鄭艷玲，鄭月茂，姜八一，王勇勝，張 涌*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院,山東濰坊 261061)

產(chǎn)肉量是肉畜的主要經(jīng)濟(jì)性狀，它一向是畜牧業(yè)育種和飼養(yǎng)管理的主要目標(biāo)之一。1997年，美國(guó)John Hopkins大學(xué)的McPherron等[1]研究發(fā)現(xiàn)肌肉生成抑制素(myostatin，MSTN)是骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子，其活性的喪失，會(huì)引起動(dòng)物肌肉的過(guò)度發(fā)育，肌纖維直徑變大或肌纖維數(shù)增加，表現(xiàn)為動(dòng)物的“雙肌”性狀。在自然界中存在MSTN基因突變導(dǎo)致的比利時(shí)藍(lán)牛、皮特蒙特牛及特克賽爾綿羊的雙肌表型。對(duì)牛的研究表明，雙肌性狀可以使牛在相同的飼喂條件下肌肉產(chǎn)量增加20%～30%，雙肌牛的肉骨比比普通牛高30%，雙肌肉有較好的肉質(zhì)，且脂肪率低，口感良好。因此，通過(guò)對(duì)MSTN基因的突變、缺失、敲除及基因沉默等遺傳修飾，獲得轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物，可以達(dá)到提高家畜肌肉重量的目的，生產(chǎn)具有商業(yè)化價(jià)值的優(yōu)良品種家畜。本研究根據(jù)牛的MSTN基因序列設(shè)計(jì)并合成4對(duì)針對(duì)MSTNCDS區(qū)的miRNA寡聚單鏈DNA序列，將其連入miRNA表達(dá)載體中，構(gòu)建得到了能夠有效對(duì)MSTNmRNA合成和蛋白表達(dá)進(jìn)行干擾的載體，為后續(xù)通過(guò)miRNA干擾敲減肉牛MSTN基因的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、菌株和細(xì)胞 BLOCK-iTTMPol Ⅱ miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP (K4936-00)載體構(gòu)建試劑盒，Invitrogen生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DH5α菌株為實(shí)驗(yàn)室保存；秦川肉牛胎兒骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室保存細(xì)胞。

1.1.2 主要試劑SalⅠ、1 kb DNA Ladder，MBI公司產(chǎn)品；Trizol，Invitrogen公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒與SYBR?Premix ExTaqTMⅡ (Perfect Real Time)，大連寶生物公司產(chǎn)品；胎牛血清，GIBCO公司產(chǎn)品；Ham’s F-10液體培養(yǎng)基，Sigma公司產(chǎn)品；一抗MSTN多克隆抗體，Millopore公司產(chǎn)品；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Fugene HD，Roche公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 凝膠成像分析系統(tǒng)(GDS8000)，美國(guó)UVP公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀(7500)，美國(guó)ABI公司產(chǎn)品；熒光相差倒置顯微鏡(TE2000)，日本NIKON公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 miRNA寡聚單鏈DNA序列的合成 根據(jù)牛MSTN基因序列 (序列號(hào)AY160688)，應(yīng)用Invitrogen公司的在線設(shè)計(jì)軟件Invitrogen’s RNAi Designer設(shè)計(jì)4對(duì)miRNA寡聚單鏈DNA序列及1對(duì)無(wú)效序列(陰性對(duì)照)，交由上海英駿生物公司進(jìn)行合成，序列見(jiàn)表1。

表1 miRNA寡聚單鏈DNA序列(附陰性對(duì)照序列)Table 1 miRNA single-stranded oligo DNA sequences (with the negative control sequence)

1.2.2MSTN基因miRNA干擾載體的構(gòu)建 將4對(duì)靶向MSTN的寡聚單鏈DNA序列及1對(duì)陰性對(duì)照退火后形成雙鏈，然后用載體構(gòu)建試劑盒BLOCK-iTTMPol Ⅱ miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP進(jìn)行重組，將5對(duì)雙鏈的miRNA oligo分別插入到miRNA表達(dá)載體pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR中，從而構(gòu)建5個(gè)miRNA干擾載體，分別命名為miR-MSTN-1、miR-MSTN-2、miR-MSTN-3、miR-MSTN-4及miR-Neg，干擾載體的總長(zhǎng)度為5 763 bp。

1.2.3 有效干擾載體的篩選

1.2.3.1 肉牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的復(fù)蘇和培養(yǎng) 將凍存的原代秦川肉牛胎兒骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在37℃水浴中解凍，接種在60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用含15%胎牛血清的Ham’s F-10對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3.2 細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合時(shí)，將細(xì)胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化，按5×105細(xì)胞/皿將骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞接種于含15%FBS的Ham’s F-10培養(yǎng)液的6孔板上。當(dāng)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到50%～60%匯合時(shí)，用脂質(zhì)體FugeneHD將MSTN基因miRNA干擾載體miR-MSTN-1、miR-MSTN-2、miR-MSTN-3、miR-MSTN-4及陰性對(duì)照干擾載體miR-Neg轉(zhuǎn)染骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為空白對(duì)照。

1.2.3.3 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率 利用熒光顯微鏡觀察干擾載體轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞。選擇最大激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為507 nm。

1.2.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)MSTNmRNA的表達(dá) 用Trizol從1組未轉(zhuǎn)染組(空白對(duì)照組)細(xì)胞和5組轉(zhuǎn)染細(xì)胞(試驗(yàn)組)中分別提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分析各組MSTN基因相對(duì)表達(dá)水平，β-actin作為內(nèi)參基因，定量數(shù)據(jù)用2-△△Ct的方法分析。PCR引物序列見(jiàn)表2。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物信息Table 2 Primer information for real-time quantitative PCR

1.2.3.5 Western blot檢測(cè)MSTN蛋白表達(dá) 從未轉(zhuǎn)染組和試驗(yàn)組胎兒骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中提取全蛋白進(jìn)行MSTN蛋白表達(dá)的檢測(cè)，用MSTN多克隆抗體作為一抗，MSTN一抗稀釋倍數(shù)為1∶3 000；β-actin作為內(nèi)參蛋白。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 26軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較采用T檢驗(yàn)，P<0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表明差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 干擾載體構(gòu)建結(jié)果

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了4對(duì)針對(duì)MSTN基因CDS區(qū)4個(gè)不同區(qū)域的miRNA寡聚單鏈DNA序列及1對(duì)陰性對(duì)照序列，并構(gòu)建了miRNA干擾載體，分別命名為miR-MSTN-1、miR-MSTN-2、miR-MSTN-3、miR-MSTN-4和miR-MSTN-Neg。miR-MSTN-1、miR-MSTN-2、miR-MSTN-3、miR-MSTN-4和miR-MSTN-Neg經(jīng)載體上的單酶切位點(diǎn)SalⅠ酶切后均得到1條5 763 bp的條帶(圖1)，說(shuō)明載體構(gòu)建正確。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)；1.miR-Neg；2.miR-MSTN-1；3.miR-MSTN-2；4.miR-MSTN-3；5.miR-MSTN-4M.DNA Marker;1.miR-Neg;2.miR-MSTN-1;3.miR-MSTN-2;4.miR-MSTN-3;5.miR-MSTN-4圖1 miRNA干擾載體SalⅠ酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of miRNA expression vectors with SalⅠ

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果

用4個(gè)干擾載體與1個(gè)陰性對(duì)照載體轉(zhuǎn)染骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞24 h后，在熒光顯微鏡下觀察，干擾載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞發(fā)綠色熒光，48 h后80%以上的細(xì)胞中有EmGFP表達(dá)，而未轉(zhuǎn)染組沒(méi)有檢測(cè)到EmGFP的表達(dá)，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功(圖2)。

A、A0.未轉(zhuǎn)染組；B、B0.miR-Neg轉(zhuǎn)染組；C、C0.miR-MSTN-1轉(zhuǎn)染組；D、D0.miR-MSTN-2轉(zhuǎn)染組；E、E0.miR-MSTN-3轉(zhuǎn)染組；F、F0.miR-MSTN-4轉(zhuǎn)染組；A、B、C、D、E、F.光學(xué)顯微鏡下觀察；A0、B0、C0、D0、E0、F0.熒光顯微鏡下觀察A,A0.Untransfected group;B,B0.miR-Neg group.C,C0.miR-MSTN-1 group;D,D0.miR-MSTN-2 group;E,E0.miR-MSTN-3 group;F,F0.miR-MSTN-4 group;A,B,C,D,E,F.Cells observed under light microscope;A0,B0,C0,D0,E0,F0.Cells observed under fluorescent microscope.圖2 未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞觀察結(jié)果(×200，標(biāo)尺代表50 μm)Fig.2 The result of untransfected cells and transfected cells observed under the fluorescence microscope after 48 h post-transfection (×200,the scale bars indicate 50 μm)

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)MSTN mRNA的表達(dá)結(jié)果

在轉(zhuǎn)染肉牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞48 h 后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-MSTN-1、miR-MSTN-2、miR-MSTN-3、miR-MSTN-4 4個(gè)試驗(yàn)組均有效抑制了MSTN基因mRNA的表達(dá)。MSTNmiRNA干擾載體轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組相比MSTNmRNA的相對(duì)表達(dá)量為52.6%、47.4%、50.9%和26.3%，差異均極顯著(P<0.01)，而陰性對(duì)照組與未轉(zhuǎn)染組相比相對(duì)表達(dá)量為91.2%，差異不顯著(P>0.05)，通過(guò)計(jì)算得到4個(gè)miR-MSTN轉(zhuǎn)染組干擾效率分別為47.4%、52.6%、49.1%和73.7%(圖3)。

1.未轉(zhuǎn)染組；2.miR-Neg轉(zhuǎn)染組；3.miR-MSTN-1轉(zhuǎn)染組；4.miR-MSTN-2轉(zhuǎn)染組；5.miR-MSTN-3轉(zhuǎn)染組；6.miR-MSTN-4轉(zhuǎn)染組；a.P<0.011.Untransfected group;2.miR-Neg group;3.miR-MSTN-1 group;4.miR-MSTN-2 group;5.miR-MSTN-3 group;6.miR-MSTN-4 group;a.P<0.01圖3 miRNA干擾載體對(duì)MSTN表達(dá)的影響Fig.3 Effect of miRNA interference vectors on MSTN expression

2.4 Western blot檢測(cè)MSTN蛋白表達(dá)

Western blot進(jìn)一步檢測(cè)MSTN蛋白表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，4個(gè)MSTN干擾組MSTN蛋白水平與對(duì)照組相比明顯下降，其中miR-MSTN-4組與陰性對(duì)照組及未轉(zhuǎn)染組相比蛋白表達(dá)量均少于其他3個(gè)組(圖4)。

1.未轉(zhuǎn)染組；2.miR-Neg轉(zhuǎn)染組；3.miR-MSTN-1轉(zhuǎn)染組；4.miR-MSTN-2轉(zhuǎn)染組；5.miR-MSTN-3轉(zhuǎn)染組；6.miR-MSTN-4轉(zhuǎn)染組

3 討論

MSTN會(huì)抑制動(dòng)物的肌肉生長(zhǎng)和發(fā)育，當(dāng)MSTN基因在某些條件下缺失或突變時(shí)，會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物肌肉肥大，這對(duì)提高動(dòng)物肌肉產(chǎn)量是極其有益的，因此，不斷有科研人員開(kāi)展敲減動(dòng)物體內(nèi)MSTN基因的研究。在畜牧業(yè)上，已有很多研究利用基因敲除技術(shù)獲得了MSTN基因缺失的動(dòng)物[2-4]。

MSTN基因是動(dòng)物體內(nèi)正常表達(dá)的一個(gè)基因，它不僅僅在骨骼肌中表達(dá)，在很多動(dòng)物的心肌、乳腺組織等均有表達(dá)[5-6]。雙肌牛具有的繁殖力下降、難產(chǎn)率增加、成活率低及患有呼吸道疾病等缺點(diǎn)，可能都是由于MSTN基因的非骨骼肌特異性表達(dá)引起的，MSTN敲除或抑制以后影響了其在非骨骼肌組織器官參與的正常生理過(guò)程。利用組織特異性基因敲除或組織特異性RNA干擾的方法對(duì)MSTN基因進(jìn)行組織特異性基因沉默為動(dòng)物育種開(kāi)辟了一條新的途徑，具有很好的發(fā)展前景，目前還沒(méi)有見(jiàn)到利用組織特異性敲減MSTN的報(bào)道。

pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR載體中CMV 啟動(dòng)子可由高效的RNA聚合酶Ⅲ或具有聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子啟動(dòng)的單順?lè)醋由踔炼囗樂(lè)醋愚D(zhuǎn)錄，這可允許組織特異性表達(dá)系統(tǒng)和條件性表達(dá)系統(tǒng)的使用[7]，從而能夠達(dá)到組織特異性干擾的目的。其中還含有形成miRNA前體物必需的5＇和3＇miR 側(cè)翼區(qū)，借鑒了miRNA的左右翼序列，相對(duì)于普通的shRNA，更易形成成熟的干擾RNA，表達(dá)水平更高，干擾效率也更強(qiáng)[8]，因此，本試驗(yàn)選用pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR用于干擾載體的構(gòu)建。構(gòu)建的載體中含有報(bào)告基因EmGFP進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，這有利于追蹤轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，可對(duì)其轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行觀察。

本試驗(yàn)針對(duì)MSTN基因的外顯子區(qū)設(shè)計(jì)的4對(duì)miRNA寡聚單鏈DNA序列，通過(guò)試驗(yàn)證明其對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞MSTNmRNA及蛋白的表達(dá)都有一定的沉默作用，而包含第4對(duì)片段miR-MSTN-4干擾效果最好，對(duì)MSTNmRNA表達(dá)的干擾效率達(dá)到70%以上，這可能與第4對(duì)片段是針對(duì)MSTN基因編碼活性區(qū)保守性最高的第3外顯子設(shè)計(jì)有關(guān)。本研究為后續(xù)利用miRNA干擾MSTN轉(zhuǎn)基因肉牛的研究奠定了基礎(chǔ)。