張美晶

(北京市密云區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，北京密云區(qū) 101500)

支原體(Mycoplasma)是廣泛存在于自然界中能自我復(fù)制的原核微生物，可以引起禽類、哺乳動物及人類的呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)疾病及關(guān)節(jié)炎、乳腺炎及眼炎等疾病，已成為臨床中常見的危害多種動物的病原體[1-2]。牛支原體病在世界各地均有流行，其中20多種支原體可感染不同日齡的牛，且感染率和病死率均較高，給牛養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[3-4]。牛支原體可引起不同日齡牛的肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳房炎、流產(chǎn)及生殖器感染等一系列疾病，犢牛以肺炎、中耳炎、關(guān)節(jié)炎為主，母牛以乳房炎為主[5-6]。1983年我國首次報道從患乳房炎奶牛中分離得到支原體[7]，后相繼又從呼吸道疾病死亡的肉牛和犢牛肺臟中分離到牛支原體。臨床中牛以發(fā)熱、咳嗽和流鼻涕為主要癥狀，嚴重的可以導(dǎo)致壞死性肺炎，被確診為牛支原體感染所致的牛支原體肺炎。支原體肺炎已成為引起牛呼吸系統(tǒng)疾病的主要病原之一，且在多個國家和地區(qū)流行，嚴重危害牛的健康[7-10]。臨床中支原體感染主要通過抗生素防控，由于支原體缺乏細胞壁結(jié)構(gòu)，對廣譜抗生素不敏感，且隨著抗生素的使用，其耐藥性越來越嚴重，耐藥菌株逐漸增多，嚴重影響治療效果[11]。

本研究對2019年-2021年從密云地區(qū)規(guī)模化牛養(yǎng)殖場采集1 294份(每份血清對應(yīng)每份病料組織)疑似支原體感染病料組織進行支原體感染情況檢測，并對檢測陽性的樣品進行支原體菌株分離鑒定和分離菌株的耐藥性分析，以期為該地區(qū)牛養(yǎng)殖場支原體臨床合理用藥及防控提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 2019年-2021年，采集密云地區(qū)規(guī)?；ｐB(yǎng)殖場中出現(xiàn)呼吸道疾病病死牛的樣品，病牛主要表現(xiàn)為呼吸困難、采食量減少，尤其是9月份以后發(fā)病嚴重，以調(diào)運的肉牛發(fā)病為主，發(fā)病率在45%以上，病死率20%。共采集病死牛(肉牛及奶牛)的血清及肺臟等病料組織共計1 294份(每份血清對應(yīng)每份病料組織)，其中2019年采集 421份、2020年采集433份、2021年 采集440份。

1.1.2 主要試劑 牛支原體ELISA抗體檢測試劑盒，購自比利時Bio-X公司；PPLO瓊脂培養(yǎng)基、PPLO液體培養(yǎng)基、改良Frey液體培養(yǎng)基，均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒，均購自北京索萊寶科技有限公司；抗支原體類藥物藥敏紙片，購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司；細菌微量生化鑒定管，購自海博生物技術(shù)有限公司；DL 2000 Maker，2×TaqMaster Mix，購自寶生物生物(大連)有限公司。

1.1.3 主要儀器 雙人超凈工作臺，博科(BIOBASE)公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱，蕪湖華測儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；小型離心機、多功能PCR儀、凝膠成像儀，ThermoFisher公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 牛支原體感染檢測 采用牛支原體ELISA抗體檢測試劑盒和PCR方法對采集的樣品(血清和病料組織)進行支原體感染檢測。參照牛支原體ELISA抗體檢測試劑盒說明書檢測血清中牛支原體抗體水平；參照文獻[12-13]報道的牛支原體16S rRNA通用引物，5′-CCTTAGGCAGTTTCTTTATAA-3′，5′-CATGCATGTCGAGCGATGAT-3′，目的片段大小為253 bp，以提取病料組織DNA為模板，進行牛支原體的PCR檢測，根據(jù)牛支原體血清抗體水平和PCR檢測結(jié)果，統(tǒng)計牛支原體感染率。

1.2.2 分離與培養(yǎng) 對牛支原體血清抗體水平和PCR檢測陽性的病料組織，進行研磨、離心取上清過濾處理后接種于加入有酚紅的PPLO液體培養(yǎng)基中密封，37℃恒溫、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h～44 h，每日觀察2次～3次，待顏色變黃后過濾，傳代4次后，將其接種于改良Frey固體培養(yǎng)基上，肉眼觀察直到出現(xiàn)中央凸起呈荷包蛋樣的典型支原體菌落，姬姆薩染色觀察其形態(tài)。

1.2.3 分離菌株的生化試驗 參照細菌微量生化鑒定管說明書進行山梨醇發(fā)酵、葡萄糖發(fā)酵、色氨酸肉湯(蛋白胨水)、MR、VP、氧化酶試紙、西蒙氏檸檬酸鹽、鳥氨酸、精氨酸、氨基酸脫羧酶、纖維二糖、棉子糖、尿素等生化鑒定。

1.2.4 分離菌株的PCR鑒定 取中央凸起呈荷包蛋樣的典型支原體菌落的菌株進行擴大培養(yǎng)，按照DNA提取試劑盒說明提取菌株的基因組DNA，置-20℃保存。采用1.2.1牛支原體16S rRNA通用引物，用提取的菌株基因組DNA為模板進行PCR鑒定，挑去鑒定為陽性的菌株用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，送華大基因進行側(cè)序，并將測序結(jié)果與在NCBI網(wǎng)站下載的參考株基因序列用Blast軟件進行同源性比對。

1.2.5 藥敏試驗 參照美國臨床檢驗標準委員會(NCCLS)推薦的標準進行結(jié)果判斷，分析分離菌株的耐藥性，將分離菌株接種于PPLO液體培養(yǎng)基中，均勻涂布在PPLO固體培養(yǎng)上，每個培養(yǎng)基貼6種藥物，每種藥物3個重復(fù)，取平均值進行藥敏試驗判定。

2 結(jié)果

2.1 牛支原體感染檢測結(jié)果

采用ELISA和PCR對采集的樣品進行牛支原感染檢測。結(jié)果見表1，共檢出陽性樣品431份(ELISA和PCR均為陽性)，總陽性率為33.3%。其中2019年、2020年、2021年密云地區(qū)的牛養(yǎng)殖場牛支原體感染率分別為28.7%、32.8%和38.1%，呈現(xiàn)逐年上升趨勢。

表1 牛支原體檢測結(jié)果Table 1 Test results of Mycoplasma bovis

2.2 分離培養(yǎng)結(jié)果

從牛支原體血清抗體水平和PCR檢測陽性的病料組織進行牛支原體分離鑒定，疑似牛支原體菌株在改良Frey固體培養(yǎng)基上厭氧條件下培養(yǎng)3 d時，長出透明、圓形、光滑似露珠狀菌落，呈現(xiàn)典型的“煎蛋樣”菌落(圖1)，姬姆薩染色后顯微鏡觀察可見卵圓形、彎曲的絲狀、螺旋狀等多種形態(tài)的菌體(圖2)

圖1 菌株的“煎蛋樣”菌落Fig.1 "Fried egg like" colonies of the strain

圖2 顯微鏡的菌株形態(tài)學(xué) (1000×)Fig.2 Microscopic morphology of the strain (1000×)

2.3 分離菌株的生化試驗

疑似支原體菌株均不能發(fā)酵葡萄糖、不分解甘露醇、不能水解精氨酸、不分解尿素，磷酸酶活性為陽性。與《伯杰細菌鑒定手冊》中牛支原生化特性一致。經(jīng)過統(tǒng)計，從431份陽性樣品中分離得到103株菌株，初步鑒定為牛支原體。

2.4 分離菌株的PCR鑒定

對初步鑒定為支原體的分離菌株，用16S rRNA通用引物進行PCR鑒定。結(jié)果顯示，以分離菌株基因組DNA為模板，均能擴增到約為253 bp的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖3)。擴增產(chǎn)物測序后與NCBI中報道的牛支原體16S rRNA序列同源性為98.0%以上，測序比對結(jié)果表明分離株均為牛支原體。

2.5 藥敏試驗檢測結(jié)果

用K-B藥敏紙片法對分離的103株牛支原體進行藥敏試驗，分析其耐藥性。由表2所示結(jié)果可知，分離的103株牛支原體對土霉素、金霉素、多西環(huán)素、卡那霉素、泰樂菌素、替米考星、泰妙菌素、氟苯尼考等10種抗生素耐藥率較高，耐藥率為41.7%～100.0%，對林可霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、沙拉拉星、阿奇霉素6種抗生素耐藥相對較低，耐藥率為15.5%～31.1%。

表2 103株牛支原體耐藥性結(jié)果分析Table 2 Analysis of drug resistance test results of 103 strains of Mycoplasma bovis

由表3可知，分離的103株牛支原體呈現(xiàn)多重耐藥性，耐14、6、5種藥物的各有6株、耐13、7種藥物的各8株、耐12、8種藥物的各10株、耐4種藥物的有5株、耐11、10、9種藥物的分離菌株最多，分別占分離菌株的19.4%、22.3%和24.3%。

M.DL 2 000 標準；1.空白對照；2～16.分離菌株 M.DL 2 000 Marker;1.Blank control;2-6.Isolates圖3 牛支原體PCR鑒定結(jié)果Fig.3 PCR results of Mycoplasma bovis

表3 多重耐藥性檢測結(jié)果Table 3 Detection results of multidrug resistance test

3 討論

牛支原體入侵宿主的細胞后定植在健康牛的上呼吸道，可以利用自身的菌毛、表面可變脂蛋白、生物膜等多種方式侵入牛的免疫系統(tǒng)，引起免疫反應(yīng)，并刺激感染體產(chǎn)生以 IgG1 為主的抗體類型，導(dǎo)致嚴重的肺部炎癥，引起一系列的病變反應(yīng)，病死率較高[14-16]。研究表明，牛支原體可在宿主牛體內(nèi)長期存在，可造成慢性持續(xù)感染[17-18]。本研究表明，2019年-2021年密云地區(qū)的肉牛養(yǎng)殖場牛支原體感染的陽性率分別為28.7%、32.8%和38.1%，且呈現(xiàn)逐年上升趨勢,與李書光等[17]、郭亞男等[19]報道牛支原體在肉牛、奶牛養(yǎng)殖場廣泛流行一致。

臨床預(yù)防支原體病的疫苗效果不是很理想，對該病的控制主要是抗體檢測、凈化、抗生素治療等，由于不合理的使用，導(dǎo)致支原體耐藥菌株出現(xiàn)[20]。臨床上，支原體經(jīng)常與呼吸道病毒或者巴氏桿菌混合感染，給該病的診斷與防治帶了一定的困難。當發(fā)生支原體感染時應(yīng)該進行藥敏試驗，選擇敏感藥物合理使用，提高治療效果，同時配合消毒。本試驗表明，103株牛支原體菌株對臨床常用的14種藥物均產(chǎn)生了很強的耐藥性，且呈現(xiàn)多重耐藥，應(yīng)該引起重視。因此，在臨床中應(yīng)該推薦選用林可霉素類、喹諾酮類藥物進行治療。本研究對密云地區(qū)規(guī)?；鲋гw病的治療有一定指導(dǎo)意義，在臨床治療過程中應(yīng)該合理的交替使用藥物，并采取綜合性防控措施如消毒、檢測凈化等。