連秀麗，杜娟，劉玥，孫建東，徐偉偉，林子杭，江霞，王世鄂*

（1福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞工程與再生醫(yī)學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350122；2聯(lián)勤保障部隊(duì)第904醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，無錫 214000；3福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)系，福州 350122）

哺乳動(dòng)物早胚發(fā)育主要包括以下3個(gè)階段：①母型向合子型過渡（maternal-to-zygotic transition，MZT），形成具有全能性的卵裂球；②致密化形成桑葚胚；③腔化形成囊胚。其中MZT是影響早胚發(fā)育關(guān)鍵的第一步，該時(shí)期發(fā)生合子基因組激活（zygotic genome activation，ZGA），以此改變基因表達(dá)模式，產(chǎn)生胚胎特異性的RNA及蛋白[1]。在小鼠中，ZGA主要發(fā)生在2-細(xì)胞階段[2]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，小鼠2-細(xì)胞胚至4-細(xì)胞胚的順利過渡，往往與ZGA密切相關(guān)[3,4]。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigalloeateehin-3-gallate，EGCG）是綠茶提取物茶多酚的主要活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、抗癌等作用[5-7]。有研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的EGCG能夠促進(jìn)新鮮或冷凍精子體外受精的胚胎發(fā)育，也能夠緩解高溫對(duì)卵巢池中卵母細(xì)胞發(fā)育的負(fù)面影響，提高胚胎質(zhì)量[8,9]。此外，EGCG在不同類型的干細(xì)胞中能夠影響多能性因子的表達(dá)，例如OCT4、SOX2等[10,11]。并且前期結(jié)果表明，OCT4或SOX2表達(dá)量的改變將影響小鼠2-細(xì)胞胚至4-細(xì)胞胚的過渡率[12,13]。然而，EGCG對(duì)小鼠早胚體外發(fā)育的影響是否與ZGA以及多能性因子有關(guān)，尚不清楚。

因此，本研究以昆明（Kunming，KM）小鼠作為動(dòng)物模型，旨在觀察EGCG對(duì)小鼠早胚體外發(fā)育和對(duì)ZGA與多能性因子OCT4和SOX2表達(dá)的影響。為進(jìn)一步闡明EGCG在哺乳動(dòng)物早胚體外發(fā)育中的作用奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明小鼠（雌鼠4~6 w, 雄鼠>8 w）購自北京華阜康生物科技有限公司，合格證號(hào)：SCXK（京）2014-004），飼養(yǎng)3～5 d，調(diào)節(jié)生理周期（光照周期07:00—19:00），使其適應(yīng)環(huán)境[福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證號(hào)：SYXK（閩）2016-0006]供實(shí)驗(yàn)處理。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)操作均符合福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定（批號(hào)：2018-004）。

2 主要試劑

孕馬血清促性腺激素（PMSG）（寧波激素制藥二廠）；人絨毛膜促性腺激素（hCG）（Prospec公司）；M2培養(yǎng)液（Sigma公司）；M16培養(yǎng)液（Sigma公司）；EGCG粉末（Sigma公司）；鼠抗SOX2單克隆抗體（Santa Cruze公司）；兔抗OCT4多克隆抗體（Abcam公司）；免疫染色固定液（碧云天公司）；Alexa Fluor? 594標(biāo)記驢抗鼠IgG、Alexa Fluor? 488標(biāo)記驢抗兔IgG（Life Technology公司）；Quick-RNATMMicroPrep R1050試劑盒（Zymo公司）；Reverse Transcription Kit試劑盒、dNTP Mix（Thermo公司）；SYBR?Premix Ex TaqTM（Roche公司）；PCR引物（上海生工）。

3 主要儀器設(shè)備

PikoReal96實(shí)時(shí)定量PCR儀（Thermo公司）；SMZ445體視顯微鏡（Nikon公司）；TS-100F倒置顯微鏡（Nikon公司）；Leica SP5激光共聚焦掃描顯微鏡（Leica公司），水套式二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo公司）。

4 小鼠超排卵和受精

KM雌性小鼠腹腔注射10IU PMSG，46～48 h后注射6 IU hCG，隨后與KM雄性小鼠1:1合籠，次日清晨檢查陰栓判斷是否受精。

5 小鼠1-細(xì)胞胚的收集和體外培養(yǎng)

于hCG注射后27 h，將有陰栓的雌鼠以頸椎脫臼法處死，打開腹腔，迅速分離并剪下輸卵管；用M2培養(yǎng)液沖出輸卵管中的1-細(xì)胞胚，洗滌3次以上；體式顯微鏡下觀察，將具有雌雄原核的1-細(xì)胞胚移至預(yù)先于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中平衡好的M16液滴中洗滌3次；將清洗好的1-細(xì)胞胚隨機(jī)移至預(yù)孵育的培養(yǎng)液滴中（分為對(duì)照組：M16，實(shí)驗(yàn)組：10 μg/mL EGCG、20 μg/mL EGCG），置于37℃、5% CO2、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上，觀察并記錄各培養(yǎng)液滴中2-細(xì)胞胚、4-細(xì)胞胚、桑葚胚以及囊胚的發(fā)育情況。

6 免疫熒光染色

將早胚置于臺(tái)式液中處理30～60 s后用0.1%PVA-PBS進(jìn)行漂洗，隨后移入免疫染色固定液中室溫固定1 h，0.1% PVA-PBS連續(xù)清洗3次；再置于0.5% Triton X-100中室溫孵育30 min，0.1% PVA-PBS連續(xù)清洗3次后于0.2%牛血清白蛋白（BSA）中室溫封閉1 h；添加抗SOX2鼠單克隆抗體（1:1500）或抗OCT4兔多克隆抗體（1:800），4℃孵育過夜；次日，PBST清洗3次，每次10 min，添加Alexa Fluor?594標(biāo)記驢抗鼠二抗或Alexa Fluor?488標(biāo)記驢抗兔IgG（1:1000），室溫避光孵育1 h；PBST清洗3次，每次10 min，添加DAPI（1:5000）進(jìn)行細(xì)胞核復(fù)染，室溫避光孵育1 h，PBST清洗3次，每次10 min；在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

7 實(shí)時(shí)定量PCR

分別收集M16組和20 μg/ml EGCG組2-細(xì)胞胚各100枚，用DEPC處理過的0.3% PVP-PBS 洗滌3次后，置于裝有400 μL RNA Lysis Buffer離心管中；根據(jù)Quick-RNATMMicroPrep R1050試劑盒說明書提供的方法提取總RNA；根據(jù)Reverse Transcription Kit試劑盒說明書，使用PCR儀合成cDNA；PCR引物序列信息列于表 1（以H2afz基因作為內(nèi)參）；在Real Time-PCR擴(kuò)增儀上采用 SYBR?PremixEx TaqTM進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：95 ℃，10 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃，15 s，40個(gè)循環(huán)；60 ℃，1 min，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

表1 引物序列Tab.1 Primer sets used in the present study

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

培養(yǎng)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行卡方（χ2）檢驗(yàn)；激光共聚焦掃描顯微鏡所得圖片用SmtScape軟件測(cè)定分析熒光強(qiáng)度；采用2‐ΔΔct法處理實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果；利用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)方差齊性后運(yùn)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，均以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 EGCG促進(jìn)1-細(xì)胞胚體外發(fā)育

小鼠1-細(xì)胞胚分別在M16培養(yǎng)液和添加不同濃度 EGCG的培養(yǎng)液中連續(xù)培養(yǎng)觀察。結(jié)果顯示，10μg/mL EGCG和20 μg/mL EGCG均可使4-細(xì)胞胚、桑葚胚、囊胚的發(fā)育率有所提高，且從4-細(xì)胞胚開始過渡比例有著明顯提升（表2）。

表2 EGCG對(duì)小鼠1-細(xì)胞胚體外發(fā)育的影響Tab. 2 Effects of EGCG on the development of the mouse one-cell embryo in vitro

2 EGCG促進(jìn)2-細(xì)胞胚合子基因組激活標(biāo)志基因MuERV-L和Hsp70.1表達(dá)

從培養(yǎng)結(jié)果可知20 μg/mL EGCG促進(jìn)早胚發(fā)育效果更佳，因此將采用該組作為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行后續(xù)機(jī)制研究。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)顯示：在小鼠2-細(xì)胞胚中，20 μg/mL EGCG組ZGA標(biāo)志基因MuERV-L和Hsp70.1的mRNA表達(dá)水平高于M16組，而eIF1A、Zscan4d的mRNA表達(dá)量無明顯改變（圖1）。

圖1 EGCG處理對(duì)2-細(xì)胞胚ZGA標(biāo)志基因mRNA表達(dá)的影響。*P<0.05Fig. 1 Effects of EGCG treatment on the mRNA expression levels of ZGA marker genes of the two-cell embryo. *P<0.05

3 EGCG促進(jìn)2-細(xì)胞胚多能性因子OCT4表達(dá)

免疫熒光染色顯示：在小鼠2-細(xì)胞胚中，20 μg/mL EGCG組OCT4的熒光相對(duì)強(qiáng)度高于M16組（圖2A、B），而SOX2的熒光相對(duì)強(qiáng)度無明顯改變（圖3A、B）。同時(shí)，Real Time-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：20 μg/mL EGCG組Oct4 mRNA表達(dá)量明顯高于M16組（圖2C），而Sox2 mRNA表達(dá)情況無變化（圖3C）。

圖2 EGCG處理對(duì)2-細(xì)胞胚OCT4表達(dá)的影響。A，OCT4表達(dá)的免疫熒光檢測(cè)；比例尺，50 μm；B，OCT4免疫熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。C，Oct4 mRNA表達(dá)水平的Real-time RT-PCR檢測(cè)。*P<0.05Fig. 2 Effects of EGCG treatment on OCT4 expression in the two-cell embryo. A, immunofluorescence examination for OCT4 expression; scale bar, 50 μm; B, statistical analysis of OCT4 immunofluorescence intensity. C, Real time RT-PCR detection for Oct4 mRNA expression level. *P<0.05.

圖3 EGCG處理對(duì)2-細(xì)胞胚SOX2表達(dá)的影響。A，SOX2表達(dá)的免疫熒光檢測(cè)；比例尺，50 μm；B，SOX2免疫熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。C，Sox2 mRNA表達(dá)水平的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。ns，無顯著性（P>0.05）Fig. 3 Effects of EGCG treatment on SOX2 expression in the two-cell embryo. A, immunofluorescence examination for SOX2 expression; scale bar, 50 μm; B, statistical analysis of SOX2 immunofluorescence intensity.C, Real time RT-PCR detection for Sox2 mRNA expression level. ns, no significance (P>0.05)

討 論

當(dāng)今輔助生殖技術(shù)的應(yīng)用給許多不孕不育患者帶來了福音，該技術(shù)成功應(yīng)用的先決條件之一是須確保早胚的順利發(fā)育。許多研究學(xué)者通過在培養(yǎng)液中添加不同的物質(zhì)以此促進(jìn)早胚體外發(fā)育[14,15]。本研究發(fā)現(xiàn)，M16培養(yǎng)液中添加不同濃度的EGCG可促進(jìn)KM小鼠早胚體外發(fā)育，且從4-細(xì)胞胚開始過渡率顯著升高，以添加20 μg/mL EGCG效果最為明顯。

翻譯起始因子基因eIF1A是ZGA階段特異性基因，其表達(dá)起始同第一次DNA復(fù)制呈正相關(guān)[16]；含鋅指和SCAN結(jié)構(gòu)域蛋白Zscan4d是2-細(xì)胞胚晚期的主要轉(zhuǎn)錄本，敲減Zscan4將延遲2-細(xì)胞胚至4-細(xì)胞胚的進(jìn)程[17]；鼠內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒基因MuERV-L在ZGA中最早轉(zhuǎn)錄，約在受精后8 h[18]；熱休克蛋白基因Hsp70.1在ZGA開始時(shí)高度轉(zhuǎn)錄，直至第二輪DNA復(fù)制完成前受到抑制[19]。上述4個(gè)基因被認(rèn)為是ZGA起始的內(nèi)源性標(biāo)志基因[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，20 μg/mL EGCG處理小鼠1-細(xì)胞胚后，顯著增強(qiáng)ZGA標(biāo)志基因MuERV-L和Hsp70.1的mRNA表達(dá)水平。有研究表明，在2-細(xì)胞胚中激活的MuERVL與開放的染色質(zhì)密切相關(guān)，并可促進(jìn)數(shù)百個(gè)鄰近基因的表達(dá)[21,22]。同時(shí)，通過添加相應(yīng)抗體來抑制HSP70蛋白功能，結(jié)果導(dǎo)致囊胚形成率降低，細(xì)胞死亡率增加[23]。以上兩者mRNA表達(dá)量的升高，說明EGCG可能參與調(diào)節(jié)ZGA的啟動(dòng)。此外，前期研究發(fā)現(xiàn)EGCG可通過清除ROS和調(diào)節(jié)線粒體活性，促進(jìn)早胚體外發(fā)育[24]。而在小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，HSP70可降低脂多糖誘導(dǎo)的ROS生成[25]。那么，EGCG清除ROS的能力或許與Hsp70.1表達(dá)升高有一定聯(lián)系。

另有研究報(bào)道，多能性因子SOX2和OCT4在早胚發(fā)育過程扮演著關(guān)鍵角色。兩者mRNA表達(dá)十分相似，從卵母細(xì)胞至早胚各發(fā)育階段均有表達(dá)，且囊胚階段僅表達(dá)于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cell mass，ICM）[26]。SOX2能預(yù)示小鼠4-細(xì)胞胚后期發(fā)育的命運(yùn)。在4-細(xì)胞胚中，若檢測(cè)到SOX2長時(shí)間富集于DNA上，則此枚卵裂球發(fā)育至后期將被分配至ICM中[27]。在牛早胚中，注射Sox2 siRNA后，囊胚形成率明顯降低[28]。其次，OCT4是小鼠2-細(xì)胞胚內(nèi)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在轉(zhuǎn)錄和翻譯后修飾過程中有著重要作用[29]。利用反義寡核苷酸技術(shù)降低Oct4的表達(dá)能使早胚阻滯在不同發(fā)育階段[30]。此外，在斑馬魚早胚中，Sox2 與Oct4 共同激活約40%早期合子型基因[31]。因此，我們進(jìn)一步通過免疫熒光染色和Real time-PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，添加20 μg/mL EGCG實(shí)驗(yàn)組中的Oct4蛋白和mRNA表達(dá)量明顯升高。Teng等人研究指出Oct4啟動(dòng)子活性受PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路正向調(diào)控[32]。同時(shí)EGCG可增強(qiáng)損傷內(nèi)皮細(xì)胞p-AKT表達(dá)水平，激活PI3K/AKT/eNOS信號(hào)通路，抑制同型半胱氨酸（hcy）誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)凋亡[33]。并且有趣的是，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，抑制AKT活性顯著下調(diào)了ZGA的兩個(gè)標(biāo)記基因MuERV-L和eIF-1A的mRNA水平[4]。這些結(jié)果和研究相關(guān)進(jìn)展提示EGCG可能通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)Oct4表達(dá)，繼而參與ZGA的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，EGCG能夠促進(jìn)小鼠早胚體外發(fā)育，與其影響ZGA的啟動(dòng)和多能性因子Oct4表達(dá)有關(guān)。但是否存在EGCG/PI3K/AKT/Oct4信號(hào)通路尚未清楚，有待進(jìn)一步研究闡明。