商海軍，蔣麗君，江本利，姚曉華，閆曉明*，於春*

（1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，安徽 合肥 230031；2.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230601；3.青海省農(nóng)林科學(xué)院，青海 西寧 810016）

藜麥屬于藜科，產(chǎn)自安第斯山脈，有7 000年左右的歷史，是當(dāng)?shù)氐闹饕澄飦碓?，被稱為糧食之母[1]。藜麥相比其它谷物，營養(yǎng)更加均衡豐富，富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、脂肪酸和維生素等[2-3]。此外，藜麥還含有黃酮、皂苷和多酚等生物活性物質(zhì)，具有抗氧化和抗癌等多種藥理作用，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO） 認(rèn)定為一種“全營養(yǎng)食品”[4]。為了在世界上推廣藜麥，聯(lián)合國將2013年設(shè)定為國際藜麥年，藜麥被越來越多的消費(fèi)者了解，藜麥的產(chǎn)品也得到越來越多的歡迎和支持。近些年，藜麥在中國的青海、新疆、山西和寧夏開始被種植，藜麥也因此走上了中國人的餐桌。

藜麥蛋白主要分布在藜麥的胚、胚乳以及種皮里，含量為14%左右[5]，并且藜麥蛋白也是一種含有大量賴氨酸和組氨酸的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)[6]，高于水稻、大麥和玉米等大多數(shù)谷類，和小麥蛋白含量相當(dāng)[7]，是一種很好的植物蛋白來源。目前科學(xué)家對于藜麥的研究主要集中在它的籽實(shí)部位，只有少量關(guān)于藜麥秸稈的發(fā)酵可以改善其作為飼料價(jià)值的研究，絕大多數(shù)秸稈在收割時(shí)會(huì)被遺棄。與其他作物的秸稈相比，藜麥秸稈含有豐富的粗蛋白質(zhì)，含量為10.14%～13.14%[8]，但目前對于藜麥秸稈蛋白的結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)鮮見報(bào)道。因此為了進(jìn)一步開發(fā)藜麥植株潛在的營養(yǎng)和應(yīng)用價(jià)值，本文研究和分析藜麥秸稈蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性及pH值和溫度對其功能性質(zhì)的影響，以期望可以開發(fā)出具有適當(dāng)功能特性的植物蛋白，來解決藜麥?zhǔn)崭詈蟮慕斩捥幚韱栴}以及為藜麥秸稈蛋白的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜麥秸稈（青藜2號(hào)）：青海省農(nóng)科院藜麥種植基地栽培，粒色白色，株高170 cm，2019年4月中下旬以覆膜穴播方式播種，2019年10月收獲，秸稈經(jīng)晾曬至水分為10%～12%，無腐敗現(xiàn)象；蛋白Maker：北京索萊寶科技有限公司；纖維素酶（50 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；聚丙烯酰胺、四甲基乙二胺、Tris/HCl緩沖液、過硫酸銨、β-巰基乙醇、5，5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）[5，5′-dithiobis（2-nitrobenzoic acid），DTNB]：合肥拜爾迪生物技術(shù)有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CT15RT臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：上海天美科學(xué)儀器有限公司；ALPHA1-2LD冷凍干燥機(jī)：德國CHRIST公司；IR Prestige型傅里葉紅外光譜儀：日本島津公司；VELP-UDK159全自動(dòng)凱氏定氮儀：北京金洋萬達(dá)科技有限公司；DSC8000差示量熱掃描儀：美國Perkin Elmer公司；DYY-4C型高壓雙穩(wěn)電泳儀：北京六一生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藜麥秸稈蛋白的制備

1.3.1.1 提取流程

參照許新月等[9]的方法提取藜麥秸稈蛋白。提取流程：藜麥秸稈→加入3倍水→打漿1min→超聲30min→過濾→調(diào)節(jié)pH值至5→加纖維素酶→酶解8 h→滅酶→5 000 r/min離心20 min→真空冷凍干燥→產(chǎn)物干粉。

1.3.1.2 藜麥秸稈蛋白純度的測定

藜麥秸稈蛋白的含量采用凱氏定氮法進(jìn)行測定，藜麥秸稈蛋白純度按下列公式計(jì)算。

式中：P為藜麥秸稈蛋白的純度，%；m為產(chǎn)物干粉中藜麥秸稈蛋白的質(zhì)量，g；M為產(chǎn)物干粉質(zhì)量，g。

1.3.2 藜麥秸稈蛋白的結(jié)構(gòu)測定

1.3.2.1 藜麥秸稈蛋白分子量測定

參照張?jiān)絒10]的方法，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）測定藜麥秸稈蛋白質(zhì)分子量。測定條件：配制12%的分離膠、5%的濃縮膠；上樣15 μL；濃縮膠電壓120 V，分離膠電壓200 V；常溫（25℃左右）固定膠板、染色、脫色。

1.3.2.2 藜麥秸稈蛋白的熱學(xué)特性

參照邱月[11]的方法，使用差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）測定藜麥秸稈蛋白的熱學(xué)特性。將2 mg藜麥秸稈蛋白粉在鋁盒中均勻鋪平，密封壓片，放入DSC儀器中進(jìn)行檢測，對照組為密封的空鋁盒，加熱速率為10℃/min，樣品溫度范圍為30℃～150℃。

1.3.2.3 藜麥秸稈蛋白巰基和二硫鍵含量的測定

參照王洪偉等[12]方法對藜麥秸稈蛋白巰基和二硫鍵含量進(jìn)行測定。游離巰基含量：向0.5 mL 10 mg/mL藜麥秸稈蛋白樣品中加入0.02 mL 4 mg/mL DTNB和2.5 mL 8 mol/L尿素溶液（以Tris-Gly配制），25℃條件下反應(yīng)25 min后，在412 nm波長下測定其吸光度值?？値€基含量：向0.2 mL 10 mg/mL藜麥秸稈蛋白樣品中加入0.02 mLβ-巰基乙醇和1.0 mL 10 mol/L尿素溶液（以Tris-Gly配制），混勻后在25℃條件下反應(yīng)1 h，然后量取10 mL 12%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）加到樣品中，25℃繼續(xù)反應(yīng)1 h后，在5 000 r/min條件下離心10 min，用12%TCA溶液洗滌離心所得沉淀物兩次，然后將洗滌后的沉淀物用3.0 mL 8 mol/L尿素溶液（以Tris-Gly配制）溶解，再繼續(xù)添加0.04 mL DTNB，25℃條件下反應(yīng)25 min，最后在412 nm波長下測其吸光度值?？瞻自囼?yàn)均用Tris-HCl，平行測定3次。按下列公式進(jìn)行計(jì)算。

式中：1.36×104為 Elman 的摩爾消光系數(shù)；A412為412 nm波長處測得的吸光度值；C為藜麥秸稈蛋白樣品的濃度，mg/mL；D 為稀釋因子（D1為6.04、D2為15）。

1.3.2.4 藜麥秸稈蛋白二級結(jié)構(gòu)的測定

參照魏君慧等[13]的方法。稱取1 mg藜麥秸稈蛋白粉，與100 mg KBr粉末混合，壓制成薄片。以KBr為背景，在4 000 cm-1～400 cm-1波數(shù)下對藜麥秸稈蛋白進(jìn)行紅外光譜分析，掃描次數(shù)為64次。

1.3.3 藜麥秸稈蛋白功能性測定

1.3.3.1 藜麥秸稈蛋白溶解度

參照Wu等[14]的方法。取20 mL 10.0 mg/mL藜麥秸稈蛋白溶液，在一定溫度和pH值條件下水浴攪拌1 h，離心 10 min（4 000 r/min），測定上清液中蛋白質(zhì)的含量?？疾觳煌瑴囟群蚿H值對藜麥秸稈蛋白溶解度的影響：設(shè)定溫度為 30、40、50、60、70 ℃；pH 值為 3、5、7、9、11。溶解度按下列公式計(jì)算。

1.3.3.2 藜麥秸稈蛋白吸水性

參照張艷榮等[15]的方法。取20 mL 10.0 mg/mL的藜麥秸稈蛋白溶液，在一定溫度和pH值條件下水浴攪拌 1 h，離心 10 min（4 000 r/min），棄去上清液，測量殘留物質(zhì)的質(zhì)量。考察不同溫度和pH值對藜麥秸稈蛋白吸水性的影響：設(shè)定溫度為 30、40、50、60、70 ℃；pH 值為 3、5、7、9、11。吸水性按下列公式計(jì)算。

1.3.3.3 藜麥秸稈蛋白起泡性

參照鄭文彬等[16]的方法。取50 mL 10.0 mg/mL的藜麥秸稈蛋白溶液，在一定溫度和pH值條件下高速攪拌20 min，用量筒測量泡沫體積及液體體積?？疾觳煌瑴囟群蚿H值對藜麥秸稈蛋白的起泡性的影響：設(shè)定溫度為 30、40、50、60、70 ℃；pH 值為 3、5、7、9、11。起泡性按下列公式計(jì)算。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel和Origin 8.5軟件對試驗(yàn)過程中測定的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜麥秸稈蛋白的純度

通過凱氏定氮法對提取得到的藜麥秸稈蛋白粉中的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定，得到藜麥秸稈蛋白純度為80.55%，其純度高于王棐等[17]提取的藜麥蛋白純度（78.30%）和Aluko等[18]提取的藜麥蛋白純度（65.52%）。

2.2 藜麥秸稈蛋白結(jié)構(gòu)特性

2.2.1 藜麥秸稈蛋白分子量測定結(jié)果

藜麥秸稈蛋白的SDS電泳圖譜見圖1。

圖1 藜麥秸稈蛋白的SDS電泳圖譜Fig.1 SDS electrophoresis pattern of quinoa straw protein

由圖1中可以看出，藜麥秸稈蛋白在66.4 ku～97.2 ku、29.0 ku～44.3 ku、20.1 ku～29.0 ku、14.3 ku～20.1 ku以及小于14.3 ku范圍內(nèi)有條帶，其29.0 ku～44.3 ku和小于14.3 ku條帶染色程度較深，表明該分子質(zhì)量范圍內(nèi)的蛋白含量較高，因此可以說明藜麥秸稈蛋白中中低分子量的蛋白質(zhì)占多數(shù)。

球蛋白和白蛋白是藜麥蛋白的兩種主要蛋白質(zhì)，它們具有特殊的二級結(jié)構(gòu)，其亞基之間的相互作用影響著蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和理化學(xué)性質(zhì)[19]。11S球蛋白，是許多雙子葉植物家族的主要成分，分子量范圍在20 ku～22 ku和33 ku～36 ku附近[20]，所以圖1中分子量在29.0 ku～44.3 ku和20.1 ku～29.0 ku范圍內(nèi)的條帶可能為11S球蛋白。2S白蛋白是第二豐富的蛋白質(zhì)，對應(yīng)的分子量小于20 ku[21]，圖1中分子量為14.3 ku～20.1 ku和小于14.3 ku范圍內(nèi)的條帶可能為2S白蛋白。

2.2.2 藜麥秸稈蛋白熱學(xué)特性結(jié)果分析

藜麥秸稈蛋白的DSC曲線見圖2。

圖2 藜麥秸稈蛋白的DSC曲線Fig.2 DSC curve of quinoa straw protein

在DSC曲線上若有吸熱峰，則該吸收峰區(qū)域?yàn)樽冃詼囟确秶?，吸收峰的峰值所對?yīng)的溫度是該樣品的熱變性溫度[22]。由圖2可以看出，藜麥秸稈蛋白出現(xiàn)了一次吸收峰，說明發(fā)生了一次變性。藜麥秸稈蛋白的變性溫度較高，起始變性溫度為131.06℃，峰值變性溫度為132.72℃，終止變性溫度為134.51℃。變性熱焓的大小還可以作為蛋白變性程度的依據(jù)，熱焓越大，表明變性越小[23-24]，藜麥秸稈蛋白的焓變?yōu)?.82 J/g，而Abugoch等[25]研究發(fā)現(xiàn)藜麥蛋白的變性熱焓為12.40 J/g，變性溫度為98.1℃，可以看出藜麥秸稈蛋白的熱穩(wěn)定性更好，變性程度更大。

2.2.3 藜麥秸稈蛋白巰基和二硫鍵含量的分析

二硫鍵通常能與同樣具有很高化學(xué)活性的巰基之間發(fā)生相互轉(zhuǎn)化，從而共同影響著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定及其功能性質(zhì)。所以，測定蛋白質(zhì)中的巰基和二硫鍵含量，在分析研究蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)之間的關(guān)系尤為重要[26]。藜麥秸稈蛋白的巰基鍵和二硫鍵含量見圖3。

圖3 藜麥秸稈蛋白的巰基鍵和二硫鍵含量Fig.3 The sulfhydryl bond and disulfide bond content of quinoa straw protein

從圖3可以看出，藜麥秸稈蛋白中游離巰基含量為 10.21 μmol/g，二硫鍵含量為 23.57 μmol/g。與一般植物蛋白相比，例如杏鮑菇分離蛋白的游離巰基和二硫鍵含量分別為 40.75 μmol/g 和 10.39 μmol/g[13]，核桃蛋白游離巰基和二硫鍵含量分別為8.45 μmol/g和5.20 μmol/g[27]，藜麥秸稈蛋白的二硫鍵含量更高。在蛋白質(zhì)分子中，二硫鍵含量影響著蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)，二硫鍵含量高的蛋白質(zhì)更有利于形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[28]。Kinsella[29]研究發(fā)現(xiàn)含有二硫鍵的蛋白具有較高的熱穩(wěn)定性，這也是藜麥秸稈蛋白的熱焓和變性溫度較高的原因。

2.2.4 藜麥秸稈蛋白傅里葉紅外結(jié)果分析

一般情況下，蛋白質(zhì)和多肽在紅外區(qū)都有著若干特征吸收譜帶，如酰胺I帶（1 700 cm-1～1 600 cm-1）、酰胺Ⅱ帶（1 550 cm-1～1 530 cm-1）和酰胺Ⅲ帶（1 300 cm-1～1 260 cm-1）[30]。其中，酰胺I帶最常用于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的分析，反映α-螺旋（1 660 cm-1～1 650 cm-1）、β-折疊（1 640 cm-1～1 600 cm-1）、β-轉(zhuǎn)角（1 700 cm-1～1 660 cm-1）及無規(guī)則卷曲（1650cm-1～1640cm-1）等不同結(jié)構(gòu)信息[31]。通過對藜麥秸稈蛋白酰胺I帶（1 700 cm-1～1 600 cm-1）的圖譜去卷積、基線校準(zhǔn)、二階導(dǎo)數(shù)擬合后進(jìn)行分峰擬合得到圖4。

圖4 藜麥秸稈蛋白在酰胺I帶的分峰擬合圖Fig.4 Peak fitting diagram of quinoa straw protein in the amide I band

由圖4可知，分峰擬合后共獲得8個(gè)單一峰，計(jì)算各子峰的面積，得出相對應(yīng)結(jié)構(gòu)所占比例，結(jié)果如表1所示。

表1 藜麥秸稈蛋白的二級結(jié)構(gòu)的含量Table 1 The content of secondary structure of quinoa straw protein

由表1可知，藜麥秸稈蛋白的二級結(jié)構(gòu)以β-轉(zhuǎn)角為主，含量為36.42%，β-轉(zhuǎn)角可以促進(jìn)蛋白質(zhì)生成球狀結(jié)構(gòu)；α-螺旋和β-折疊含量相當(dāng)，分別為25.19%和25.91%，β-折疊含量高也可以進(jìn)一步說明藜麥秸稈蛋白的變性溫度較高；而無規(guī)則卷曲含量最低，為12.48%。因?yàn)棣?轉(zhuǎn)角在藜麥秸稈蛋白二級結(jié)構(gòu)中含量最高，所以藜麥秸稈蛋白的功能性質(zhì)很可能大部分取決于β-轉(zhuǎn)角，其它的二級結(jié)構(gòu)也同樣影響著其功能性質(zhì)。

2.3 藜麥秸稈蛋白的功能性質(zhì)

2.3.1 藜麥秸稈蛋白的溶解度

蛋白質(zhì)的溶解度可以作為評價(jià)食品品質(zhì)和穩(wěn)定性的主要指標(biāo)之一，它對蛋白的吸水性、起泡性等都會(huì)產(chǎn)生一定的影響。不同溫度和pH值對藜麥秸稈蛋白溶解度的影響見圖5。

圖5 不同溫度和pH值對藜麥秸稈蛋白溶解度的影響Fig.5 Effect of different temperatures and pH on the protein solubility of quinoa straw

從圖5a可以看出，蛋白質(zhì)的溶解度在30℃～60℃不斷上升，當(dāng)溫度達(dá)到60℃時(shí)，溶解度達(dá)到最高，為53.61%，但是隨著溫度繼續(xù)升高，蛋白質(zhì)溶解度在不斷減小。這是因?yàn)檫m宜的溫度可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解，然而當(dāng)溫度過高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生變性，進(jìn)而導(dǎo)致溶解度的降低[32]。從圖5b可以看出，當(dāng)pH值在3～5時(shí)，溶解度不斷減小，因?yàn)閜H值接近等電點(diǎn)時(shí)，溶解度最小。當(dāng)pH值大于5時(shí)，溶解度不斷增加，在pH值為9時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度達(dá)到最大，為46.37%。這是因?yàn)樵趬A性pH值條件下，氨基的脫質(zhì)子和羧基的電離導(dǎo)致帶負(fù)電荷的物質(zhì)變多，蛋白質(zhì)與溶劑的相互作用得到改善，使蛋白質(zhì)的溶解度增加，但是隨著堿性繼續(xù)增強(qiáng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，溶解度下降[33]。因此，藜麥秸稈蛋白更適合在中性或弱堿性的條件下使用。藜麥蛋白最高溶解度為63.68%，藜麥秸稈蛋白的最高溶解度比藜麥蛋白低，但是在pH值為3時(shí)，藜麥秸稈蛋白的溶解度（36.35%）比王棐等[17]研究的藜麥蛋白的溶解度（約20%）、大豆蛋白溶解度（約10%）和豌豆蛋白溶解度（約5%）都高，這也為藜麥秸稈蛋白其它的功能性質(zhì)研究提供基礎(chǔ)。

2.3.2 藜麥秸稈蛋白的吸水性

蛋白質(zhì)的吸水性表示蛋白質(zhì)結(jié)合水分子的能力，是蛋白質(zhì)的重要功能性質(zhì)，對于研究食品的質(zhì)地、水分含量以及口感有重要作用。不同溫度和pH值對藜麥秸稈蛋白吸水性的影響見圖6。

圖6 不同溫度和pH值對藜麥秸稈蛋白吸水性的影響Fig.6 Effect of different temperatures and pH values on the water absorption of quinoa straw protein

由圖6a可知，溫度在30℃～60℃時(shí)，藜麥秸稈蛋白的吸水性呈上升趨勢，在60℃吸水性達(dá)到最大，為3.11 g/g，隨著溫度的進(jìn)一步升高，吸水性降低。這是因?yàn)闇囟鹊陀谧冃詼囟葧r(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生伸展，有一部分親水基團(tuán)可能會(huì)和水結(jié)合，然而溫度過高，蛋白變性，暴露許多非極性基團(tuán)，減弱了與水的作用，導(dǎo)致吸水性降低[15]。由圖6b可以看出，蛋白質(zhì)的吸水性隨著pH值的升高呈先降低后增加再降低的趨勢，在pH值為9的時(shí)候，蛋白吸水性最高為3.34 g/g。這是因?yàn)閜H值接近蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)-水分子間結(jié)合的能力最弱，隨著pH值的升高，偏離等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)的吸水能力隨之增強(qiáng)[34]。但是堿性繼續(xù)增強(qiáng)，蛋白會(huì)發(fā)生變性，所以吸水性變?nèi)?，該現(xiàn)象進(jìn)一步說明了pH值對蛋白的吸水性有較大影響。另外，藜麥秸稈蛋白的吸水性比何興芬[35]研究的藜麥蛋白最大持水性1.62 g/g要高，所以藜麥秸稈蛋白在食品品質(zhì)研究上具有重要價(jià)值。

2.3.3 藜麥秸稈蛋白的起泡性

不同溫度和pH值對藜麥秸稈蛋白起泡性的影響見圖7。

圖7 不同溫度和pH值對藜麥秸稈蛋白起泡性的影響Fig.7 Effect of different temperatures and pH values on the foaming ability of quinoa straw protein

由圖7a可以看出，蛋白質(zhì)的起泡性隨著溫度的升高呈上升趨勢，在60℃條件下，蛋白起泡性最高為40.24%。這是因?yàn)闇囟冗m當(dāng)?shù)靥岣?，可以增大蛋白的溶解度，使可溶性蛋白含量增加。又由于泡沫的形成與可溶性蛋白含量有關(guān)，所以促進(jìn)了起泡性的增加[36]。但是隨溫度繼續(xù)升高，蛋白發(fā)生變性，進(jìn)而起泡性降低。由圖7b可以看出，藜麥秸稈蛋白質(zhì)的起泡性在pH值為9時(shí)最高（40.86%）；pH值為5時(shí)最低（26.36%）。這是因?yàn)閜H值為5時(shí)，溶解度較低，可溶性蛋白含量少，形成泡沫較少[36-37]。隨著溶液pH值呈堿性，藜麥秸稈蛋白里的凈電荷在不斷增加，疏水作用力減小，蛋白質(zhì)擴(kuò)散到溶液界面的速度加快，產(chǎn)生大量泡沫[38]，所以藜麥秸稈蛋白起泡性增加。

3 結(jié)論

本文研究了藜麥秸稈蛋白的結(jié)構(gòu)特性和功能性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)藜麥秸稈蛋白以中低分子量的蛋白居多，分子量主要分布在29.0 ku～44.3 ku和小于14.3 ku的范圍內(nèi)。藜麥秸稈蛋白變性溫度為132.72℃，有著較好的熱穩(wěn)定性，其巰基和二硫鍵含量較高，這也是藜麥秸稈蛋白熱焓和變性溫度較高的一個(gè)原因。紅外光譜分析藜麥秸稈蛋白的β-轉(zhuǎn)角相對占比最高，α-螺旋和β-折疊相當(dāng)，無規(guī)則卷曲占比最低。另外，溫度為60℃時(shí)和pH值為9時(shí)，藜麥秸稈蛋白的溶解度、吸水性和起泡性最好，說明溫度和pH值對藜麥秸稈蛋白的溶解度、吸水性和起泡性等功能性質(zhì)影響較大，因此研究蛋白性質(zhì)時(shí)要注意控制這些影響因素。本研究為藜麥秸稈蛋白的產(chǎn)品研究和開發(fā)提供參考。