董鉦浩，董文康，張淼，黃泳淇，黃倩雨，鄒焜，鐘詩雯，扶玉珍，暴凱敏，任翔*，孔慧*

（1大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，大連 116023；2大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，大連 116044；3湖北醫(yī)藥學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，十堰 442000）

糖尿病是一組以持續(xù)性高血糖為主要特征的代謝紊亂性疾病[1]。 當(dāng)機(jī)體長(zhǎng)期處于慢性高血糖環(huán)境將會(huì)導(dǎo)致不同器官損傷及功能障礙。糖尿病性耳聾是以耳蝸毛細(xì)胞散在缺失及退行性變?yōu)橹饕±硖卣鞯母幸羯窠?jīng)性耳聾，多呈進(jìn)行性發(fā)展，病程緩慢且不可逆[2,3]。臨床主要表現(xiàn)為雙耳高頻聽力下降，偶爾可以以突發(fā)性耳聾的形式出現(xiàn)，可伴眩暈，前庭功能減退等[4]。多數(shù)患者就醫(yī)時(shí)已出現(xiàn)聽力不可逆性損害，嚴(yán)重影響糖尿病人群的生活質(zhì)量，因而明確糖尿病性耳聾早期診斷、治療及預(yù)防成為近年研究的熱點(diǎn)。有研究表明氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等參與糖尿病耳聾的發(fā)生發(fā)展過程[5]。

硫氧還蛋白（thioredoxin, Trx）是一種存在于機(jī)體內(nèi)的小分子抗氧化蛋白，分子量約為12 kDa，Trx通過活性位點(diǎn)中Cys的二硫鍵和巰基的互變來實(shí)現(xiàn)氧化還原調(diào)節(jié)功能[6]。NF-E2-相關(guān)因子2（NF-E2-related factor-2, Nrf2）是影響抗氧化反應(yīng)元件（ARE）介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的核心蛋白[7]。 Nrf2通常與Keap1結(jié)合位于胞質(zhì)中，激活后解離并易位至胞核中，與ARE序列結(jié)合而增強(qiáng)抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄[8]。Erk家族是一組可傳導(dǎo)有絲分裂信號(hào)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[9]。Erk通常位于細(xì)胞質(zhì)中，激活后易位進(jìn)入細(xì)胞核并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性和基因表達(dá)，Erk1和Erk2是Erk/MAPK 途徑的重要成員[10]，與細(xì)胞增殖和分化密切相關(guān)[11,12]。

蘿卜硫素（sulforaphane, SF）是廣泛存在于西藍(lán)花等十字花科植物中的異硫氰酸鹽，在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化為萊菔硫烷后通過激活Nrf2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表現(xiàn)出抗氧化應(yīng)激功能[13]。已有研究顯示SF作為抗氧化誘導(dǎo)劑可通過上調(diào)Trx的表達(dá)而延緩Tub基因突變小鼠耳蝸毛細(xì)胞的退行性變[14]，但對(duì)糖尿病小鼠耳蝸毛細(xì)胞的影響及其相關(guān)機(jī)制還未完全闡明。因此，本研究以糖尿病小鼠為模型，明確SF對(duì)糖尿病小鼠耳蝸毛細(xì)胞退行性變的保護(hù)作用機(jī)制，為臨床防治糖尿病性耳聾提供新的指導(dǎo)方向。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇20只健康Balb/c小鼠（購自大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，室溫20~25 ℃，濕度50%~60%，每12 h定點(diǎn)喂養(yǎng)。

2 主要試劑及儀器

蘿卜硫素（L-suforaphane, SF）（加拿大Toronto Research Chemicals公司），鏈尿佐菌素（STZ）（上海希格瑪高技術(shù)有限公司），Trx抑制劑PX-12（R&D），兔抗Trx抗體（Proteintech），兔抗GAPDH抗體（Proteintech），兔p-Erk1/2抗體（Cell Signaling），兔抗Nrf2抗體（Proteintech），HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（Proteintech），Dylight 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG（Abbkin），ECL發(fā)光化學(xué)試劑盒（上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司），DAPI染色試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)有限公司），全蛋白提取試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)有限公司）；三諾安穩(wěn)型血糖儀（三諾生物傳感股份有限公司），SMZ-168解剖顯微鏡（德國(guó)Motic公司），VCX130超聲粉碎儀（SONICS Vibra Cell），酶標(biāo)儀（Thermo Scientific）；Bio-Rad Universal Hood Ⅱ成像分析儀（BIO RAD）。

3 糖尿病模型建立及實(shí)驗(yàn)分組

將20只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC），糖尿病組（DM），DM+SF組，DM+SF+PX12組，每組5只。正常對(duì)照組給與基礎(chǔ)飼料，其他組給與高脂飼料飼養(yǎng)。各組飼養(yǎng)4周后均禁食12 h，DM組給與腹腔注射STZ（40 mg/kg），7 d后重復(fù)注射一次。NC組給與腹腔注射等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。于第二次STZ注射后每隔5 d測(cè)定小鼠尾靜脈血糖值，當(dāng)空腹血糖值≥7.8 mmol/L，則視糖尿病小鼠建模成功[15]。建模成功后，每日上午9:00對(duì)DM+SF組及DM+SF+PX12組小鼠分別腹腔注射用PBS溶解的SF（1.0 mg/kg）和SF+PX12（各1.0 mg/kg）（PX12先用DMSO溶解為0.1 mol/L后再用PBS溶解），注射連續(xù)15 d。對(duì)照組腹腔注射等體積生理鹽水。

4 耳蝸SDH組織化學(xué)染色

小鼠麻醉后取出耳蝸，去除蝸殼后放入裝有0.1% NBT 工作液（現(xiàn)配）的小皿中，用細(xì)針尖挑破圓窗膜并摘除鐙骨，開放前庭窗和圓窗。從蝸頂鉆一小孔，以NBT工作液進(jìn)行耳蝸蝸管內(nèi)灌注。將灌注后的耳蝸置于37 ℃ NBT工作液中孵育1 h，隨后置于10%福爾馬林內(nèi)室溫固定2 d，之后將耳蝸放于7% EDTA二鈉脫鈣液（pH6.9）中，直到耳蝸軟化。

5 耳蝸基底膜鋪片

用耳蝸鑷去除蝸尖附近的耳蝸骨壁，依次分離螺旋韌帶、基底膜和外側(cè)壁組織，最后將基底膜與蝸軸分離。將基底膜轉(zhuǎn)移到滴有甘油的載波片上，于體式顯微鏡下分段鋪平，保證其外側(cè)處于同一方向，覆蓋蓋玻片以中性樹脂封片。

6 硫氧還蛋白免疫熒光染色

小鼠耳蝸組織經(jīng)石蠟包埋制成石蠟切片，后將石蠟切片經(jīng)烘箱60 ℃烘烤2 h，脫蠟水化，之后用pH6.0檸檬酸鈉抗原修復(fù)液高壓修復(fù)5 min，蒸餾水浸泡冷卻至室溫，PBS清洗3遍。濾紙吸干周圍水分，蠟筆圈畫組織。0.5%的Triton X-100室溫孵育30 min，PBS清洗3遍，每次3 min。3% H2O2孵育15 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS清洗3×3 min。滴加山羊血清工作液室溫孵育30 min。于組織區(qū)域滴加配制好的Trx抗體（1:200），放入濕盒4 ℃冰箱過夜孵育。次日，棄掉一抗，PBS清洗3次，每次3 min。濾紙吸干組織周圍液體，滴加Dylight 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:1000），室溫避光孵育1 h。PBS清洗3次，每次10 min。滴加DAPI工作液（2 μg/mL）復(fù)染細(xì)胞核，37 ℃避光孵育15 min。PBS清洗3×3 min，濾紙吸干，滴加抗淬滅劑進(jìn)行封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

7 Western blot檢測(cè)耳蝸組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

建模成功后取各組小鼠耳蝸組織，分別加入100 μL蛋白裂解液，超聲粉碎后冰上靜置30 min，4 ℃下12000 r/min離心15 min，取上清，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白定量法測(cè)定樣品蛋白濃度，進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉（TTBS配制）室溫?fù)u床封閉；分別加入抗Trx（1:1000）、Nrf2（1:1000）、 p-Erk1/2（1:1000）及抗GAPDH（1:2000）等一抗，4 ℃孵育過夜；次日取出PVDF膜置于TTBS洗膜3×15 min， HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:5000）室溫孵育1.5 h，TTBS洗膜3×15 min；ECL孵育后Bio-rad成像分析儀成像，通過Labwork軟件進(jìn)行測(cè)定蛋白條帶光密度值，以目的蛋白光密度值與內(nèi)參蛋白光密度比值代表相應(yīng)目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，并進(jìn)一步應(yīng)用snk-q檢驗(yàn)兩兩比較組間差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 蘿卜硫素抑制糖尿病小鼠耳蝸損傷

HE染色觀察顯示，與NC組相比，DM組小鼠耳蝸外毛細(xì)胞排列松散且不規(guī)則；DM+SF組相較于DM組耳蝸毛細(xì)胞體積增大且排列相對(duì)規(guī)則；而SF與PX12聯(lián)合處理的DM組與單純SF處理組相比，耳蝸毛細(xì)胞排列不規(guī)則且體積變小（圖1）。由此提示SF可能通過Trx延緩糖尿病小鼠耳蝸形態(tài)學(xué)損傷。

圖1 蘿卜硫素對(duì)糖尿病小鼠耳蝸損傷影響的HE染色觀察。比例尺，100 μmFig. 1 HE staining for the effect of suforaphane on the injury of the cochlea in diabetic mice. Scale bar, 100 μm

2 蘿卜硫素抑制糖尿病小鼠耳蝸毛細(xì)胞SDH活性降低和Trx表達(dá)下調(diào)

SDH組織化學(xué)染色顯示：與NC組相比較，DM組較多外毛細(xì)胞SDH活性降低或缺失，單純SF處理的DM小鼠耳蝸外毛細(xì)胞SDH活性降低或缺失明顯減少，內(nèi)毛細(xì)胞SDH活性物明顯改變；而SF與PX12聯(lián)合處理的DM小鼠耳蝸外毛細(xì)胞SDH活性仍明顯降低或缺失，且內(nèi)毛細(xì)胞SDH活性也降低或缺失（圖2A—C）。免疫熒光染色顯示：DM組小鼠耳蝸毛細(xì)胞內(nèi)Trx免疫反應(yīng)性較對(duì)照組明顯減弱；SF處理后，Trx免疫反應(yīng)性的降低被明顯抑制；而SF與PX12聯(lián)合后， Trx免疫反應(yīng)性仍明顯降低（圖2D）。由此進(jìn)一步說明，糖尿病小鼠耳蝸外毛細(xì)胞丟失顯著，而SF可以減少糖尿病所致耳蝸毛細(xì)胞的丟失，在Trx受到抑制時(shí)，這種保護(hù)作用會(huì)相應(yīng)減弱，SF可能通過上調(diào)Trx表達(dá)對(duì)糖尿病小鼠耳蝸毛細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

圖2 蘿卜硫素對(duì)糖尿病小鼠耳蝸毛細(xì)胞SDH活性和Trx免疫反應(yīng)性的影響。A，耳蝸毛細(xì)胞SDH活性的組織化學(xué)染色；B，內(nèi)毛細(xì)胞SDH活性缺失率統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；C，外毛細(xì)胞SDH活性缺失率統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*P<0.05，***P<0.001。D，耳蝸毛細(xì)胞Trx免疫反應(yīng)性免疫熒光染色Fig. 2 The effect of suforaphane on SDH activity and Trx immunoreactivity of the cochlear hair cells of the diabetic mice. A, histochemical staining of SDH activity in the cochlear hair cells ; B, statistical analysis of SDH activity deletion rate of the inner hair cells; C, statistical analysis of SDH activity deletion rate of the outer hair cells; *P<0.05，***P<0.001. D, immunofluorescence staining for Trx immunoreactivity in the in the cochlear hair cells of the diabetes mice.

3 蘿卜硫素抑制糖尿病小鼠耳蝸毛細(xì)胞p-Erk1/2 /Nrf2通路活性的下調(diào)

Western blot檢測(cè)顯示：與NC組比較，DM組小鼠耳蝸組織中Nrf2、p-Erk1/2和Trx的表達(dá)水平顯著下調(diào)； SF作用后，Nrf2、p-Erk1/2和Trx的表達(dá)水平較DM組明顯升高；而SF與PX12聯(lián)合處理后，Nrf2、p-Erk1/2和Trx的表達(dá)水平與DM組相似，明顯低于NC組（圖3）。本結(jié)果說明SF可抑制糖尿病小鼠耳蝸毛細(xì)胞p-Erk1/2 /Nrf2通路活性的下調(diào)，SF可能通過p-Erk1/2 /Nrf2抗氧化信號(hào)通路上調(diào)糖尿病小鼠耳蝸毛細(xì)胞的Trx表達(dá)。

討 論

糖尿病是一組由多病因引起以慢性高血糖為特征的代謝性疾病。糖尿病患者長(zhǎng)期處于糖、脂及蛋白質(zhì)代謝紊亂，可累及腎臟、心臟、神經(jīng)血管等多組織器官，嚴(yán)重威脅患者健康[16]。糖尿病性耳聾是一種進(jìn)行性發(fā)展、病程緩慢、以高頻聽力下降為主的感音神經(jīng)性耳聾，是糖尿病常見并發(fā)癥之一。研究表明，活性氧（ROS）在感音神經(jīng)性耳聾的發(fā)病中起重要作用[17]。一方面，耳蝸內(nèi)的抗氧化酶類可滅活自由基使耳蝸處于自由基高代謝水平。另一方面，外毛細(xì)胞側(cè)面獨(dú)特的囊腔結(jié)構(gòu)是氧自由基的產(chǎn)生場(chǎng)所及受累部位。

此外有研究表明，在顱腦損傷患者中Trx在減輕損傷或抑制損傷進(jìn)展方面意義重大[18]；外源性增加Trx能夠有效降低肺缺血再灌注動(dòng)物模型的肺組織損傷[19]。本研究使用SF和Trx抑制劑（PX12）分別作用于DM組小鼠，采用SDH活性染色進(jìn)行耳蝸毛細(xì)胞觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DM組與NC組相比，外毛細(xì)胞顯著減少，內(nèi)毛細(xì)胞亦有所減少。表明糖尿病可引起耳蝸毛細(xì)胞丟失，單純給予SF處理的DM組小鼠外毛細(xì)胞丟失現(xiàn)象有所減弱；而SF與PX12聯(lián)合處理的DM組與單純給予SF處理的DM組比較，小鼠外毛細(xì)胞丟失嚴(yán)重。此結(jié)果表明SF能減少因糖尿病造成的耳蝸毛細(xì)胞丟失，對(duì)耳蝸毛細(xì)胞退變起保護(hù)作用。當(dāng)Trx活性受抑制時(shí)上述保護(hù)作用隨之減弱，提示Trx在SF對(duì)糖尿病小鼠耳蝸毛細(xì)胞丟失過程中發(fā)揮保護(hù)作用過程中起到關(guān)鍵作用。

已有研究證實(shí)Nrf2-ARE途徑參與Trx及TrxR表達(dá)的調(diào)控[20]。SF作為抗氧化劑的天然誘導(dǎo)劑，通過激活p-Erk1/2 /Nrf2信號(hào)通路在糖尿病神經(jīng)退行性變中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，單純給予SF處理后能上調(diào)DM組耳蝸組織中Nrf2、p-Erk1/2和Trx的表達(dá)，進(jìn)一步說明SF可通過作用于p-Erk1/2/Nrf2信號(hào)通路上調(diào)Trx表達(dá)。綜上所述，蘿卜硫素通過作用于p-Erk1/2 /Nrf2抗氧化信號(hào)通路介導(dǎo)糖尿病小鼠耳蝸毛細(xì)胞內(nèi)Trx表達(dá)上調(diào)，對(duì)糖尿病引起的耳蝸毛細(xì)胞退行性變起到保護(hù)作用。

糖尿病導(dǎo)致機(jī)體處于一種高血糖的狀態(tài)，其會(huì)導(dǎo)致不同器官損傷及功能障礙，而氧化應(yīng)激對(duì)于糖尿病及耳蝸病變的發(fā)生起到了關(guān)鍵性的作用，高血糖導(dǎo)致體內(nèi)微環(huán)境參與氧化應(yīng)激的發(fā)生，引起ROS大量累積，體內(nèi)抗氧化酶的活性出現(xiàn)下降及下游通路的改變，從而最終引起耳蝸毛細(xì)胞的損傷和退化丟失。而大量天然植物提取物中存在著許多有效、安全的抗氧化物，因此針對(duì)其種類廣泛尋找和明確其抗氧化作用及機(jī)制對(duì)于今后進(jìn)一步治療和預(yù)防糖尿病引起的感音神經(jīng)性耳聾具有重要的理論及臨床現(xiàn)實(shí)意義。