常新會*，司海超，徐宏超

（1南陽市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，南陽 473000；2南陽市中心醫(yī)院麻醉科，南陽 473000）

缺血性中風(fēng)（ischemic stroke，IS）是全世界范圍內(nèi)的第三大致死原因，也是第一大致殘原因[1]。IS的原因是腦血流受阻造成的局部腦組織凋亡和壞死，并繼發(fā)神經(jīng)元退行性變[2]。為防止中風(fēng)后的腦梗死體積的繼續(xù)擴大，應(yīng)盡快恢復(fù)腦血流，但腦缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）依然會造成繼發(fā)性神經(jīng)炎癥以及神經(jīng)元退變和凋亡[3]。另外，I/R造成的神經(jīng)元二次損傷也是影響IS患者認知、學(xué)習(xí)、運動和記憶功能轉(zhuǎn)歸不良的主要因素[4]。其中，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元是與認知、學(xué)習(xí)、運動和記憶功能有關(guān)，但其對腦缺氧缺血尤為敏感，I/R極易造成其繼發(fā)性損傷[5]。因此，控制I/R后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元繼發(fā)性損傷對IS患者轉(zhuǎn)歸和預(yù)后尤為重要。

星狀神經(jīng)節(jié)阻滯（stellate ganglion block，SGB）是一種交感神經(jīng)阻滯，是治療面部、頸部和上肢的血管功能不全和疼痛綜合征的常用方法[6,7]。先前的研究[6-8]表明，SGB不僅能增強缺血區(qū)的血流供應(yīng)還能抑制缺血部位中白介素6（interleukin 6，IL-6）、白介素1β（interleukin 1β，IL‐1β）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF‐α）TNF‐α等促炎細胞因子的合成和分泌。然而，SGB是否可以降低由I/R引起的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元繼發(fā)性損傷仍不清楚。因此，本研究通過大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型來模擬腦I/R損傷，并給予SGB干預(yù)，以期觀察SGB對腦I/R大鼠神經(jīng)炎癥、繼發(fā)性神經(jīng)元損傷以及神經(jīng)功能恢復(fù)的影響，并探討其分子機制。

材料與方法

1 實驗動物與試劑

24只SPF級7~8周齡雄性SD大鼠（290~310 g）購自河南省實驗動物中心[SCXK（豫）2017－0001]；Nissl染色試劑盒、組織蛋白提取試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；Fluro-Jade B（FJB）染色試劑盒（武漢艾美捷科技有限公司）；大鼠TNF‐α、IL‐1β和IL-10 ELISA試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司）；免疫組織化學(xué)試劑盒（北京中山金橋生物技術(shù)有限公司）；HRP標記的羊抗小鼠IgG（H+L）二抗（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、α‐tubulin小鼠單克隆IgG1抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；神經(jīng)特異核蛋白（neuron‐specific nuclear protein，NeuN）和離子鈣接頭蛋白分子1（ionized calcium-binding adaptor molecule 1，IBA-1）兔單克隆IgG1抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；核因子κB（nuclear factor κB，NF‐κB）p65、p-p65、NF‐κB抑 制 蛋 白α（inhibitor α of NF‐κB，IκBα）和p‐IκBα小鼠單克隆IgG1抗體（美國Santa Cruz公司）。

2 大鼠MCAO模型構(gòu)建、分組與處理

將所有大鼠飼養(yǎng)在條件可控[溫度：（23±2）℃；濕度：（55±5）%；光照：12 h/12 h光/暗循環(huán)]的屏障環(huán)境中，且其可自由飲食和飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，首先將大鼠隨機分為假手術(shù)（Sham）組（n=6）和MCAO手術(shù)組（n=18）。采用改良尼龍線栓法制作大鼠MCAO模型[9]：水合氯醛麻醉大鼠后，用直徑0.2 mm尼龍線結(jié)扎大腦中動脈，缺血2 h后，松開線栓以實現(xiàn)血液再灌注。Sham組大鼠除不予大腦中動脈結(jié)扎外，其余手術(shù)步驟同MCAO手術(shù)組。MCAO術(shù)后4 h，剔除未恢復(fù)意識或持續(xù)發(fā)生抽搐的大鼠，將15只造模成功的MCAO大鼠隨機分為I/R組（n=7）和I/R+SGB組（n=8）。其中，I/R+SGB組大鼠在MCAO術(shù)后1 d進行SGB術(shù)。SGB手術(shù)按照文獻[10,11]方法，腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥輕度麻醉大鼠，大鼠仰臥位固定，以C7棘突的軟骨突為標志，用4.5號針經(jīng)皮后入路穿刺至椎體，回吸無血液，注射0.2 mL 0.25%布比卡因行左側(cè)SGB。大鼠阻滯后5min內(nèi)左側(cè)出現(xiàn)上瞼下垂、眼裂變小和瞳孔縮小等Horner征代表SGB成功。

3 mNSS評分法、轉(zhuǎn)棒實驗和跑梯實驗評估大鼠的神經(jīng)功能

在MCAO術(shù)后7 d，用改良神經(jīng)損傷嚴重程度評分（modified neurological severity score，mNSS）量表評估各組大鼠神經(jīng)功能缺損情況；神經(jīng)功能評分為0 ~ 18分，0分代表未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)損傷癥狀，評分越高代表神經(jīng)功能缺損越嚴重，18分代表持續(xù)性昏迷或死亡。

按照文獻[12]方法用轉(zhuǎn)棒實驗和跑梯實驗評估大鼠的運動功能。轉(zhuǎn)棒實驗：大鼠先在轉(zhuǎn)棒儀上進行適應(yīng)性訓(xùn)練（5轉(zhuǎn)/min、正向旋轉(zhuǎn)），待大鼠在此轉(zhuǎn)速下能保持平衡后，逐漸以恒定加速度增加轉(zhuǎn)速（程序設(shè)置：轉(zhuǎn)速5~35轉(zhuǎn)/min、時間5 min），直至大鼠掉落，記錄大鼠在轉(zhuǎn)棒停留時間。跑梯實驗：大鼠先在690 mm（長）×65 mm（寬）×150 mm（高）的爬梯箱中進行適應(yīng)性訓(xùn)練，使大鼠能穿越水平梯子；然后調(diào)整水平梯子橫撐的間距（間距不等，且與訓(xùn)練梯子間距變化不同），使大鼠自發(fā)從開始處沿梯子爬行至終點，并在側(cè)腹面放置攝像頭記錄大鼠爬行完成程度和爪滑落和踏空情況，分析對側(cè)左前肢相對于右肢的總失步數(shù)。

4 Nissl、FJB和NeuN染色法評估海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病理形態(tài)

在行為學(xué)實驗結(jié)束之后，麻醉大鼠并處死，按文獻[5]方法分離海馬CA1區(qū)腦組織。按照常規(guī)法將海馬CA1區(qū)腦組織立即用中性福爾馬林固定24 h，然后常規(guī)脫水并用石蠟包埋。然后，分別進行Nissl染色、FJB染色和NeuN免疫組織化學(xué)染色。

Nissl染色：將石蠟包埋的海馬CA1區(qū)腦組織切為5 μm厚切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟和水化后，將切片至于0.1%焦油紫染液中，并在60 ℃下浸泡2 h，蒸餾水沖洗1 min，70%酒精分化25 s，顯微鏡（×20物鏡）下觀察并對尼氏體計數(shù)。

FJB染色：將石蠟包埋的海馬CA1區(qū)腦組織切為20 μm厚切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟和水化后，將切片依次至于100%和70%乙醇中各浸泡5 min，蒸餾水沖洗1 min，再至于0.06%高錳酸鉀溶液中孵育10 min，蒸餾水沖洗2 min，在室溫避光條件下至于0.01%FJB溶液中孵育30 min，蒸餾水再次沖洗后，熒光顯微鏡（×20物鏡）下觀察并對FJB陽性細胞計數(shù)。

NeuN免疫組織化學(xué)染色：將石蠟包埋的海馬CA1區(qū)腦組織切為5 μm厚切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化、阻斷過氧化氫酶（3%雙氧水孵育10 min）、抗原修復(fù)（0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液加熱煮沸5 min）和封閉（5%山羊血清孵育30 min）后，滴加NeuN抗體（1∶200稀釋）37 ℃孵育1.5 h，PBS洗滌3 min×2次，滴加Bio-羊抗兔IgG 濃縮液（1∶100稀釋）37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3 min×3次，滴加鏈酶親和素-POD濃縮液（1∶100稀釋）37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3 min×4次，用DAB顯色，在顯微鏡（×20物鏡）下觀察并對NeuN陽性細胞計數(shù)。

5 IBA-1免疫組織化學(xué)染色評估海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細胞活化情況

除用IBA-1抗體（1∶100稀釋）外，IBA-1免疫組織化學(xué)染色步驟同NeuN免疫組織化學(xué)染色，DAB顯色后，用蘇木素染核，顯微鏡（×20物鏡）下觀察小膠質(zhì)細胞活化情況，并用積分光密度值（IOD）對每視野下IBA-1染色的小膠質(zhì)細胞定量。

6 ELISA法檢測海馬CA1區(qū)中TNF-α、IL-1β和IL-10水平

按照試劑盒操作步驟，用ELISA法分別對海馬CA1區(qū)腦組織中TNF‐α、IL‐1β和IL-10水平進行檢測。

7 Western blot法檢測海馬CA1腦組織中p65、pp65、IκBα和p-IκBα水平

用組織蛋白提取試劑盒提取海馬CA1區(qū)腦組織中的蛋白后，用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白定量，然后取等量蛋白煮沸變性后，用標準Western blot程序電泳和電轉(zhuǎn)。蛋白經(jīng)封閉后，4 ℃下孵育p65（1∶4000稀釋）、p-p65（1∶1000稀釋）、IκBα（1∶2000稀釋）、p‐IκBα（1∶800稀釋）和α‐tubulin（1∶5000稀釋）抗體過夜，次日TBST洗滌后，室溫孵育HRP標記的羊抗小鼠IgG（H+L）二抗1 h，TBST再次洗滌后，用ECL法發(fā)光顯像。用IPP 6.0軟件分析目的蛋白的IOD值。

8 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件進行處理。數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標準差（x±s），組間比較用單因素方差分析。P<0.05則認為具備統(tǒng)計學(xué)差異。

結(jié) 果

1 SGB抑制腦I/R大鼠神經(jīng)功能損傷

與Sham組比較，I/R組大鼠的mNSS評分、總失步數(shù)和轉(zhuǎn)棒停留時間均明顯增加，而在SGB處理后，mNSS評分、總失步數(shù)和轉(zhuǎn)棒停留時間的增加被明顯抑制（圖1）。

圖1 SGB處理對腦I/R大鼠神經(jīng)功能損傷的影響。A，mNSS積分統(tǒng)計學(xué)分析；B，總失步數(shù)統(tǒng)計學(xué)分析；C，轉(zhuǎn)棒停留時間統(tǒng)計學(xué)分析。與Sham組比較：#P<0.01；與I/R組比較：*P<0.05，**P<0.01；n=6～8Fig.1 Effect of SGB treatment on impairment of neural functions in cerebral I/R rats. A, statistical analysis of the mNSS scores; B, statistical analysis of missteps count; C, statistical analysis of the time spent on the rod. #P<0.01 as compared with Sham group; *P<0.05 and **P<0.01 as compared with I/R group; n=6-8

2 SGB抑制腦I/R大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元丟失與變性

尼氏染色顯示：Sham組海馬CA1區(qū)中尼氏體呈卵圓形且數(shù)量豐富、排列緊密、深染紫色，中間有藍色顆粒；I/R組海馬CA1區(qū)中部分尼氏體呈細塵狀，尼氏體數(shù)量少且排列松散、淺染、皺縮甚至消失、脫落和空泡化；I/R+SGB組海馬CA1區(qū)中尼氏體形態(tài)趨向正常，數(shù)量相對豐富，但存在部分皺縮和脫落現(xiàn)象（圖2A上）。NeuN免疫熒光染色顯示，Sham組海馬CA1區(qū)中NeuN陽性染色深、數(shù)量豐富且排列緊密；I/R組海馬CA1區(qū)中NeuN陽性染色淺、數(shù)量少且排列松散，存在脫落現(xiàn)象；I/R+SGB組海馬CA1區(qū)中NeuN陽性染色深、數(shù)量趨向正常且排列趨向緊密，但依然存在脫落現(xiàn)象（圖2A 中）。Fluro-Jade B染色顯示，Sham組海馬CA1區(qū)中僅少量細胞著色且染色淺；I/R組海馬CA1區(qū)中大量細胞染色且染色較深；I/R+SGB組海馬CA1區(qū)中染色細胞較I/R組明顯減少，染色相對變淺（圖2A下）。統(tǒng)計學(xué)分析顯示， I/R組大鼠海馬CA1區(qū)中尼氏體（圖2B）和NeuN染色細胞（圖2C）密度明顯降低，F(xiàn)luro-Jade B染色細胞（變性神經(jīng)元）（圖2D）明顯增多；而在SGB處理后，海馬CA1區(qū)中尼氏體（圖2B）和神經(jīng)元（圖2C）密度、變性神經(jīng)元（圖2D）的增加明顯被抑制。

圖2 SGB對腦I/R大鼠的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元丟失與變性的影響。A，代表性Nissl染色、NeuN免疫組織化學(xué)染色和FJB染色圖像；比例尺，50 μm。B—D，尼氏體密度（B）、NeuN陽性細胞密度（C）和FJB陽性細胞密度（D）統(tǒng)計學(xué)分析；與Sham組比較：#P<0.01；與I/R組比較，**P<0.01；n=6～8Fig. 2 Effect of SGB treatment on loss and degeneration of the neurons in the hippocampal CA1 region of the cerebral I/R rats.A, representative Nissl staining,NeuN immunohistochemical staining and FJB staining images;scale bar, 50 μm. B to D, statistical analysis of the Nissl body density(B), NeuN-positive cell density(C) and FJB-positive cell density(D); #P<0.01 as compared with Sham group; **P<0.01 as compared with I/R group; n=6-8

3 SGB抑制腦I/R大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)炎癥

免疫組織化學(xué)染色顯示，Sham組海馬CA1區(qū)中僅少量細胞呈IBA-1陽性染色；I/R組海馬CA1區(qū)中有大量IBA-1陽性細胞，且染色較Sham組中深；I/R+SGB組海馬CA1區(qū)中IBA-1陽性染色細胞較I/R組少且顏色較淺（圖3A）。統(tǒng)計分析顯示，與Sham組比較，I/R組大鼠海馬CA1區(qū)中IBA-1陽性細胞明顯增多，而在SGB處理后，海馬CA1區(qū)中IBA-1陽性細胞明顯減少（圖3B）。ELISA分析顯示，與Sham組比較，I/R組大鼠海馬CA1區(qū)中促炎因子TNF‐α和IL‐1β水平明顯增加，抑炎因子IL-10水平明顯降低；與I/R組比較，I/R+SGB組大鼠的海馬CA1區(qū)中TNF‐α和IL‐1β水平明顯降低，IL-10水平明顯增加（圖3C—E）。

圖3 SGB處理對腦I/R大鼠的海馬CA1神經(jīng)炎癥的影響。A，代表性的 IBA-1免疫組織化學(xué)染色圖像（比例尺，50 μm）；B，IBA-1陽性細胞密度的統(tǒng)計學(xué)分析。C—E，TNF‐α（C）、L‐1β（D）和IL-10（E）水平ELISA分析結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)分析。與Sham組比較：#P<0.01；與I/R組比較：**P<0.01；n=6~8Fig.3 Effect of SGB treatment on neuroinflammation in the hippocampal CA1 region of the cerebral I/R rats. A, representative IBA-1 immunohistochemistry staining images (scale bar, 50 μm); B, statistical analysis of IBA-1 immunoreactivity. C to E, statistical analysisof the levels of TNF‐α (C), L‐1β (D) and IL‐10(E) detected by ELISA. #P<0.01 as compared with Sham group; **P<0.01 as compared with I/R group; n=6-8

4 SGB處理抑制腦I/R大鼠海馬CA1區(qū)NF-κB信號活性增強

Western blot檢測顯示，與Sham組比較，I/R組大鼠海馬CA1區(qū)中p‐IκBα和p-p65水平明顯增加；而在SGB處理后，海馬CA1區(qū)中p‐IκBα和p-p65表達水平明顯降低。

圖4 SGB處理對腦I/R大鼠海馬CA1區(qū)NF‐κB信號活性的影響。A，p‐IκBα和p-p65水平的代表性Western blot檢測；B和C，p‐IκBα（B）和p-p65（C）水平的統(tǒng)計學(xué)分析；與Sham組比較：#P<0.01；與I/R組比較：**P<0.01；n=6~8Fig. 4 Effect of SGB treatment on NF‐κB signaling activity in the hippocampal CA1 region of the cerebral I/R rats. A, representative Western blot detection of the levels of p‐IκBα and p‐p65; B and C, statistical analysis of the levels of p‐IκBα (B) and p‐p65 (C); #P<0.01 as compared with sham group;**P<0.01 as compared with I/R group; n=6.

討 論

神經(jīng)功能障礙是中風(fēng)患者的常見癥狀。中風(fēng)后神經(jīng)功能的恢復(fù)程度不僅能影響卒中風(fēng)患者的預(yù)后和生活質(zhì)量，還能影響中風(fēng)后抑郁的發(fā)病風(fēng)險[13]。因此，探索加快中風(fēng)后神經(jīng)功能恢復(fù)的策略具有重要意義。本研究顯示，SGB處理能減輕腦I/R大鼠的神經(jīng)功能障礙，且能促進運動功能恢復(fù)，提示SGB是潛在的促進中風(fēng)后神經(jīng)功能恢復(fù)的策略。

神經(jīng)功能恢復(fù)的快慢與腦I/R后的神經(jīng)元變性死亡以及神經(jīng)炎癥相關(guān)。腦缺血再次恢復(fù)灌流后，殘存的神經(jīng)元會受到再灌注二次損傷以及后續(xù)由炎性信號、氧化應(yīng)激信號以及興奮性氨基酸信號等毒性信號因子引起繼發(fā)性損傷，并能導(dǎo)致認知、學(xué)習(xí)、運動和記憶等神經(jīng)功能進一步受損[4,14]。海馬CA1區(qū)神經(jīng)元與認知、學(xué)習(xí)、運動和記憶等神經(jīng)功能有關(guān)，且其易受到I/R的二次損傷和繼發(fā)性損傷信號的影響[5]。本研究結(jié)果顯示，SGB處理能降低I/R引起的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元變性、小膠質(zhì)細胞活化以及炎癥水平，提示其能降低I/R引起的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷和神經(jīng)炎癥。

本研究進一步對SGB后處理降低I/R引起的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷和神經(jīng)炎癥的機制進行了探索。據(jù)報道[15,16]，腦I/R能引起NF‐κB信號激活，且NF‐κB信號激活能進一步加劇海馬神經(jīng)元損傷和神經(jīng)炎癥。本研究評估了腦I/R大鼠海馬CA1區(qū)腦組織中p65和IκBα的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)腦I/R后海馬CA1區(qū)腦組織中p65和IκBα的磷酸化水平顯著升高，提示NF‐κB信號被激活；此外，SGB后處理能部分逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng)。這一結(jié)果揭示SGB后處理能通過抑制NF‐κB信號通路來減輕腦I/R大鼠海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元損傷和炎癥反應(yīng)。

綜上所述，SGB后處理能加快腦I/R大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)，且這一作用可能與其通過減弱NF‐κB信號活性來發(fā)揮減輕腦I/R大鼠海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元損傷和炎癥反應(yīng)有關(guān)。因此，這些結(jié)果揭示了SGB在腦I/R中的作用，其可作為缺血性中風(fēng)的一種潛在的治療手段。