué)功能的必要條件之一[6]。OTR存在于小鼠體內(nèi)乳腺、腎臟和子宮等器官，尤其在腎小管、子宮基質(zhì)細胞和乳腺上皮細胞中含量最高[7]。研究表明，OT基因敲除小鼠在繁殖、交配、新生鼠大小、懷孕和性行為等方面與正常小鼠無顯著差異，但基因敲除小鼠的新生后代會在24 h內(nèi)全部死亡，此種現(xiàn)象與基因敲除小鼠乳汁分泌和母性缺失有關(guān)，除此之外，基因敲除小鼠還出現(xiàn)明顯的肥胖、體溫升高、攻擊行為、社交記憶和社交情感降低現(xiàn)象[8-9]。以上資料表明，OT具有調(diào)控雌性動物泌乳、生殖、能量代謝、社交和母性行為的功能，且這些功能的行使都是通過OTR激活來完成的。傘明君[10]利用OTR基因過表達小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，OTR可誘導(dǎo)小鼠排卵異常、卵巢多囊癥、基礎(chǔ)代謝率升高和體重減輕。Kodama Y等[11]發(fā)現(xiàn)，在惡性間皮瘤組織中有大量的OTR表達，OTR基因敲除試驗可顯著降低高表達OTR的惡性間皮瘤細胞增殖，口服OTR拮抗劑可明顯抑制惡性間皮瘤的進展，表明OTR在惡性間皮瘤細胞增殖中起著至關(guān)重要的作用，是一個非常有希望的潛在治療靶點，并可能成為惡性間皮瘤的預(yù)后生物標記物，黃雙[12]等利用免疫組織化學(xué)SP法發(fā)現(xiàn)OTR在山羊頸動脈體內(nèi)廣泛分布，以此推斷OT可能以分泌方式調(diào)節(jié)頸動脈體的血流量。OTR在小鼠海馬CA2和CA3區(qū)、整個皮質(zhì)和皮質(zhì)杏仁核、嗅前區(qū)、弓狀下丘腦核和背側(cè)內(nèi)膜狀核表達[6]。在哺乳動物大腦經(jīng)典獎賞通路內(nèi)(多巴胺獎賞通路)廣泛分布[13]，如腹側(cè)被蓋區(qū)、腹側(cè)紋狀體和伏隔核等核心節(jié)點[14]，OTR分布于海馬、前扣帶回皮層和杏仁核等位置發(fā)揮記憶、學(xué)習(xí)和親社會學(xué)習(xí)等功能[15-16]。

動物機體內(nèi)臟生理活動受植物性神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)共同調(diào)控。頸中神經(jīng)節(jié)屬于植物性神經(jīng)系統(tǒng)交感節(jié)后神經(jīng)元，位于動物迷走交感干中段，鎖骨下動脈前方，呈橢圓形，灰褐色[17]，其發(fā)出節(jié)后纖維支配胸腔內(nèi)心臟和附近大血管。而有研究發(fā)現(xiàn)OTR可在動物機體心臟和大血管處介導(dǎo)OT的旁分泌作用，有關(guān)OTR在外周神經(jīng)系統(tǒng)分布的報道中，任妮[18-19]、陳文東[20]等采用免疫組織化學(xué)SP法分別在山羊頸胸神經(jīng)節(jié)、腸系膜前神經(jīng)節(jié)、頸前神經(jīng)節(jié)和腸系膜后神經(jīng)節(jié)發(fā)現(xiàn)有OTR表達，推斷OT可能會作用于交感節(jié)后神經(jīng)元，通過交感節(jié)后纖維對其所支配的內(nèi)臟器官發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。本研究通過免疫組織化學(xué)試驗技術(shù)證實，OTR免疫陽性產(chǎn)物在山羊頸中神經(jīng)節(jié)內(nèi)廣泛表達分布，且頸中經(jīng)節(jié)神經(jīng)細胞內(nèi)的OTR陽性產(chǎn)物表達量極顯著大于其他非神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)(P<0.01)。OTR主要表達分布在山羊頸中神經(jīng)節(jié)交感節(jié)后神經(jīng)細胞內(nèi)，提示OT發(fā)揮作用的主要靶細胞為山羊頸中神經(jīng)節(jié)中的交感節(jié)后神經(jīng)細胞，表明山羊頸中神經(jīng)節(jié)具有OT對內(nèi)臟器官進行內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和通過自主神經(jīng)對內(nèi)臟器官進行神經(jīng)調(diào)節(jié)兩者相互協(xié)調(diào)作用節(jié)點的條件，但催產(chǎn)素通過植物性神經(jīng)對心血管活動產(chǎn)生什么樣的影響，還有待進一步研究。