鄧瑩瑩，焦迎春，蔣濤

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016）

柴達(dá)木大肥菇[Agaricus bitorquis（Quél.）Sacc.]不僅富含脂肪、氨基酸、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、膳食纖維等營(yíng)養(yǎng)成分[1]，而且含有酚酸、三萜及多糖等活性物質(zhì)[2]，具有極高的開發(fā)價(jià)值。酚酸類化合物是指苯環(huán)上的氫原子被酚性羥基取代的一類化合物[3]，存在多種形式，主要以化學(xué)鍵與其他物質(zhì)相結(jié)合，極少為游離態(tài)。酚酸作為一種重要的天然酚類化合物，不僅是人類從自然界直接攝入的重要酚類物質(zhì)，還是多酚重要的體內(nèi)代謝物，具有抗炎、抗病毒、抗癌、抗氧化[4]等生物活性，可抑制肥胖、提高免疫力、改善情緒等。目前對(duì)于柴達(dá)木大肥菇研究多集中于柴達(dá)木大肥菇的生物學(xué)特性和馴化[5]菌絲體、子實(shí)體的成分分析[1]及多糖酚酸提取工藝優(yōu)化[4，6]，對(duì)其酚酸類活性成分缺乏較深入的研究[2]。

生物機(jī)體內(nèi)的氧自由基經(jīng)過(guò)不飽和脂肪酸的過(guò)氧化可引起細(xì)胞受到損傷，進(jìn)而引起細(xì)胞新陳代謝和生理反應(yīng)無(wú)法正常進(jìn)行，使機(jī)體加速衰老。若機(jī)體內(nèi)氧化和抗氧化反應(yīng)失衡則容易引起氧化應(yīng)激現(xiàn)象，這是一種負(fù)面效應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)加快機(jī)體衰老和各種疾病的產(chǎn)生，人體內(nèi)的自由基多數(shù)為活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），包括含氧自由基、超氧陰離子自由基和過(guò)氧化物?；钚匝醯纳砂殡S生物的正常代謝過(guò)程，但過(guò)量的活性氧會(huì)對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷，危害人體健康[7]，因此，開發(fā)出具有低副作用天然無(wú)毒的抗氧化劑十分重要?？寡趸钚允欠铀嶙畛Ｒ娚锘钚灾?，酚酸以清除ROS為基礎(chǔ)實(shí)現(xiàn)抗氧化活性[8]，決定抗氧化活性的主要因素是酚羥基數(shù)目及其在化學(xué)結(jié)構(gòu)中的位置。柴達(dá)木大肥菇在發(fā)酵過(guò)程中，可以分泌出大量酚酸，存在于發(fā)酵液和菌絲體中，分別對(duì)其提取即得胞外酚酸和胞內(nèi)酚酸。陳雅楠等[4]研究發(fā)現(xiàn)柴達(dá)木大肥菇胞內(nèi)酚酸具有較強(qiáng)的抗氧化活性。Leonard等[9]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵通常會(huì)增加酚酸含量及其抗氧化活性；孟歌等[10]發(fā)現(xiàn)藥食用真菌靈芝的自身生長(zhǎng)情況、次級(jí)代謝產(chǎn)物分泌及還原能力等因素直接影響其抗氧化能力，表明大型食用真菌在液態(tài)發(fā)酵過(guò)程會(huì)提高其分泌出酚酸的含量，影響其抗氧化能力。因此，柴達(dá)木大肥菇做為食用真菌發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的酚酸也應(yīng)具有類似的抗氧化活性。

綜上所述，以柴達(dá)木大肥菇為研究對(duì)象，采用液體發(fā)酵的方法，測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中的生物量、酚酸含量和酚酸的5種抗氧化指標(biāo)，探究柴達(dá)木大肥菇在發(fā)酵過(guò)程中的抗氧化活性變化以及胞內(nèi)、胞外酚酸抗氧化活性的差異，為柴達(dá)木大肥菇酚酸中抗氧化功能因子的開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柴達(dá)木大肥菇菌種：青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院食品工程實(shí)驗(yàn)室提供；三氯化鐵、鐵氰化鉀、麥芽糖、果糖、蛋白胨、硫酸鎂、氯化鈣、無(wú)水乙醇、戊二醛（均為分析純）：湖北永闊科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

鼓風(fēng)干燥箱（ZXRD-B5110）：上海智城分析儀器制造有限公司；數(shù)控超聲波清洗儀（KQ5200DE）：昆山市超聲儀器有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（UV-1780）：日本島津儀器有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī)（H/T16MM）：湖南赫西儀器裝備有限公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（BS-1EA）：常州國(guó)華電器有限公司；掃描電鏡（EVO 18）：北京歐波同光學(xué)技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 液體種子培養(yǎng)

無(wú)菌條件下，從斜面培養(yǎng)基中取出黃豆大小的菌塊，接入250 mL的三角瓶中，于25℃、100 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到出現(xiàn)細(xì)小均勻的菌絲球且菌液澄清透明為最佳[11]。

1.3.2 液體發(fā)酵培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下，以體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接入250 mL錐形瓶中，置于25℃、100 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[11]。

1.3.3 柴達(dá)木大肥菇除糖工藝

菌絲體除糖：菌絲體與蒸餾水以1∶20（g/mL）放入燒杯，70℃、45 Hz超聲20 min后提取抽濾。

發(fā)酵液除糖：發(fā)酵液和無(wú)水乙醇以體積比1∶4放入燒杯，40℃、45 Hz超聲30 min后提取多糖，將上清液濃縮至原體積，即為胞外酚酸[4]。

1.3.4 柴達(dá)木大肥菇胞內(nèi)酚酸的提取

將除糖后的菌絲體與90%乙醇以1∶20（g/mL）料液比放入燒杯，60℃、45 Hz超聲30 min后提取抽濾，濾液即為胞內(nèi)酚酸。

1.3.5 菌絲體生物量的測(cè)定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[12]測(cè)定菌絲體干重（g）。菌絲體生物量計(jì)算公式如下。

式中：M為菌絲體干重，g；V為發(fā)酵液總體積，mL。

1.3.6 菌絲體掃描電鏡觀察

將培養(yǎng)1 d～6 d的柴達(dá)木大肥菇菌絲體于2.5%戊二醛溶液中避光固定12 h。用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗2次，然后分別用30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液脫水2次[13]。

1.3.7 酚酸含量測(cè)定

制備沒食子酸對(duì)照品溶液，分別取 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL沒食子酸對(duì)照品溶液置于25.0 mL的容量瓶中，加入1.0 mL的無(wú)水乙醇、0.3% C12H25SO4Na溶液、0.6% FeCl3溶液和 0.9 mL 0.9% K3[Fe（CN）6]溶液，并用0.1 mol/L鹽酸溶液定容，靜置20 min，測(cè)定720 nm處的吸光度[4]，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=1.267 8x-0.021 5，R2=0.996 4；確定酚酸的稀釋倍數(shù)，根據(jù)上述方法測(cè)得相應(yīng)的吸光度后計(jì)算相應(yīng)的胞內(nèi)、胞外酚酸濃度。

1.3.8 抗氧化指標(biāo)測(cè)定

1.3.8.1 超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[14]的方法測(cè)定超氧陰離子自由基清除能力。清除率計(jì)算公式如下。

式中：△A空白為用無(wú)水乙醇代替樣品的反應(yīng)體系的吸光度；△A樣品為添加樣品的反應(yīng)體系的吸光度；△A對(duì)照為以超純水代替鄰苯三酚的反應(yīng)體系的吸光度。

1.3.8.2 鐵離子還原能力的測(cè)定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[15]的方法測(cè)定鐵離子還原能力。

1.3.8.3 羥自由基清除能力測(cè)定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[10]的方法測(cè)定羥自由基清除能力。清除率計(jì)算公式如下。

式中：△A空白為無(wú)水乙醇代替樣品的反應(yīng)體系的吸光度；△A樣品為添加樣品的反應(yīng)體系的吸光度；△A對(duì)照為以蒸餾水替代H2O2的反應(yīng)體系的吸光度。

1.3.8.4 2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽陽(yáng)離子 [2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）cation，ABTS+]自由基清除能力測(cè)定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[10]的方法測(cè)定ABTS+自由基清除能力。清除率計(jì)算公式如下。

式中：△A樣品為添加樣品后溶液的吸光度；△A空白為未添加樣品后溶液的吸光度。

1.3.8.5 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力測(cè)定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[16]的方法測(cè)定DPPH自由基清除能力。清除率計(jì)算公式如下。

式中：△A空白為無(wú)水乙醇替代樣品的反應(yīng)體系的吸光度；△A樣品為添加樣品后溶液的吸光度；△A對(duì)照為無(wú)水乙醇替代DPPH的反應(yīng)體系的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)用IBM SPSS Statistics 20分析顯著性，用Origin 2018做圖，顯著水平設(shè)定為P=0.05，差異極顯著水平設(shè)為P=0.01，相同小寫字母表示差異不顯著（P＞0.05），不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 柴達(dá)木大肥菇發(fā)酵過(guò)程中菌絲體生物量變化

發(fā)酵過(guò)程中菌絲體生物量的變化見圖1。發(fā)酵過(guò)程中菌絲細(xì)胞的形態(tài)變化見圖2。

圖1 發(fā)酵過(guò)程中菌絲體生物量的變化Fig.1 Variation curve of hyphae biomass

圖2 發(fā)酵過(guò)程中菌絲細(xì)胞的形態(tài)變化（掃描電鏡8 000×）Fig.2 Morphological changes of mycelium cells during fermentation（SEM 8 000×）

由圖1可知，在培養(yǎng)的6 d內(nèi)，菌絲體生物量呈先上升后下降的趨勢(shì)，并在第5天達(dá)到峰值（22.91±0.21）g/L，較第1天提升了25.08倍。由圖2可知，在發(fā)酵過(guò)程中，柴達(dá)木大肥菇菌絲球直徑隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。與雞腿菇菌絲體生物量的試驗(yàn)結(jié)果趨勢(shì)[17]類似，但由于真菌種類的差異，生物量達(dá)到峰值的時(shí)間不一致，隨著發(fā)酵進(jìn)程延續(xù)發(fā)酵液體系中溶解氧含量持續(xù)降低，菌體爭(zhēng)奪養(yǎng)分、生長(zhǎng)空間受限，菌體產(chǎn)量開始下降。

由圖2可知，柴達(dá)木大肥菇在液體發(fā)酵過(guò)程中主要以圓球形態(tài)存在。在發(fā)酵初期，菌球較小，邊緣為絨毛狀，發(fā)酵液澄清透明，呈淡黃色，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，菌球逐漸變大，菌絲逐漸變粗，并出現(xiàn)分支，發(fā)酵液逐漸渾濁、黏稠，6 d時(shí)，菌絲體老化，菌絲變細(xì)?？赡苁怯捎诎l(fā)酵后期時(shí)發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，菌絲開始自溶。

2.2 柴達(dá)木大肥菇酚酸含量變化

胞內(nèi)、胞外酚酸含量變化見圖3。

圖3 胞內(nèi)、胞外酚酸含量變化Fig.3 Changes of intracellular and extracellular phenolic acid content

由圖3可知，胞外酚酸含量始終高于胞內(nèi)酚酸。在發(fā)酵過(guò)程中，胞內(nèi)、胞外酚酸含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后平緩的趨勢(shì)，并于第7天達(dá)到峰值，分別（6.73±0.05）、（10.11±0.05）g/L，較發(fā)酵第1天分別提高了 17.91倍、4.56倍，差異顯著（P＜0.05）。發(fā)酵前期菌絲體需一定的時(shí)間適應(yīng)新的液體環(huán)境，故產(chǎn)生的酚酸較少。進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，菌絲體顯著增長(zhǎng)，酚酸含量開始增多，一直持續(xù)到穩(wěn)定期，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限，從而導(dǎo)致酚酸含量增加速度變緩，最終趨于平穩(wěn)。綜上所述，選擇發(fā)酵時(shí)間6 d作為一個(gè)發(fā)酵周期，完成對(duì)柴達(dá)木大肥菇發(fā)酵。

2.3 柴達(dá)木大肥菇發(fā)酵過(guò)程中胞內(nèi)、外酚酸抗氧化活性變化

2.3.1 發(fā)酵過(guò)程中超氧陰離子自由基清除率變化

超氧陰離子自由基清除率變化見圖4。

圖4 發(fā)酵過(guò)程中胞內(nèi)、胞外超氧陰離子自由基清除能力變化Fig.4 Changes of intracellular and extracellular superoxide anion scavenging ability during fermentation

超氧陰離子自由基（·O2-）是基態(tài)氧接受一個(gè)電子后形成的第一個(gè)氧自由基，可以轉(zhuǎn)化為其他自由基如單線態(tài)氧、H2O2和羥自由基，其氧化能力很強(qiáng)，對(duì)組織產(chǎn)生氧化損傷而引發(fā)各種疾病[18]。因此，常用樣品對(duì)超氧陰離子自由基清除能力來(lái)反映其抗氧化活性。由圖4可知，1 d～3 d時(shí)胞內(nèi)酚酸超氧陰離子自由基清除能力強(qiáng)于胞外酚酸，4 d～6 d時(shí)胞外酚酸超氧陰離子自由基清除能力強(qiáng)于胞內(nèi)酚酸。在發(fā)酵過(guò)程中，胞內(nèi)、胞外酚酸超氧陰離子自由基清除率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后下降最后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，并于第3天達(dá)到最大值，分別為 63.90%、23.95%，差異極顯著（P＜0.01），較發(fā)酵第1天分別提高了1.82倍、13.09倍。與桑黃液體培養(yǎng)中超氧陰離子自由基清除能力趨勢(shì)類似[19]。

2.3.2 發(fā)酵過(guò)程中鐵離子還原能力變化

發(fā)酵過(guò)程中胞內(nèi)、胞外酚酸鐵離子還原能力變化見圖5。

圖5 發(fā)酵過(guò)程中胞內(nèi)、胞外酚酸鐵離子還原能力變化Fig.5 Changes of intracellular and extracellular phenolic acid iron ion reduction ability during fermentation

鐵離子還原能力的測(cè)定，實(shí)質(zhì)上是檢驗(yàn)樣品電子供應(yīng)能力的過(guò)程。鐵離子還原能力可以參與多種抗氧化反應(yīng)，可以破壞自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和過(guò)氧化物的降解，鐵離子還原能力可用來(lái)評(píng)價(jià)樣品總的抗氧化活性，且鐵離子還原能力越強(qiáng)，酚酸抗氧化能力就越強(qiáng)[20]。由圖5可知，胞內(nèi)酚酸鐵離子還原能力始終強(qiáng)于胞外酚酸，并在第4天達(dá)到最大差值，為3.93%，在第4天達(dá)到峰值，差異極顯著（P＜0.01）。在發(fā)酵過(guò)程中，胞內(nèi)、胞外酚酸鐵離子還原能力變化穩(wěn)定，分別為7.08%、3.49%。與樺褐孔菌液體發(fā)酵培養(yǎng)的1 d～6 d胞內(nèi)外多酚鐵離子還原能力變化趨勢(shì)一致[21]。

2.3.3 發(fā)酵過(guò)程中羥自由基清除率變化

發(fā)酵過(guò)程中胞內(nèi)、外酚酸羥自由基清除能力變化見圖6。

圖6 發(fā)酵過(guò)程中胞內(nèi)、胞外酚酸羥自由基清除能力變化Fig.6 Changes of intracellular and extracellular scavenging ability of phenolic acid hydroxyl radical during fermentation

羥自由基是一種活性氧，可以破壞細(xì)胞膜與蛋白質(zhì)等生物分子發(fā)生反應(yīng)，造成組織破壞和細(xì)胞死亡，這也是引起衰老和其他疾病的重要因素[22]。因此，可用羥自由基的清除能力評(píng)價(jià)樣品的抗氧化能力。由圖6可知，胞內(nèi)酚酸羥自由基清除能力始終強(qiáng)于胞外酚酸。在發(fā)酵過(guò)程中，胞內(nèi)、胞外酚酸羥自由基清除率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，并于第6天達(dá)到峰值，分別為 29.35%、28.61%，差異顯著（P＜0.05），較發(fā)酵第 1天分別提高了2.52倍、4.61倍。與靈芝液體培養(yǎng)2 d～6 d的羥自由基清除能力變化趨勢(shì)類似[10]。

2.3.4 發(fā)酵過(guò)程中ABTS+自由基清除率變化

發(fā)酵過(guò)程中胞內(nèi)、胞外酚酸ABTS+自由基清除能力變化見圖7。

圖7 發(fā)酵過(guò)程中胞內(nèi)、胞外酚酸ABTS+自由基清除能力變化Fig.7 Changes of intracellular and extracellular ABTS+scavenging ability during fermentation

ABTS是一種水溶性的自由基引發(fā)劑，在清除ABTS+自由基反應(yīng)中，抗氧化劑通過(guò)抑制藍(lán)綠色的ABTS+自由基的產(chǎn)生來(lái)評(píng)價(jià)抗氧化性。當(dāng)遇到具有抗氧化活性的物質(zhì)時(shí)，ABTS+自由基會(huì)被還原，溶液顏色變淺，吸光值降低；吸光值越小，說(shuō)明自由基清除劑的清除能力越強(qiáng)，以此可評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化活性[23]。由圖7可知，胞內(nèi)、胞外酚酸ABTS+自由基清除能力基本相同。在發(fā)酵過(guò)程中，胞內(nèi)、胞外酚酸的ABTS+自由基清除率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，并于第6天達(dá)到峰值，分別為 44.52%、47.32%，差異顯著（P＜0.05），較發(fā)酵第1天分別提高了1.03倍、1.14倍。與桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)2d～6d過(guò)程中ABTS+自由基清除能力趨勢(shì)一致[19]。

2.3.5 發(fā)酵過(guò)程中DPPH自由基清除率變化

發(fā)酵過(guò)程中胞內(nèi)、胞外酚酸DPPH自由基清除能力變化見圖8。

圖8 發(fā)酵過(guò)程中胞內(nèi)、胞外酚酸DPPH自由基清除能力變化Fig.8 Changes of DPPH scavenging capacity of intracellular and extracellular phenolic acids during fermentation

DPPH是一種穩(wěn)定的順磁化合物，若自由基清除劑存在時(shí)，則DPPH接受一個(gè)電子或氫原子，單電子被配對(duì)而形成穩(wěn)定的DPPH-H化合物，使其乙醇溶液從深紫色變?yōu)辄S色，變色程度與配對(duì)電子數(shù)（自由基清除活性）成正比[24]。因此通過(guò)DPPH的清除率可反映出酚酸的抗氧化活性。由圖8可知，在發(fā)酵前期，胞外酚酸DPPH自由基清除能力大于胞內(nèi)酚酸，在發(fā)酵后期，情況相反。在發(fā)酵過(guò)程中，胞內(nèi)、胞外酚酸DPPH自由基清除能力隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，并于第6天達(dá)到峰值，分別為50.54%、34.39%，差異極顯著（P＜0.01），較發(fā)酵第1天分別提高了10.52倍、3.17倍。與櫟生桑黃液體發(fā)酵過(guò)程中DPPH自由基清除能力變化趨勢(shì)一致[25]。

3 結(jié)論

本文以發(fā)酵過(guò)程中的柴達(dá)木大肥菇為研究對(duì)象，利用超聲波輔助法提取胞內(nèi)、胞外酚酸，采用ABTS+自由基、DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基清除能力及鐵離子還原能力5個(gè)抗氧化體系，綜合分析柴達(dá)木大肥菇在發(fā)酵過(guò)程中胞內(nèi)、胞外酚酸抗氧化活性變化。結(jié)果顯示：在發(fā)酵過(guò)程中菌絲體生物量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在第5天時(shí)菌絲體生物量達(dá)到最大，較第1天提升25.08倍；酚酸含量變化呈現(xiàn)先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，胞外酚酸含量高于胞內(nèi)酚酸含量，在發(fā)酵后胞外酚酸含量提升了4.56倍，胞內(nèi)酚酸含量提升了17.91倍；柴達(dá)木大肥菇發(fā)酵過(guò)程中胞內(nèi)、胞外酚酸具有良好的抗氧化活性，且胞內(nèi)酚酸的抗氧化能力高于胞外酚酸的抗氧化能力。所得柴達(dá)木大肥菇胞內(nèi)酚酸對(duì)ABTS+自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基的最高清除率及最高鐵離子還原能力分別為44.52%、50.54%、63.90%、29.35%、7.17%，分別是最低值的2.03倍、11.52倍、20.61倍、3.52倍、1.05倍，胞外酚酸對(duì)4種自由基的最高清除率及鐵離子還原能力分別為47.32%、34.39%、23.95%、28.61%、3.67%，分別是最低值的2.14倍、4.17倍、14.09倍、5.61倍、1.13倍。柴達(dá)木大肥菇發(fā)酵過(guò)程中胞內(nèi)、胞外酚酸體現(xiàn)了良好的抗氧化能力，可以作為天然抗氧化劑進(jìn)一步開發(fā)利用。