徐春艷，張寬寬，王正榮，黃忠武，井 波，張艷艷，余復(fù)昌，齊 萌*

(1.塔里木大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木動物疫病診斷與防控工程實(shí)驗室，新疆阿拉爾 843300；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆石河子 832000；3.庫車市獸醫(yī)站，新疆庫車 842000)

十二指腸賈第蟲(Giardiaduodenalis)和隱孢子蟲(Cryptosporidium)是引起人和動物腹瀉的常見原蟲，主要通過食源性和水源性傳播[1-2]?；诜肿由飳W(xué)鑒定方法，十二指腸賈第蟲劃分為8個集聚體(Assemblage A-H)，其中，集聚體A和集聚體B具有人獸共患性，反芻動物主要感染集聚體E[3]。牛常見感染的隱孢子蟲有微小隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum)、牛隱孢子蟲(C.bovis)、安氏隱孢子蟲(C.andersoni)和芮氏隱孢子蟲(C.ryanae)，不同種類的感染情況與牛的年齡存在相關(guān)性[4]。在我國，牛十二指腸賈第蟲感染率在0.1%～74.2%，總體上奶牛的十二指腸賈第蟲感染率高于肉牛[1]。近年來，在寧夏回族自治區(qū)和江蘇省等地牛場犢牛因暴發(fā)隱孢子蟲病而造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。本調(diào)查旨在了解和掌握庫車市規(guī)模化場牛十二指腸賈第蟲和隱孢子蟲的感染情況和種類分布，為新疆地區(qū)牛腸道寄生原蟲病的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 牛糞便樣本采集 在新疆庫車市1個存欄量為246頭的奶牛場和1個存欄量為408頭的肉牛場，隨機(jī)選取奶牛37頭、肉牛61頭。其中，犢牛(<6月齡)、育成牛(7～12月齡)和成年牛(>12月齡牛)分別為14頭、23頭和61頭。待牛排出糞便后，立即使用一次性乳膠手套收集糞便樣本，單獨(dú)裝入潔凈采樣袋中，每份10 g～30 g，記錄信息，帶回實(shí)驗室，置4℃冰箱中保存，1周內(nèi)提取DNA。

1.1.2 主要試劑 糞便全基因組DNA提取試劑盒，美國OMEGA Bio-Tek公司產(chǎn)品；2×EasyTaqPCR SuperMix (+dye)、DNA Marker DL 2 000，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；rTaq酶、限制性內(nèi)切酶SspⅠ和MboⅡ，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 Sorvall Legend Micro 17型微量離心機(jī)，Thermo Scientific公司產(chǎn)品；MC proS型梯度PCR儀，Eppendorf公司產(chǎn)品；DYY-7C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、JY系列電泳槽，均為北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；Gel Doc XR+型凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 提取糞便樣本DNA 每份糞便樣本挑取約200 mg，按試劑盒操作步驟提取全基因組DNA，置-20℃冰箱中保存待測。

1.2.2 引物設(shè)計和PCR擴(kuò)增 參考張盈等[6]報道設(shè)計擴(kuò)增十二指腸賈第蟲和隱孢子蟲的小亞基核糖體RNA(SSUrRNA)基因的引物；參考Alves等[7]設(shè)計擴(kuò)增微小隱孢子蟲表面糖蛋白gp60(cell surface glycoproteins gp60)基因的引物，由蘇州金維智生物科技有限公司合成。引物序列、目的片段和退火溫度見表1。隱孢子蟲SSUrRNA基因和gp60基因擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系為25 μL：模板DNA 1 μL，2×EasyTaqPCR SuperMix(+dye)12.5 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各0.3 μL，雙蒸水10.9 μL。十二指腸賈第蟲的PCR反應(yīng)體系為25 μL：模板DNA1 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL，rTaq酶0.15 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各0.3 μL，二甲基亞砜(DMSO)1.25 μL，雙蒸水17.5 μL。每次PCR擴(kuò)增均設(shè)陽性對照和陰性對照，陽性DNA對照樣本為雞源貝氏隱孢子蟲和馬源十二指腸賈第蟲集聚體B，由塔里木大學(xué)獸醫(yī)寄生蟲學(xué)實(shí)驗室鑒定保存，陰性對照為雙蒸水。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物于10 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳檢查結(jié)果。

表1 用于十二指腸賈第蟲和隱孢子蟲鑒定的引物序列、目的片段、退火溫度Table 1 Primer sequences,fragment lengths and annealing temperatures used in the detections of G.duodenalis and Cryptosporidium spp.

1.2.3 隱孢子蟲限制性片段長度多態(tài)性鑒定 基于SSUrRNA基因序列擴(kuò)增呈隱孢子蟲陽性的樣本，分別取其8 μL PCR產(chǎn)物，加入14 μL雙蒸水和2 μL酶切緩沖液，分別加入1 μLSspⅠ酶或MboⅡ酶，于37℃水浴孵育4 h，取8 μL酶切產(chǎn)物于10 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳檢查結(jié)果，參照文獻(xiàn)[8]對隱孢子蟲進(jìn)行限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)鑒定。

1.2.4 序列對比和集聚體/基因亞型鑒定 將PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物送至蘇州金唯智科技有限公司進(jìn)行雙向測序。在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast搜索，下載參考序列，使用Clustalx 2.1軟件比對和校準(zhǔn)序列，根據(jù)序列分析結(jié)果鑒定隱孢子蟲種類/基因亞型、十二指腸賈第蟲集聚體。

2 結(jié)果

2.1 牛十二指腸賈第蟲和隱孢子蟲感染情況

對98份樣本進(jìn)行PCR檢測，其中33份樣本呈十二指腸賈第蟲和隱孢子蟲陽性，總感染率為33.7%(33/98)；其中十二指腸賈第蟲陽性樣本31份，感染率為31.6%(31/98)，隱孢子蟲陽性樣本10份，感染率為10.2%(10/98)；十二指腸賈第蟲和隱孢子蟲混合感染陽性樣本8份，混合感染率為8.2%(8/98)。

奶牛的十二指腸賈第蟲和隱孢子蟲總感染率為56.8%(21/37)，其中有8份為十二指腸賈第蟲和安氏隱孢子蟲混合感染；其十二指腸賈第蟲和隱孢子蟲陽性樣本數(shù)分別為19份和10份，感染率分別為51.4%(19/37)和27.0%(10/37)。肉牛的十二指腸賈第蟲和隱孢子蟲總感染率為19.7%(12/61)，均為十二指腸賈第蟲感染，未發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲感染。

2.2 不同年齡段牛十二指腸賈第蟲和隱孢子蟲感染情況

以<6月齡牛十二指腸賈第蟲和隱孢子蟲感染率較高，為85.7%(12/14)，7～12月齡和>12月齡牛的感染率分別為21.7%(5/23)和26.2%(16/61)。<6月齡牛隱孢子蟲感染率為57.1%(8/14)，高于>12月齡牛的感染率(3.3%，2/61)，7～12月齡牛未發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲感染。<6月齡牛十二指腸賈第蟲感染率為71.4%(10/14)，高于>12月齡牛的感染率(24.5%，15/61)和7～12月齡牛的感染率(21.7%，5/23)。

2.3 牛十二指腸賈第蟲和隱孢子蟲種類/基因型分布情況

將31份呈十二指腸賈第蟲陽性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序，均成功獲得序列，經(jīng)比對分析，30條序列與我國山東牛源集聚體E(MN593002)相似性為100%，鑒定為集聚體E；1條序列與我國新疆馬源集聚體B(MN174122)相似性為100%，鑒定為集聚體B。將10份呈隱孢子蟲陽性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定出8份為安氏隱孢子蟲，1份為微小隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲混合感染，1份為牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲混合感染。進(jìn)一步基于gp60位點(diǎn)擴(kuò)增微小隱孢子蟲陽性樣本進(jìn)行亞型鑒定，測序成功獲得雙向序列，經(jīng)比對分析，該序列與我國上海山羊源微小隱孢子蟲IIdA19G1亞型(KM199738)相似性為100%，鑒定為IIdA19G1亞型。

3 討論

本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，庫車市規(guī)模化場牛十二指腸賈第蟲感染率為31.6%(31/98)，各年齡段均有感染，以集聚體E為主要感染集聚體，同時發(fā)現(xiàn)感染集聚體B。全球范圍內(nèi)，牛常見感染十二指腸賈第蟲集聚體A、B和E，其中E在大多數(shù)國家和地區(qū)牛感染的優(yōu)勢集聚體[9]。陳功義等[10]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，中牟地區(qū)規(guī)模化場奶牛十二指腸賈第蟲感染率為6.7%(29/422)，其感染率呈現(xiàn)隨年齡增長而降低的趨勢。研究發(fā)現(xiàn)，同一地區(qū)奶牛十二指腸賈第蟲陽性率存在差異，如在廣東省開展的2項調(diào)查研究中，規(guī)?；瘓瞿膛Ｊ改c賈第蟲的感染率分別為74.2%(288/388)和2.2%(31/1440)；在四川省開展的2項調(diào)查研究中，規(guī)模化場奶牛十二指腸賈第蟲的感染率分別為41.2%(126/306)和9.4%(26/278)[1]。本次調(diào)查顯示，奶牛和肉牛十二指腸賈第蟲感染率分別為51.4%(19/37)和19.7%(12/61)，感染率存在差異與其飼養(yǎng)模式和年齡分布有一定關(guān)系，奶牛場為自繁自育，而肉牛場多是購進(jìn)育肥牛；幼齡牛十二指腸賈第蟲感染率高于育肥牛和成年牛，與文獻(xiàn)報道一致，呈現(xiàn)隨年齡增長而降低的趨勢。

研究顯示，牛的隱孢子蟲感染率和感染種類/基因型與年齡、季節(jié)、飼養(yǎng)管理、地理條件、生物安全防控以及樣本采集的時間和方法等諸多因素有關(guān)[11]。鄭雙健等[12]調(diào)查發(fā)現(xiàn)鄭州地區(qū)規(guī)?；瘓瞿膛ｋ[孢子蟲總感染率為2.8%(27/973)，以斷奶前犢牛感染率較高，為7.1%(12/169)。王臣榮等[13]調(diào)查發(fā)現(xiàn)某規(guī)?；N場進(jìn)口奶牛隱孢子蟲總感染率為17.8%(90/507)，以斷奶前犢牛感染率較高，為38.8%(64/165)，隱孢子蟲感染率隨年齡增長呈下降趨勢。林潔等[14]報道渝西地區(qū)奶牛源隱孢子蟲PCR陽性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SspⅠ和MboⅡ酶切后進(jìn)行RFLP分析，鑒定出安氏隱孢子蟲、牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲，以安氏隱孢子蟲為優(yōu)勢蟲種。Tao等[15]報道我國北方四省的奶牛感染微小隱孢子蟲、芮氏隱孢子蟲、牛隱孢子蟲和安氏隱孢子蟲4種隱孢子蟲，其中微小隱孢子蟲僅感染斷奶前犢牛。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，庫車市規(guī)模化場牛的隱孢子蟲感染率為10.2%(10/98)，以<6月齡牛隱孢子蟲感染率較高，為57.1%(8/14)，以安氏隱孢子蟲為主要感染種類，微小隱孢子蟲感染幼齡牛，與上述報道結(jié)果相一致。

牛感染十二指腸賈第蟲和隱孢子蟲后，一方面可導(dǎo)致牛腹瀉和營養(yǎng)不良等癥狀，影響?zhàn)B牛業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益；另一方面存在一定的人獸共患風(fēng)險，具有公共衛(wèi)生意義。隨著養(yǎng)牛業(yè)逐漸向集約化規(guī)?；l(fā)展，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)牛十二指腸賈第蟲和隱孢子蟲的檢測與防治工作。