羅晟，趙澤文，任新宇，魏宏宇，馬雅靜，潘起濤，李榮同，龔國勝，程新*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用微生物研究所，南昌330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，南昌330045；3.東華理工大學(xué)化學(xué)生命與材料學(xué)院，南昌330013；4.江西五圓科農(nóng)實業(yè)有限公司，江西 黎川344600）

鎘（Cd）被認為是對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)危害最大的重金屬之一[1]。近年來，隨著礦產(chǎn)開采、加工等人類活動的活躍，Cd在自然環(huán)境中的含量不斷上升[2]，不僅對植物產(chǎn)生嚴(yán)重的毒害作用，影響植物的生長發(fā)育，同時還可以在植物可食用部分富集，并隨著食物鏈的傳遞到達人體，導(dǎo)致人體Cd元素含量超標(biāo)[3]，進而引發(fā)多種人類的慢性病以及癌癥等[4]。

目前Cd的治理策略主要有兩種，第一是直接去除土壤中超量的Cd，第二是通過理化方法改變Cd在土壤中的形態(tài)，進而降低Cd在環(huán)境中的遷移性和有效性[5]。現(xiàn)有研究表明，使用物理、化學(xué)和生態(tài)修復(fù)等手段直接去除環(huán)境中的Cd污染雖然取得了一定的成效，但這些方法存在成本高、易造成二次污染、周期長等缺點[6]，嚴(yán)重制約了其大規(guī)模應(yīng)用。而近年來，脯氨酸、甜菜堿、硅肥等外源性化學(xué)物質(zhì)均被證實可用于緩解過量Cd脅迫對植物的毒害作用，大幅度提高了煙草、玉米等對Cd的抗逆性[7]。

多糖作為一種新型的生物源大分子物質(zhì)，近年來其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用潛力正日益引起人們的關(guān)注。有研究表明，多糖不僅可以提高動植物的抗氧化能力[8]、調(diào)節(jié)動植物生長，同時多糖大分子可以通過金屬的微沉淀、質(zhì)子交換等方式強力絡(luò)合重金屬[9]，降低重金屬的遷移性和毒害性。相較于動植物多糖，微生物多糖具有培養(yǎng)周期短、成本低、產(chǎn)量大、過程可控、易于分離等優(yōu)點[10]，具有較好的應(yīng)用前景。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌胞外多糖可作為一種良好的植物生長調(diào)節(jié)劑促進植物生長，同時具有促進鹽、酸與銅離子脅迫條件下水稻生長的特性[11-14]。在上述研究的基礎(chǔ)上，本研究以自行分離的屎腸球菌所產(chǎn)胞外多糖為對象，研究其對Cd脅迫下水稻種子萌發(fā)和幼苗生長發(fā)育的影響，并通過形態(tài)學(xué)指標(biāo)測定、生理代謝分析、抗氧化體系活力測定等手段，初步闡明屎腸球菌胞外多糖誘導(dǎo)水稻緩解Cd毒害的效果與作用機理，為利用天然生物活性物質(zhì)緩解重金屬對植物生長的毒害作用提供理論與實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

屎腸球菌（Enterococcusfaecalis）CX 2-6由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用微生物研究所提供。

供試水稻品種為五優(yōu)308，由廣東省金稻種業(yè)有限公司提供。選取粒大飽滿的水稻籽粒，用5%NaClO浸泡消毒10 min，然后用蒸餾水沖洗5～7次，于28℃蒸餾水中浸泡24 h，瀝干水備用。

MRS培養(yǎng)基：牛肉膏10 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，酵母浸粉5.0 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，無水乙酸鈉5.0 g·L-1，檸檬酸氫二銨2 g·L-1，結(jié)晶硫酸鎂0.58 g·L-1，硫酸錳0.25 g·L-1，吐溫80 1 mL·L-1。pH 6.5，121℃高壓滅菌15 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 屎腸球菌胞外多糖的制備

將活化的屎腸球菌接種于MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h，10 000 r·min-1離心10 min除去菌體。上清液減壓濃縮至原體積的1/3，加入80%（m/V）的三氯乙酸至終體積7%（m/V）除蛋白，4℃靜置12 h，10 000 r·min-1離心10 min收集上清，加入3倍體積95%乙醇于4℃靜置過夜，4℃10 000 r·min-1離心10 min收集沉淀，用蒸餾水將沉淀溶解，裝入透析袋中（截留分子量8～14 kDa）透析72 h，冷凍干燥制得粗多糖。

1.2.2 水稻種子萌發(fā)

將消毒好的水稻種子平鋪在墊有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿30粒，用不同濃度的Cd與胞外多糖溶液浸泡進行復(fù)合培養(yǎng)。設(shè)置Cd（CdCl2·2.5H2O）濃度為0、20、40 mg·L-1，胞外多糖濃度為0、500、1 000 mg·L-1，共9個處理，每個處理3次重復(fù)，每皿每次添加10 mL上述混合溶液，每2 d更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)至第8 d洗凈備用。

1.2.3 水稻幼苗的培養(yǎng)

將消毒好的水稻種子均勻撒在放置有濕潤紗布的白瓷盤中，28℃恒溫暗光催芽48 h，保持紗布濕潤。將長勢一致的水稻幼苗轉(zhuǎn)移至含有500 mL 1/4濃度Hoagland培養(yǎng)液的黑色快餐盒中室溫培養(yǎng)，每3 d更換一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)至第10 d時，用全濃度的Hoagland培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每次更換培養(yǎng)液時，向培養(yǎng)液中同時添加不同濃度的Cd與屎腸球菌胞外多糖，Cd與胞外多糖濃度如1.2.2所述，設(shè)置9個處理，每個處理4次重復(fù)，每3 d更換一次培養(yǎng)液。水稻生長至第15 d與第25 d時取樣進行數(shù)據(jù)測定。

1.2.4 水稻形態(tài)指標(biāo)的測定

在第3 d測定水稻種子發(fā)芽勢，第8 d測定種子發(fā)芽率，同時在第8 d時記錄水稻種子根長和芽長。水稻幼苗在播種后第15 d與第25 d時隨機取樣，測定其株高、葉長、根長。

1.2.5 水稻Cd含量的測定

參照1.2.3，水稻培養(yǎng)至第10 d時，向營養(yǎng)液中添加Cd與屎腸球菌胞外多糖，Cd濃度恒定為20 mg·L-1，胞外多糖濃度為0、50、100 mg·L-1，每個處理4次重復(fù)，培養(yǎng)至第15 d。取新鮮水稻組織，用含有硫酸鈣的去離子水洗滌，于80℃下烘干3 d，樣品置于3 mL HNO3中消化，先于75℃消化10 min，再于105℃加熱15 min，隨后冷卻10 min，向三角瓶中添加1 mL H2O2，隨后再于109℃加熱15 min。使用原子吸收分光光度計（AAS）測定樣品中Cd濃度，從1 000 mg·L-1的原液中制備Cd的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進行梯度稀釋（0.1～4.0 mg·L-1），以覆蓋標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線的最佳吸光度范圍。

1.2.6 水稻可溶性糖和可溶性蛋白含量的測定

參考陳順鈺等[15]的方法，采用硫酸-蒽酮法測定可溶性糖，采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白。

1.2.7 抗氧化酶活及丙二醛含量的測定

丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）[16]法測定?？寡趸富钚缘臏y定參考Zhang等[17]的方法，采用氮藍四唑（NBT）比色法測定超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性、雙氧水法測定過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性、愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性。

1.2.8 光合色素的測定

參考Shyam等[18]的方法，采用乙醇丙酮法測定光合色素的含量。

1.2.9 類黃酮和花色素苷的測定

取新鮮葉片0.5 g，用適量含1%鹽酸的乙醇溶液研磨，于30℃搖床（100 r·min-1）浸提2 h，過濾，定容至10 mL備用。

類黃酮的測定參考張路等[19]的方法，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，以蘆丁濃度（mg·mL-1）為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)的擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.340 3x-0.004 6，相關(guān)系數(shù)r=0.998 7。

花色素苷的測定參考黃瑩瑩[20]的方法，采用分光光度計法測定提取液在535 nm處的OD值。花色素苷含量（μg·g-1）=OD×10/m，m為水稻葉片質(zhì)量（g）。

1.2.10 傅里葉紅外變換光譜分析（FTIR）

參照余順慧等[21]的方法，取新鮮水稻葉片于105℃殺青30 min，再于75℃烘箱中干燥48 h，粉碎后過75μm篩子，測定時將樣品與KBr混合，設(shè)置光譜范圍4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1。紅外光譜圖中的特征吸收峰與官能團鑒定參考文獻[22]。

1.2.11 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)采用DPS7.05軟件進行統(tǒng)計分析和方差分析，采用Origin 2018軟件進行作圖。圖、表中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 胞外多糖對Cd脅迫下水稻種子萌發(fā)的影響

2.1.1 對水稻種子萌發(fā)態(tài)指標(biāo)的影響

由表1及圖1可以看出，Cd脅迫嚴(yán)重抑制了水稻種子的萌發(fā)，且隨著Cd濃度升高抑制作用增強。在Cd脅迫下添加胞外多糖促進了水稻種子萌發(fā)的發(fā)芽勢和發(fā)芽率。在20 mg·L-1Cd脅迫下，相較于不添加胞外多糖組，添加500 mg·L-1和1 000 mg·L-1胞外多糖水稻種子的發(fā)芽勢分別提高了21.73%和18.83%，發(fā)芽率均提高了10.67%。

Cd脅迫條件下，胞外多糖的添加促進了根的生長。在40 mg·L-1Cd脅迫下，與不添加胞外多糖組相比，添加500 mg·L-1和1 000 mg·L-1胞外多糖使水稻根長分別增加了3.83%和62.84%。但值得注意的是，水稻種子的芽長受到胞外多糖的強烈抑制，在40 mg·L-1Cd脅迫下，添加500 mg·L-1和1 000 mg·L-1胞外多糖較不添加胞外多糖組使水稻芽長分別降低了42.45%和76.65%。

2.1.2 對水稻種子可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響

由圖2可知，Cd脅迫顯著提高了水稻種子蛋白質(zhì)的含量，添加胞外多糖提高了水稻種子萌發(fā)過程中可溶性蛋白的含量，抑制了可溶性糖的含量，且隨著胞外多糖濃度升高，可溶性蛋白含量也升高。與相應(yīng)對照組相比，在20 mg·L-1Cd脅迫下，添加500 mg·L-1和1 000 mg·L-1胞外多糖水稻種子可溶性蛋白含量分別

表1不同濃度屎腸球菌胞外多糖對Cd脅迫下水稻種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、根長和芽長的影響Table 1 Effects of different concentrations of exopolysaccharides from Enterococcusfaecalis on germination rate，germination potential，root length and bud length of rice seedsunder cadmium stress

圖1屎腸球菌胞外多糖對Cd脅迫下水稻種子萌發(fā)的影響

Figure 1 Effect of exopolysaccharides fromEnterococcusfaecalison rice seed germination under cadmium stress提高了10.15%和6.79%，在40 mg·L-1Cd脅迫下，可溶性蛋白含量分別提高了16.70%和29.25%。

2.1 .3對水稻種子抗氧化酶活及MDA含量的影響

由表2可知，Cd的存在顯著抑制了水稻體內(nèi)多種抗氧化酶的活性，而添加胞外多糖顯著提升了水稻種子過氧化物酶的活性，且其上升趨勢與胞外多糖濃度有明顯的關(guān)聯(lián)性。相較于相應(yīng)對照組，在20 mg·L-1Cd脅迫下，添加500 mg·L-1和1 000 mg·L-1胞外多糖后，水稻種子POD酶活分別提高了42.29%和124.87%，而在40 mg·L-1Cd脅迫下，POD酶活分別提高了81.25%和131.95%。同時，在Cd脅迫條件下添加胞外多糖降低了水稻CAT酶活，提高了水稻種子MDA的含量，但對SOD酶活性無明顯影響。

圖2屎腸球菌胞外多糖對Cd脅迫下水稻種子可溶性蛋白及可溶性糖含量的影響Figure 2 Effect of exopolysaccharides from Enterococcusfaecalis on the content of soluble protein and sugar in rice seeds under cadmiumstress

表2屎腸球菌胞外多糖對Cd脅迫下水稻種子抗氧化酶活及MDA含量的影響Table 2 Effects of exopolysaccharides from Enterococcusfaecalis on antioxidant enzyme activity and MDA content of rice seeds under cadmium stress

2.2 胞外多糖對Cd脅迫下水稻幼苗生長的影響

2.2.1 對水稻幼苗形態(tài)指標(biāo)的影響

不同濃度Cd脅迫條件下，添加胞外多糖對水稻形態(tài)的影響效果如表3所示。Cd脅迫明顯抑制了水稻幼苗的生長，而添加胞外多糖可提高Cd脅迫下水稻幼苗的株高、根長和葉長。當(dāng)水稻生長至第15 d時，相較于相應(yīng)對照組，在20 mg·L-1Cd脅迫下，添加500 mg·L-1胞外多糖處理組水稻幼苗株高和葉長分別提高了7.42%和6.26%，而在40 mg·L-1Cd脅迫時，株高和葉長分別提高了15.08%和12.33%。當(dāng)水稻生長至第25 d時，也得到了相似的結(jié)果。

2.2.2 對水稻幼苗Cd含量的影響

胞外多糖的添加對水稻幼苗地上及地下部分Cd含量有較為顯著的影響。由圖3可知，Cd的添加顯著提高了水稻幼苗體內(nèi)Cd的含量，相對于不添加胞外多糖組，胞外多糖的添加促進了水稻根部Cd含量的升高，但顯著降低了水稻葉片Cd的含量。在添加50 mg·L-1胞外多糖時，水稻根部的Cd含量相較對照提高了5.32%，水稻葉片Cd含量降低了14%。

表3屎腸球菌胞外多糖對Cd脅迫下水稻幼苗形態(tài)指標(biāo)的影響Table 3 Effect of exopolysaccharides from Enterococcusfaecalis on the morphological indexes of rice seedlingsunder cadmium stress

2.2.3 對水稻幼苗抗氧化酶活及MDA含量的影響

Cd的存在顯著抑制了水稻幼苗CAT與POD的活性，且提高了水稻體內(nèi)MDA的含量，而添加胞外多糖對Cd脅迫下水稻幼苗抗氧化酶的活力有一定的促進作用，在水稻生長至第25 d時顯著降低了水稻幼苗MDA含量。從圖4可以看出，當(dāng)水稻生長至第15 d時，胞外多糖對水稻幼苗POD與SOD的活力存在一定促進作用，500 mg·L-1胞外多糖處理組，在20 mg·L-1Cd脅迫下，水稻幼苗POD活力相比于對照組提高了71.43%，在40 mg·L-1Cd脅迫下SOD活力相比于對照組提高了31.20%，但胞外多糖明顯抑制了水稻幼苗CAT的活力，且提高了水稻體內(nèi)MDA的含量。當(dāng)水稻生長至25 d時，胞外多糖對水稻幼苗體內(nèi)POD、SOD與CAT有一定促進作用，但在不同濃度Cd脅迫下存在差異，20 mg·L-1Cd脅迫下胞外多糖促進了水稻體內(nèi)POD和SOD的活力，40 mg·L-1Cd脅迫下胞外多糖促進了水稻體內(nèi)SOD和CAT的活力，且添加胞外多糖顯著降低了水稻體內(nèi)MDA的含量。

2.2.4 對水稻幼苗光合色素含量的影響

由表4可知，Cd的存在顯著抑制了水稻葉片光合色素的含量，胞外多糖對水稻幼苗光合色素含量有明顯促進作用。當(dāng)水稻生長至第15 d時，在20 mg·L-1Cd脅迫下，500 mg·L-1胞外多糖處理組相較于未處理組葉綠素a、類胡蘿卜素、總?cè)~綠素含量分別上升19.55%、34.00%和8.60%，葉綠素b含量下降了15.84%。在40 mg·L-1Cd脅迫下，不同濃度胞外多糖均可提高水稻幼苗光合色素含量，其中500 mg·L-1胞外多糖效果最顯著，相較于未處理組，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和總?cè)~綠素含量分別提高了108.77%、37.71%、180.00%、85.08%。當(dāng)水稻生長至第25 d時，在20 mg·L-1Cd脅迫下，500 mg·L-1胞外多糖處理組效果最佳，相較于對照組，葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量分別提高了24.22%、86.25%和38.99%。

2.2.5 對水稻幼苗類黃酮及花色素苷含量的影響

由圖5可知，Cd脅迫顯著抑制了水稻葉片內(nèi)類黃酮與花色素苷的含量，添加胞外多糖有效提高水稻幼苗類黃酮和花色素苷含量，且500 mg·L-1胞外多糖效果最佳。當(dāng)水稻生長至第15 d時，添加胞外多糖促進了水稻幼苗類黃酮與花色素苷的含量，添加500 mg·L-1胞外多糖使得在20 mg·L-1Cd脅迫下水稻葉片類黃酮與花色素苷含量相較于對照組分別提高了208.74%和27.13%，在40 mg·L-1Cd脅迫下分別提高了165.02%和28.57%。當(dāng)水稻生長至第25 d時，添加胞外多糖同樣促進了水稻幼苗類黃酮與花色素苷的含量，添加500 mg·L-1胞外多糖使得在20 mg·L-1Cd脅迫下水稻類黃酮與花色素苷含量分別提高了106.23%和40.70%，在40 mg·L-1Cd脅迫下分別提高了186.39%和118.75%。

2.2.6 水稻幼苗葉片紅外光譜的變化

圖3屎腸球菌胞外多糖對Cd脅迫下水稻幼苗Cd含量的影響Figure 3 Effect of exopolysaccharidesfrom Enterococcusfaecalis on cadmium content in rice seedlings under cadmiumstress

圖4屎腸球菌胞外多糖對Cd脅迫下水稻幼苗抗氧化酶及MDA含量的影響Figure 4 Effect of exopolysaccharidesfrom Enterococcusfaecalis on the activities of antioxidant enzymes and malondialdehyde contents in rice seedlings under cadmiumstress

植物體內(nèi)的有機大分子存在特異的官能團與轉(zhuǎn)動方式，可以通過FTIR進行快速識別，且特征吸收峰吸光度值的變化能側(cè)面反映此特征峰所代表官能團物質(zhì)含量的變化。在不同濃度的Cd脅迫和胞外多糖添加量下，應(yīng)用FTIR對不同處理條件下水稻幼苗葉片進行測定，結(jié)果如圖6所示。由圖可知，不同處理未使得各特征峰出現(xiàn)位移且無新特征峰出現(xiàn)，只是各特征峰峰強發(fā)生了變化，Cd脅迫使得水稻葉片的紅外特征吸收峰型變窄變小，胞外多糖的添加使得水稻葉片恢復(fù)了原來的吸收峰型，同時，胞外多糖的添加提高了水稻葉片各特征吸收峰的峰值。在40 mg·L-1Cd脅迫下添加胞外多糖使得水稻葉片在3 325～3 425、2 916～2 930、1 638～1 660、1 383～1 406 cm-1和1 036～1 065 cm-1處的紅外吸收峰值上升，且隨著多糖濃度升高而提高。由此可知胞外多糖提高了Cd脅迫下水稻葉片中碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂類和羧酸鹽的含量。

3 討論

Cd作為一種非氧化還原性重金屬，對植物有較強的毒害作用。Cd被植物吸收后，會誘導(dǎo)植物產(chǎn)生自由基，進而引起植物組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)[23]。同時，Cd會與植物體內(nèi)酶的活性中心或蛋白巰基結(jié)合，取代蛋白反應(yīng)中心的Ca2+、Mg2+、Mn2+等金屬離子，抑制植物體內(nèi)酶活性，繼而抑制植物生長[24]。此外，Cd還具有導(dǎo)致植物黃化、加速植物衰老等多種效應(yīng)[25]，是一種對植物生長影響極大的重金屬。因此長期以來，如何降低Cd脅迫條件下農(nóng)作物的生長特性，緩解Cd元素帶來的毒害效應(yīng)，一直是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域研究的熱點問題。

糖是一種類似于植物激素的信號分子，可以調(diào)節(jié)植物的營養(yǎng)傳輸、下胚軸伸長、子葉綠化和芽的發(fā)育[26]，在植物的生長發(fā)育和逆境響應(yīng)中有著重要的作用[27]。León等[28]認為葡萄糖的添加會影響擬南芥的生長發(fā)育，而這種影響與植物應(yīng)激激素乙烯與脫落酸合成之間存在緊密的聯(lián)系；潘麗芹等[29]報道低濃度的殼聚糖對鹽脅迫白三葉種子的萌發(fā)與生長有一定的促進作用，但當(dāng)殼聚糖濃度高于100 mg·L-1時，殼聚糖對白三葉種子的根與芽的發(fā)育均有明顯的抑制作用；向達兵等[30]研究了內(nèi)生真菌（Bionectria pityrodes）多糖浸種對苦蕎種子萌發(fā)的影響，結(jié)果表明當(dāng)所用內(nèi)生真菌多糖濃度為100 mg·kg-1時，對苦蕎株高有明顯的促進效果，但當(dāng)多糖濃度繼續(xù)升高時，其促進效果顯著下降，而當(dāng)濃度上升到800 mg·kg-1時，真菌多糖浸種處理有明顯的抑制效果。本課題組前期對這一問題也進行了類似的研究，張文平等[11]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌胞外多糖（20～2 000 mg·L-1）對水稻種子根的生長有促進作用，且隨著胞外多糖濃度的升高而增強，但對水稻種子芽的生長無顯著影響；趙澤文等[14]研究發(fā)現(xiàn)外源添加茶樹菇菌糠多糖（1～2 000 mg·L-1）可以緩解銅離子脅迫對水稻種子萌發(fā)的毒害作用，且外源添加茶樹菇菌糠多糖促進了水稻種子根的生長，但對水稻種子芽的生長無顯著影響。綜合上述研究結(jié)果，多糖對植物發(fā)育的影響是一個非常復(fù)雜的過程，并沒有體現(xiàn)出明顯的規(guī)律性，但在一定濃度范圍內(nèi)，多糖類物質(zhì)對植物的根部發(fā)育均具有顯著的促進作用，而對芽的發(fā)育影響則有不同的效應(yīng)，這種差異是否與植物或多糖種類的不同有關(guān)尚有待進一步研究。本研究中，在500～1 000 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，胞外多糖的添加對水稻種子的發(fā)芽勢與發(fā)芽率存在一定的促進作用，同時對根的生長發(fā)育促進尤為顯著，種子內(nèi)可溶性蛋白的含量也隨著多糖的加入而顯著上升。但是，多糖的添加對水稻種子芽的生長發(fā)育存在顯著的抑制效應(yīng)，水稻種子中可溶性糖的含量也顯著下降。我們推測在水稻種子的萌發(fā)階段，屎腸球菌胞外多糖可以調(diào)節(jié)水稻體內(nèi)的蛋白與糖代謝通路以應(yīng)對外界的Cd脅迫，而芽的生長抑制可能也與多糖調(diào)節(jié)了作物體內(nèi)的代謝流分布有關(guān)，即多糖的存在使得更多的物質(zhì)與能量流向植物的地下部分，從而使得地上部分的發(fā)育受到一定的抑制，但這一假設(shè)需要更進一步的研究來證實。但在幼苗生長階段，我們沒有觀察到胞外多糖對葉長與株高等地上部形態(tài)指標(biāo)的抑制，同時屎腸球菌胞外多糖對水稻幼苗根系生長依舊存在一定促進作用。這可能是種子萌發(fā)時期相對于其他時期更容易受到外界因素影響所導(dǎo)致的。

表4屎腸球菌胞外多糖對Cd脅迫下水稻幼苗光合色素含量的影響Table 4 Effect of exopolysaccharides from Enterococcusfaecalis on the morphological index of rice seedlings under cadmium stress

圖6添加胞外多糖時鎘脅迫下水稻幼苗葉片紅外吸收圖譜Figure 6 Infrared absorption spectrum of rice seedling leavesunder Cd stress with exopolysaccharides from Enterococcusfaecalis

脅迫條件下，植物會通過對抗氧化系統(tǒng)的調(diào)節(jié)來應(yīng)對外界的傷害。類黃酮[31]、花色苷素[32]、可溶性蛋白等代謝物質(zhì)及過氧化物酶系等物質(zhì)的大量合成，可以幫助植物抵御外界損傷，清除植物體內(nèi)自由基，緩解重金屬的毒害作用[33]。其中，可溶性蛋白是植物體重要的營養(yǎng)物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在外界脅迫下植物體會合成更多的可溶性蛋白，這些蛋白一方面是抗氧化酶系的重要組成部分，通過催化氧化應(yīng)激反應(yīng)來抵御Cd的毒害；同時部分蛋白還可以直接通過螯合Cd來降低Cd的危害[34]。本試驗表明環(huán)境中Cd濃度的升高會提高水稻幼苗體內(nèi)POD的活力與MDA的含量，但同時抑制了SOD和CAT的活力，而屎腸球菌胞外多糖的添加對水稻幼苗體內(nèi)抗氧化酶活力影響不一，其中對POD與SOD的促進效果較為顯著。添加屎腸球菌胞外多糖明顯提高Cd脅迫下水稻幼苗體內(nèi)類黃酮與花色素苷的含量，可溶性蛋白的含量也顯著上升，MDA的含量顯著下降，這說明在Cd脅迫條件下，屎腸球菌胞外多糖可以促進水稻體內(nèi)抗逆性物質(zhì)的合成，降低有害物質(zhì)累積，從而有助于保護水稻免受Cd的毒害。

葉片是植物的主要器官之一，植物體90%左右的干物質(zhì)來源于葉片的光合作用[35]。同時，葉片在維持植物整體水分平衡時也起到了關(guān)鍵作用[36]。研究表明，Cd對植物地上部的毒害作用主要體現(xiàn)在對植物光合作用系統(tǒng)的破壞上[37]。本試驗表明，Cd脅迫顯著抑制了水稻葉片內(nèi)光合色素含量，胞外多糖的添加提高了水稻葉片葉綠素a、葉綠素b與類胡蘿卜素的含量，屎腸球菌胞外多糖通過將Cd固定在根部，減少了Cd向地上部的運輸，從而保護水稻體內(nèi)光合色素免受Cd的破壞，維持植物光合作用的正常運行，繼而緩解Cd脅迫對水稻葉片的毒害作用。張運紅等[38]發(fā)現(xiàn)外源添加海藻酸鈉寡糖顯著提高了Cd脅迫下水稻幼苗光合色素的含量，這與本研究結(jié)果相似。

傅里葉紅外光譜（FTIR）是一種基于化合物極性振動鍵與官能團的結(jié)構(gòu)分析技術(shù)，其可以表征糖類、蛋白質(zhì)等大分子的結(jié)構(gòu)特性[39]。目前國內(nèi)學(xué)者已經(jīng)開始應(yīng)用FTIR技術(shù)研究植物對重金屬的抗性機制[40]。余順慧等[21]利用FTIR研究了香根草對Cd脅迫的生理響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)Cd脅迫抑制了香根草葉片中蛋白質(zhì)與碳水化合物的合成，降低了水稻葉片中羧酸鹽類物質(zhì)的積累，繼而抑制了香根草的生長。本研究發(fā)現(xiàn)，Cd脅迫使得水稻葉片的紅外特征吸收峰峰型變小變窄，這表明Cd脅迫降低了水稻葉片內(nèi)各種基礎(chǔ)物質(zhì)的含量，破壞了水稻葉片細胞的正常生理功能，添加屎腸球菌胞外多糖使得Cd脅迫下水稻葉片在3 325～3 425、2 916～2 930 cm-1處的峰值上升，這說明胞外多糖促進了Cd脅迫下水稻葉片纖維素、半纖維素等碳水化合物的分泌與合成；水稻葉片1 638～1 660 cm-1處的峰值提升，表明胞外多糖促進了Cd脅迫下水稻葉片多肽、蛋白質(zhì)的合成；水稻葉片1 383～1 406 cm-1處峰值的提升，表明胞外多糖的添加提高了水稻葉片脂類物質(zhì)的含量，保護了水稻葉片細胞膜的完整性，這與MDA的測定結(jié)果相符；而水稻葉片1 036～1 065 cm-1處峰值的升高，表明胞外多糖促進了水稻葉片羧酸鹽類物質(zhì)的含量，羧酸鹽類物質(zhì)可以通過與Cd的螯合來降低Cd的毒性，這說明胞外多糖可能通過促進水稻葉片羧酸鹽的累積從而緩解Cd對水稻的毒害。綜上所述，添加胞外多糖促進了水稻幼苗葉片碳水化合物、蛋白質(zhì)和多肽類物質(zhì)的合成，以及羧酸鹽的累積。結(jié)合他人的研究結(jié)果推測胞外多糖可以通過加強滲透作用來提高水稻葉片對Cd的耐受性，從而緩解Cd脅迫對水稻幼苗的毒害作用。

4 結(jié)論

（1）添加屎腸球菌胞外多糖可以緩解Cd脅迫對水稻種子萌發(fā)的毒害作用，提高水稻種子萌發(fā)的發(fā)芽勢、發(fā)芽率以及根的發(fā)育，但水稻幼芽的生長會隨著多糖的加入而受到一定程度的抑制，這種抑制效應(yīng)在水稻幼苗生長后期消失。

（2）屎腸球菌胞外多糖促進了Cd脅迫下水稻幼苗的生長，降低了水稻體內(nèi)膜脂過氧化程度，提高了水稻葉片內(nèi)光合色素、類黃酮和羧酸鹽類物質(zhì)的含量，說明胞外多糖的添加可以通過促進抗逆物質(zhì)的合成來保護水稻免受Cd的毒害。

（3）Cd可以通過破壞水稻葉片內(nèi)物質(zhì)的合成與運輸來抑制水稻的生長，屎腸球菌胞外多糖可以將更多的Cd固定在水稻根部，降低Cd向地上部的運輸，繼而緩解與保護水稻免受Cd的毒害。此外，F(xiàn)TIR分析表明，屎腸球菌胞外多糖可以促進水稻葉片內(nèi)碳水化合物、蛋白質(zhì)和多肽類物質(zhì)的合成以及羧酸鹽的積累，并加強滲透作用提高水稻對Cd的耐受性。