巴愛(ài)麗，楊 靖，賈菲蕓，樊苗苗，張 冉，李友勇

(河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院/現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南新鄉(xiāng) 453003)

0 引 言

【研究意義】玉米雜種優(yōu)勢(shì)類群是現(xiàn)代玉米品種改良的重要概念之一[1,2]。劃分玉米自交系的雜種優(yōu)勢(shì)群，早期主要使用系譜法和測(cè)交法[2-4]，20世紀(jì)80年代開(kāi)始應(yīng)用SSR分子標(biāo)記法[5]，2000年后單核苷酸多態(tài)性SNP(Single nucleotide polymorphism )分子標(biāo)記法得以應(yīng)用[6]。系譜法和測(cè)交法目前更多的是用于驗(yàn)證分類；SNP分子標(biāo)記法，具高通量，是目前玉米自交系雜種優(yōu)勢(shì)群劃分的先進(jìn)方法，但SSR分子標(biāo)記方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、低成本，仍是目前常用方法?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】SSR分子標(biāo)記劃分類群，早期引物體系中的引物數(shù)量較多，有70對(duì)到90對(duì)[7-10]，后來(lái)多用40對(duì)[11-13]，也有使用30對(duì)和20對(duì)體系劃分報(bào)道[14-17]。但在應(yīng)用這些引物體系時(shí)，部分引物的PIC值(多態(tài)信息含量，polymorphism information content)下降，多態(tài)性變差?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】SSR分子標(biāo)記體系是一個(gè)高可靠性、低成本的玉米雜種優(yōu)勢(shì)群劃分工具，但部分引物多態(tài)性在新選育的自交系中常有降低改變。建立新引物體系，需要篩選高多態(tài)引物,重新在玉米染色體上遴選均勻分布的SSR，包括過(guò)去常用的核心SSR，在已知類群的自交系中測(cè)試分類，篩選高多態(tài)引物，構(gòu)建新引物體系。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】 遴選均勻分布在玉米10個(gè)連鎖群上160對(duì)SSR引物，在104份玉米自交系DNA中擴(kuò)增，檢測(cè)過(guò)去的核心引物在新培育的自交系中PIC值的穩(wěn)定性，重新利用高PIC值引物建立新引物體系。

1 材料與方法

1.1 材 料

自交系多數(shù)屬黃淮地區(qū)種質(zhì)，一部分系是類群的代表自交系，如鄭58、昌7-2、B73、PH6WC、PH4CV、E28等，另一大部分是近些年改良的自交系，親緣關(guān)系已知，并經(jīng)多代測(cè)交，所屬類群基本明確。國(guó)內(nèi)玉米自交系雜種優(yōu)勢(shì)群及其代表自交系近些年有所變化，類群及代表自交系的種質(zhì)體系是：黃改群(Improved Huang)，即四平頭群，過(guò)去的代表自交系是黃早4，試驗(yàn)代表自交系是昌7-2、浚92-6、浚92-8等；瑞德群和改良瑞德群在不同時(shí)期內(nèi)涵不一，早期的改良瑞德群(Improved Reid)[3]，也稱PA[4]，也有稱瑞德的[10，13]，也有報(bào)道把瑞德和改良瑞德分開(kāi)了，瑞德群(Reid)，指未被改良或改良程度較低的美國(guó)等地來(lái)源自交系，代表自交系過(guò)去是B73，目前先玉335母本PH6WC也在其中[12]；改良瑞德群指過(guò)去典型代表自交系掖478改良演化的類群，目前代表自交系是鄭58及相近系[11,13]。蘭卡斯特群(Lancaster，也常稱蘭卡等)，名稱沒(méi)有變化，典型代表自交系過(guò)去是MO17，目前先玉335父本PH4CV血緣的自交系也屬該類群[13,18]。旅大紅骨(Lvda-Red-Cob)，也常稱旅群、旅系，類群的名字和內(nèi)涵沒(méi)有變化，但黃淮地區(qū)利用的雜交種中該類群的種質(zhì)比例已較小，僅有E28、W245等少數(shù)幾個(gè)系。表1

表1 104份玉米自交系名稱及種質(zhì)親緣Table 1 The names of 104 maize inbred lines and their germplasm relatives

續(xù)表1 104份玉米自交系名稱及種質(zhì)親緣Table 1 The names of 104 maize inbred lines and their germplasm relatives

1.2 方 法

1.2.1 SSR擴(kuò)增

SSR引物選取已報(bào)道的核心SSR引物[6-8,10,12,13,18]，從玉米SSR標(biāo)記庫(kù)(http://www.maizegdb.org/ssr.php)中遴選補(bǔ)充。按4倍量遴選引物，共160個(gè)，每個(gè)染色體上16個(gè)，均勻分布，標(biāo)記引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

DNA提取的材料處理方法參考玉米SSR技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)[11,19]，自交系種子在25～28℃培養(yǎng)室中發(fā)芽，幼芽長(zhǎng)至5～8 cm，取6～10株幼苗葉片，剪0.5 cm小段，混合均勻稱取0.25 g，CTAB法提取總DNA[13,14]，純度和濃度檢測(cè)使用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)法[12,20]。

PCR擴(kuò)增技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)使用10 μL反應(yīng)體系[11,19]：滅菌超純水6.38 μL，10×Buffer(Mg2+)1 μL，dNTP(2.5 mM)0.8 μL，TaqDNA Polymerase(5 U/μL)0.12 μL，DNA模板(50 ng/μL)0.8 μL，引物(10 μmol/L)0.8 μL；PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min，35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94℃變性1 min，55～69℃(根據(jù)引物確定)退火1 min，72℃延伸2 min；45個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后4℃保存，8%變性聚丙酰胺凝膠75W電泳1 h左右，銀染顯色[11～14]。

1.2.2 遺傳參數(shù)

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物讀帶參考李玥等[20]方法，在凝膠相同位置，有條帶標(biāo)記為1，無(wú)條帶標(biāo)記為0，缺失標(biāo)記記為-9，讀取的基因型建立遺傳相似系數(shù)矩陣，PowerMarkerV3.2[21]計(jì)算各引物在自交系間的多態(tài)信息指數(shù)PIC，NTSYS-pc2.10軟件[22]對(duì)遺傳相似矩陣進(jìn)行中心化處理，UPGMA方法層次聚類分析，Structure2.3.1軟件[23]處理遺傳相似系數(shù)矩陣，K值分析法估算各自交系群體遺傳結(jié)構(gòu)數(shù)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 高多態(tài)引物篩選

研究表明，其中63對(duì)引物擴(kuò)增的帶型清晰，分離良好，基因型多態(tài)性豐富，有4-7個(gè)等位基因，該63對(duì)引物與過(guò)去報(bào)道的核心引物體系比較對(duì)照，保留比例30%～40%。圖1

圖1 兩個(gè)引物(a, bnlg1702，和b, umc1084)在部分玉米自交系DNA中的擴(kuò)增SSR圖譜Fig.1 SSR gel graphs amplified by both of primers(a, bnlg1702, and b, umc1084) in DNA of partial maize inbred lines

2.2 新引物體系遴選

研究表明，40對(duì)引物分類42份自交系為4大類群，分別是瑞德、改良瑞德、蘭卡斯特和黃改，各群內(nèi)的自交系數(shù)目與已知類群中的自交系數(shù)目完全一致；30對(duì)體系結(jié)果與40對(duì)體系比較有2個(gè)材料差異，差異比率4.76%；20對(duì)體系有4個(gè)材料變化，差異比率9.5%；10對(duì)體系的結(jié)果在4個(gè)群中有7個(gè)材料變化，差異比率為16.7%。表2，表3

表2 遴選的4套引物及遺傳參數(shù)Table 2 Selected 4 sets of primers and their genetic parameters

表3 4套引物體系分類42份玉米自交系的類群及類群內(nèi)的自交系數(shù)目Table 3 The groups and the number of inbred lines in each group, classification of 42 inbred lines by 4 sets of primer systems

2.3 新引物體系的應(yīng)用聚類

研究表明，在0.30距離位置的二級(jí)分類下，104份材料被劃分為4大類群，在0.32距離的三級(jí)分類下，自交系被劃分為5大類群，二級(jí)分類中沒(méi)有劃分出的旅大紅骨在三級(jí)分類下出現(xiàn)。主群下均有1個(gè)小亞群，自交系數(shù)量不多，但與群內(nèi)多數(shù)成員距離較遠(yuǎn)，如與蘭卡相近的擬蘭卡群，與瑞德相近的擬瑞德群，以及擬黃改群等，根據(jù)材料來(lái)源，這些亞群中的成員多是主群內(nèi)和相近群間雜交后純合的混合種質(zhì)，被聚類為獨(dú)立亞群，引物體系的高分辨率。20對(duì)引物體系的分類結(jié)果與40對(duì)引物體系比較，群中的多數(shù)材料仍保持一致，劃分結(jié)果不同的自交系有8個(gè)，分別是易選-2、W246、鄭22優(yōu)、D2-5、543PH6、12Y09、CPH4CV和FW1，占材料總數(shù)的7.69%，是混合型種質(zhì)。圖2

圖2 40對(duì)引物分類104份玉米自交系聚類Fig.2 Cluster graph of 104 maize inbred lines classified by 40 pairs of primers

2.4 新引物體檢測(cè)系的群體遺傳結(jié)構(gòu)

研究表明，當(dāng)類群數(shù)(K值)設(shè)1～15，△K值在K=4時(shí)達(dá)到最大值，即材料主體為4大種質(zhì)類群，與層次聚類結(jié)果的類群數(shù)一致。K=9時(shí)，△K值有一個(gè)小的峰值，反映主群下亞群種質(zhì)差異。4個(gè)類群是反映該104份自交系的群體最優(yōu)遺傳結(jié)構(gòu)，9個(gè)類群能反映較細(xì)節(jié)差異，因7個(gè)類群即可識(shí)別旅大紅骨群，設(shè)K=7，計(jì)算各自交系的遺傳組成，典型類群代表自交系，如鄭58、昌7-2、PH6WC、PH4CV、E28等，均是所屬群體的單一成分；主群下亞群的自交系，則是非單一成分，如小亞群中的登海516父本PHBIM，遺傳結(jié)構(gòu)中瑞德0.506 5，旅大紅骨0.336 7；迪卡517父本的改良系W517F，蘭卡0.288 9，黃改0.446 5，還有20對(duì)引物與40對(duì)引物分類中改變類群的自交系，易選-2、鄭22優(yōu)、D2-5、543PH62、12Y09、CPH4CV和FW1，均是多遺傳結(jié)構(gòu)成分。圖3,表4

圖3 40對(duì)引物體系檢測(cè)的104份玉米自交系群體結(jié)構(gòu)Fig.3 The population structure of 104 maize inbred lines detected by 40 pairs of primers

表4 104份材料中部分典型自交系的群體遺傳組成Table 4 Population genetic composition of partial of 104 inbred lines

續(xù)表4 104份材料中部分典型自交系的群體遺傳組成Table 4 population genetic composition of partial of 104 inbred lines

3 討 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果的63對(duì)高多態(tài)引物中，過(guò)去的引物保留40%左右；當(dāng)高多態(tài)引物數(shù)量大于引物體系引物數(shù)量時(shí)，引物體系不是唯一的，可在高PIC值引物間隨機(jī)組合，特定地區(qū)、特定時(shí)期的玉米自交系的高PIC值引物可能不同，能篩選出新的高PIC值特定引物體系。

自交系分類結(jié)果是直觀的，但要判斷兩自交系間遺傳差異，群體遺傳結(jié)構(gòu)結(jié)果更重要。那些單群體結(jié)構(gòu)成分自交系，如類群代表自交系，其類群和群體結(jié)構(gòu)是一致的，不同引物體系劃分的類群一般也比較穩(wěn)定，群間遺傳差異明確；但多群體結(jié)構(gòu)成分自交系，類群和群體結(jié)構(gòu)不完全一致，比較不同個(gè)體遺傳差異時(shí)，往往要比較類群結(jié)構(gòu)成分，這些個(gè)體在不同的材料體系和不同引物體系中，其類群易變，群體結(jié)構(gòu)成分也易變。但這些材料，多態(tài)位點(diǎn)多，創(chuàng)新性強(qiáng)，正確組配可能產(chǎn)生創(chuàng)新組合，甚至新雜優(yōu)模式。Zhang等[24]檢測(cè)到鄭58中有旅群“單340”來(lái)源的遺傳成分，趙久然等[25]在解析京科968等玉米新組合雜優(yōu)模式時(shí)認(rèn)為母本是一個(gè)新類群，稱X群。檢測(cè)和認(rèn)識(shí)新材料的類群和群體結(jié)構(gòu)，需要不斷篩選和建立新的引物體系，使檢測(cè)的結(jié)果更準(zhǔn)確，更有指導(dǎo)價(jià)值。

4 結(jié) 論

在包括常用核心引物在內(nèi)的160對(duì)引物中篩選高多態(tài)引物63對(duì)，按染色體分布和PIC值遴選的40對(duì)引物體系，能正確識(shí)別國(guó)內(nèi)各類群代表自交系的遺傳多態(tài)性，也能有效識(shí)別混合種質(zhì)基因型，是一個(gè)分類精度較高的新引物體系，適用于新玉米自交系類群的劃分；20對(duì)引物體系，能達(dá)到40對(duì)體系的92.3%的分辨率，雖稍低，但檢測(cè)工作量減半，在批量材料分類中有利用價(jià)值。