常相娜，陳雪峰，龔 頻，楊文娟，王 蘭，袁 霞，劉 寧

（陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021）

發(fā)菜（Nostocflagelliforme）又名發(fā)狀念珠藻，是一種陸生經(jīng)濟(jì)藍(lán)藻[1]，發(fā)菜的營養(yǎng)價值很高，富含碳水化合物和蛋白質(zhì)[2-3]。食用發(fā)菜對佝僂病、高血壓、產(chǎn)后血虧等疾病有改善作用，發(fā)菜還能通便利尿、清熱解毒、愈合傷口及降低血脂與膽固醇含量[4-6]。發(fā)菜可以在逆境（低溫、少水、高鹽等）下生存，因?yàn)榘l(fā)菜在生長代謝過程中分泌到細(xì)胞外的長鏈多糖，即發(fā)菜胞外多糖（extracellular polysaccharide，EPS）一方面作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)發(fā)揮作用；另一方面會在細(xì)胞表面形成保護(hù)膜，保護(hù)機(jī)體蛋白質(zhì)不失活。陳雪峰等[7]研究發(fā)現(xiàn)處于0.3 mol/L NaCl脅迫環(huán)境時，EPS的分泌量較常規(guī)非鹽脅迫培養(yǎng)細(xì)胞增加50.3%，且EPS的結(jié)構(gòu)與部分理化性質(zhì)也發(fā)生了改變[8]，說明EPS是應(yīng)激性的代謝產(chǎn)物，可抵抗逆境脅迫。

賈士儒[9]與Kanekiyo[10-11]等對常規(guī)培養(yǎng)發(fā)菜產(chǎn)生EPS的活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明無鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖具有抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等活性。范華等[12]研究了鹽脅迫培養(yǎng)產(chǎn)生的發(fā)菜EPS的抗腫瘤活性及免疫活性，結(jié)果表明鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖比無鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖具有更好的抗腫瘤及免疫活性。陳雪峰等[7]報(bào)道了在BG-110（無氮）培養(yǎng)液、光照強(qiáng)度60 μmol/（m2·s）、NaCl濃度0.3 mol/L、連續(xù)培養(yǎng)6 d條件下獲得的鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖具有抗氧化性。氧化應(yīng)激與炎癥、高脂血癥的發(fā)生密切相關(guān)[13]，抗氧劑則能夠改善上述癥狀。陳雪峰等[7]的研究已證實(shí)鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖的抗氧化性，推測發(fā)菜清熱解毒、降低血脂的功效與此有關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步研究其他培養(yǎng)條件下鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖抗氧化與抗炎鎮(zhèn)痛活性。以BG-11（含氮）培養(yǎng)液、光照強(qiáng)度30 μmol/（m2·s）、NaCl濃度0.3 mol/L、連續(xù)培養(yǎng)15 d條件下獲得的鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖為研究對象，采用溫浴甩尾法及急性炎癥模型對發(fā)菜EPS的鎮(zhèn)痛抗炎作用進(jìn)行初步研究，并結(jié)合研究發(fā)菜EPS體外的抗氧化作用，旨在為進(jìn)一步開發(fā)利用發(fā)菜EPS提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

清潔級雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，使用許可證號：SYXK2012（陜）2012-006，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。

發(fā)菜細(xì)胞 陜西科技大學(xué)微生物制造研究室；二甲苯、冰醋酸（分析純） 上海國藥集團(tuán)；生理鹽水濟(jì)寧辰欣藥業(yè)股份有限公司；阿司匹林 石家莊石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司；醋酸地塞米松 河南國藥集團(tuán)容生制藥有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）（分析純） 美國Sigma公司；VC（分析純） 天津市天力化學(xué)試劑公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S-CW型電子天平 德國Sartorius公司；UV-1100型紫外-可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；KW-1000D型數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海梅香儀器有限公司；MGC-400HP光照培養(yǎng)箱 上海善志儀器設(shè)備有限公司；SW-CJ-1D超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；H-1850R高速低溫離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)菜EPS的制備

將離心收集的對數(shù)期發(fā)菜細(xì)胞接種于含0.3 mol/L NaCl的BG-11培養(yǎng)液中，對照組不含NaCl。將細(xì)胞懸浮液置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照強(qiáng)度30 μmol/（m2·s），光暗比12∶12（8∶00～20∶00光環(huán)境，20∶00～次日8∶00暗環(huán)境），白天溫度25 ℃，夜晚溫度10 ℃，連續(xù)培養(yǎng)15 d。參照陳雪峰等[14]的研究方法，過濾分離發(fā)菜培養(yǎng)液，Sevag法去除蛋白后收集培養(yǎng)液并濃縮，4 ℃醇沉，靜置24 h后經(jīng)離心分離發(fā)菜EPS，并裝入透析袋，透析48 h去除小分子物質(zhì)，冷凍干燥得發(fā)菜EPS。

1.3.2 發(fā)菜EPS體外抗氧化作用測定

1.3.2.1 羥自由基清除能力測定

準(zhǔn)確吸取不同質(zhì)量濃度的無鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖與鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖樣品溶液1.0 mL，4.5 mmol/L FeSO41 mL，4.5 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL，混勻后加入4.4 mmol/L H2O21 mL啟動Fenton反應(yīng)，以VC為對照，37 ℃水浴30 min后8 000 r/min離心3 min，于510 nm波長處測定吸光度[15]。羥自由基清除率按公式（1）計(jì)算。

式中：As為樣品吸光度；As0為樣品本底吸光度；A0為空白對照吸光度。

式中：ΔA0為鄰苯三酚自氧化速率的吸光度；ΔA為加入樣品后鄰苯三酚的自氧化速率的吸光度。

1.3.2.3 DPPH自由基清除能力測定

參照陳雪峰等[17]方法并加以改進(jìn)。準(zhǔn)確吸取不同質(zhì)量濃度無鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖與鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖樣品溶液1.0 mL，加入0.03 mg/mL DPPH溶液4.5 mL，搖勻，37 ℃水浴30 min后，在517 nm波長處測定吸光度。以VC為對照。DPPH自由基清除率按公式（3）計(jì)算。

式中：As為樣品吸光度；As0為樣品本底吸光度；A0為空白對照吸光度。

1.3.3 小鼠溫浴甩尾法鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)

將小鼠尾尖部（＜3 cm）浸入（50±0.5）℃的恒溫水浴中，記錄小鼠尾部自被放入水中起至出現(xiàn)甩尾的時間/s，此時間記為小鼠的基礎(chǔ)痛閾值。經(jīng)預(yù)選確定基礎(chǔ)痛閾在2～10 s的小鼠進(jìn)行溫浴甩尾實(shí)驗(yàn)。合格小鼠96 只，隨機(jī)分成12 組，每組8 只。采用皮下注射和腹腔注射兩種方式給小鼠注射發(fā)菜EPS?？瞻讓φ战M注射0.9%的生理鹽水，陽性對照組為阿司匹林（30 mg/kgmb），再取4 組分別注射不同劑量發(fā)菜EPS（無鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖組：30 mg/kgmb；鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖組：低、中、高劑量分別為3、10、30 mg/kgmb）。每組小鼠在注射發(fā)菜EPS前（0 min）測定小鼠的基礎(chǔ)痛閾值。在注射發(fā)菜EPS后每隔10 min測量一次小鼠的痛閾值，記錄小鼠1 h內(nèi)的痛閾值的變化，在測定過程中，痛閾值超過60 s按60 s計(jì)算[18]。

1.3.4 二甲苯致小鼠耳廓腫脹抗炎實(shí)驗(yàn)

取雄性昆明小鼠60 只，隨機(jī)分成6 組，每組10 只，分別為生理鹽水空白對照組、地塞米松陽性對照組（3 mg/kgmb）與不同劑量發(fā)菜EPS組（無鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖組：30 mg/kgmb；鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖組：低、中、高劑量分別為3、10、30 mg/kgmb）。各組每天上午10時腹腔注射發(fā)菜EPS一次（0.1 mL/10 gmb），連續(xù)5 d。末次注射發(fā)菜EPS前30 min，于每只小鼠左耳正反兩面涂二甲苯30 μL，右耳為對照。致炎4 h后將小鼠頸部脫臼處死，沿耳廓剪下左、右兩耳，以8 mm打孔器在兩耳相同部位打下圓耳片，稱質(zhì)量，按公式（4）、（5）分別計(jì)算耳腫脹度和腫脹抑制率[19-20]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，使用ANOVA程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)菜EPS體外抗氧化作用結(jié)果

2.1.1 羥自由基清除能力

圖 1 發(fā)菜EPS羥自由基清除能力Fig. 1 Scavenging capacity of Nostoc flagelliforme extracellular polysaccharide on ·OH radical

如圖1所示，無鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖與鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖均表現(xiàn)出對羥自由基的清除能力。與對照組相比，當(dāng)發(fā)菜EPS質(zhì)量濃度低于0.4 mg/mL時，羥自由基的清除能力從高到低為鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖＞無鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖＞對照組；當(dāng)發(fā)菜EPS質(zhì)量濃度為1～2 mg/mL時，羥自由基清除能力從高到低為對照組＞鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖＞無鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖?？傮w來看，鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖的羥自由基清除能力優(yōu)于無鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖。當(dāng)發(fā)菜EPS質(zhì)量濃度達(dá)到0.8 mg/mL時，鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖組的羥自由基清除率達(dá)到51.81%，此質(zhì)量濃度下無鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖組的羥自由基清除率為42.40%。伴隨發(fā)菜EPS質(zhì)量濃度增大羥自由基的清除能力也逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)出較為明顯的量效關(guān)系，但增幅逐漸減小。

圖 2 發(fā)菜EPS的·清除能力Fig. 2 Scavenging capacity of Nostoc flagelliforme extracellular polysaccharide on · radical

2.1.3 DPPH自由基清除能力

圖3所示為鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖與無鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖的DPPH自由基清除能力結(jié)果。相比于對照組，在測定質(zhì)量濃度范圍下，DPPH自由基清除能力從高到低為對照組＞鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖＞無鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖?？傮w來看，鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖與無鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖對DPPH自由基清除能力低于對羥自由基與·。當(dāng)發(fā)菜EPS質(zhì)量濃度達(dá)到2 mg/mL時，鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖與無鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖的DPPH自由基清除能力分別為41.97%和36.46%，鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖對DPPH自由基的清除能力優(yōu)于無鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖，且在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，DPPH自由基清除能力與發(fā)菜EPS質(zhì)量濃度呈現(xiàn)正相關(guān)。

圖 3 發(fā)菜EPS DPPH自由基清除能力Fig. 3 Scavenging capacity of Nostoc flagelliforme extracellular polysaccharide on DPPH radical

2.2 不同注射方式下發(fā)菜EPS的鎮(zhèn)痛作用

通過溫浴甩尾法評價EPS的鎮(zhèn)痛作用。0 min時各組小鼠痛閾值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由圖4可知，皮下注射發(fā)菜EPS后，除生理鹽水組外，皮下注射鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖與無鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖均有鎮(zhèn)痛效果（圖4A），各組小鼠在20、30、40 min時痛閾值均延長，表明發(fā)菜EPS具有顯著的鎮(zhèn)痛作用（P＜0.05）；由圖4B可知，皮下注射發(fā)菜EPS在30 min時所有劑量都表現(xiàn)出極顯著的鎮(zhèn)痛效果（P＜0.01）。伴隨發(fā)菜EPS在小鼠體內(nèi)代謝，注射發(fā)菜EPS 50、60 min時，鎮(zhèn)痛作用不再顯著。注射相同質(zhì)量濃度的發(fā)菜EPS溶液，鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖鎮(zhèn)痛效果比無鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖更好（圖4A）。由圖4B可知，鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖低、中、高劑量痛閾值分別為4.92、5.04、4.99 s，結(jié)果表明皮下注射鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖10 mg/kgmb發(fā)菜EPS溶液可顯著延長溫浴導(dǎo)致的小鼠甩尾反應(yīng)時間，使痛閾值達(dá)到最大。圖5所示的腹腔注射發(fā)菜EPS鎮(zhèn)痛效果與皮下注射具有相類似規(guī)律，注射相同質(zhì)量濃度的發(fā)菜EPS溶液，鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖鎮(zhèn)痛效果比無鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖更好（圖5A）；圖5B則表明不同劑量的鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖相比較，低、中、高劑量最高痛閾值分別為5.12、5.42、5.17 s，中劑量10 mg/kgmb發(fā)菜EPS溶液效果最好。

圖 4 皮下注射發(fā)菜EPS對小鼠溫浴甩尾痛閾值的影響（n ＝8）Fig. 4 Analgesic effect of subcutaneous administration of Nostoc flagelliforme extracellular polysaccharide (n = 8)

圖 5 腹腔注射發(fā)菜EPS對小鼠溫浴甩尾痛閾值的影響（n ＝8）Fig. 5 Analgesic effect of intraperitoneal administration of Nostoc flagelliforme extracellular polysaccharide (n = 8)

結(jié)合圖4與圖5，比較皮下注射和腹腔注射兩種發(fā)菜EPS注射方式，相較于阿司匹林組，腹腔注射發(fā)菜EPS鎮(zhèn)痛效果優(yōu)于皮下注射的鎮(zhèn)痛效果。皮下注射發(fā)菜EPS后，在30 min時所有劑量都表現(xiàn)出極顯著鎮(zhèn)痛效果，具有顯著鎮(zhèn)痛效果的時間區(qū)間為30～40 min，說明注射發(fā)菜EPS后，鎮(zhèn)痛效果逐步發(fā)揮，30 min時藥效最好。隨著時間延長，發(fā)菜EPS在體內(nèi)代謝，鎮(zhèn)痛作用減弱。腹腔注射發(fā)菜EPS后，不同劑量的鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖溶液均可延長小鼠溫浴甩尾的時間，20 min時所有劑量都表現(xiàn)出顯著鎮(zhèn)痛效果（P＜0.05），鎮(zhèn)痛效果發(fā)揮的主體時間為20～30 min。

2.3 發(fā)菜EPS的抗炎作用

圖 6 發(fā)菜EPS對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響（n ＝10）Fig. 6 Inhibitory effect of Nostoc flagelliforme extracellular polysaccharide on dimethylbenzene-induced mouse ear edema (n = 10)

如圖6A所示，相較于空白對照組，無鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖組及鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖組均能極顯著抑制二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹（P＜0.01），其中鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖腫脹抑制率（43.11%）高于無鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖的腫脹抑制率（32.88%），說明抑制二甲苯致小鼠耳廓腫脹方面，鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖優(yōu)于無鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖。圖6B表明低劑量組可以顯著抑制二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹（P＜0.05），中劑量組與高劑量組均能極顯著抑制二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹（P＜0.01），且鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖抗炎效果與劑量呈正相關(guān)，當(dāng)鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖劑量為30 mg/kgmb時，腫脹抑制率最高為43.11%。

3 討 論

發(fā)菜藻細(xì)胞在逆境脅迫條件下，形態(tài)、功能及抗逆活性物質(zhì)等都會產(chǎn)生相應(yīng)變化[21-23]。前期研究已經(jīng)證實(shí)，鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖與無鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖相比，結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)發(fā)生了一定變化，進(jìn)而可能導(dǎo)致功能活性發(fā)生改變，但具體發(fā)菜EPS的功能活性變化則有待進(jìn)一步明確。

本實(shí)驗(yàn)采用體外自由基清除能力實(shí)驗(yàn)評價鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖的抗氧化性能，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：相比于無鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖，鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖對羥自由基、·、DPPH自由基3 種不同類型自由基的清除能力均有所提高。自由基具有高氧化活性，化學(xué)性質(zhì)非?；钴S，被認(rèn)為是導(dǎo)致機(jī)體各類損傷的根本原因。鹽脅迫條件下發(fā)菜產(chǎn)生的EPS是一種應(yīng)激性的代謝產(chǎn)物，合成受到逆境的影響，使得EPS的單糖組成發(fā)生改變。相較于無鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖，鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖中甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸及半乳糖的含量明顯提高，無鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖的糖醛酸含量為6.37%，而鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖為7.39%[8]，而糖醛酸被認(rèn)為會增強(qiáng)酸性多糖的自由基清除活性，這一點(diǎn)在石斛多糖[24]、茶葉多糖[25]、金絲小棗多糖[26]及玉米須多糖[27]等多種多糖的體外抗氧化活性研究中都得到了證實(shí)。因此，鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖具有更為突出的自由基清除能力，可能與其糖醛酸結(jié)構(gòu)含量上升相關(guān)。然而，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，除單糖組成外，單糖聯(lián)動位置、多糖的三維結(jié)構(gòu)都可能與多糖的抗氧化性有關(guān)[28]，因此，是否還有其他結(jié)構(gòu)特征與鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖的抗氧化活性相關(guān)仍需進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)通過溫浴甩尾實(shí)驗(yàn)探討發(fā)菜EPS的抗炎鎮(zhèn)痛活性。鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，發(fā)菜EPS能明顯延長溫浴甩尾的時間，其中鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖鎮(zhèn)痛效果優(yōu)于無鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖，且腹腔注射（20 min）相較于皮下注射（30 min）起效速度快，鎮(zhèn)痛效果更顯著，產(chǎn)生上述差異的主要原因可能是兩種發(fā)菜EPS注射方式的代謝動力學(xué)差異。腹腔注射主要為腹膜吸收，腹膜的面積大且密布血管和淋巴管，因此腹膜有很強(qiáng)的吸收能力，每小時可吸收動物體質(zhì)量3%～8%的液體，而皮下注射是經(jīng)皮下結(jié)締組織間的毛細(xì)血管、淋巴管吸收進(jìn)入血液循環(huán)[29]，所以腹腔注射發(fā)菜EPS吸收速率和吸收量都優(yōu)于皮下注射，這一結(jié)果與文獻(xiàn)[29-30]報(bào)道的趨勢一致。

二甲苯致小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，發(fā)菜EPS能明顯抑制二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹。相比于無鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖，鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖有更好的抗炎效果，且鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖的抗炎作用呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。炎癥是機(jī)體對損傷刺激所發(fā)生的防御反應(yīng)，疼痛是機(jī)體受到傷害性刺激后所產(chǎn)生的一類保護(hù)性反應(yīng)，疼痛與炎癥常同時發(fā)生，兩者都是臨床中常見問題。同時，自由基損傷是炎癥病理損傷的一個重要組成部分。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖具有良好的體外抗氧化活性，同時也具有體內(nèi)鎮(zhèn)痛抗炎活性，但幾種活性之間的關(guān)聯(lián)性及鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖在體內(nèi)發(fā)揮活性的作用機(jī)理還有待深入研究。

本實(shí)驗(yàn)采用體外自由基清除能力實(shí)驗(yàn)評價鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖的抗氧化性能，并通過溫浴甩尾和二甲苯致炎實(shí)驗(yàn)研究發(fā)菜EPS的抗炎鎮(zhèn)痛活性，結(jié)果表明相較于無鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖，鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖具有更好的體外抗氧化與抗炎鎮(zhèn)痛活性。為發(fā)菜EPS進(jìn)一步作為功能性食品和多糖藥品等高附加值產(chǎn)品的加工開發(fā)提供了數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。