林蓉，鄭智文，阮丹丹，曾貞，林欣，胡建民，黃焱*

(福建醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院眼視光學(xué)系，福州 350004)

如今，發(fā)光二極管（light-emitting diodes, LEDs）作為一種節(jié)能光源，正在逐步取代傳統(tǒng)光源，成為國(guó)內(nèi)光源的主流，廣泛應(yīng)用于智能手機(jī)、數(shù)字顯示器和計(jì)算機(jī)屏幕等電子消費(fèi)產(chǎn)品中。LEDs所發(fā)出的400~495 nm的短波長(zhǎng)藍(lán)光具有相對(duì)較高的能量，能夠穿透角膜和晶狀體到達(dá)視網(wǎng)膜，造成嚴(yán)重的視網(wǎng)膜損傷[1]。視網(wǎng)膜光感受器及色素上皮層代謝活躍，又處于富氧環(huán)境中，給予一定的光子刺激便可在視網(wǎng)膜外層發(fā)生光化學(xué)損傷反應(yīng)，破壞線粒體內(nèi)氧化平衡，觸發(fā)線粒體相關(guān)的凋亡信號(hào)通路，最終導(dǎo)致過量的活性氧（reactive oxygen species, ROS）積聚，氧化應(yīng)激甚至是細(xì)胞凋亡壞死[2]。

氧化應(yīng)激（oxidative stress, OS）改變細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，并引發(fā)細(xì)胞反應(yīng)，這取決于暴露的類型和嚴(yán)重程度。從本質(zhì)上講，氧化應(yīng)激存在一個(gè)極限壓力閾值：在該閾值以下，細(xì)胞會(huì)觸發(fā)其保護(hù)機(jī)制；相反，如果壓力超過閾值或保護(hù)機(jī)制的激活失敗，會(huì)觸發(fā)細(xì)胞其他信號(hào)通路，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、壞死[3]。研究證明，視網(wǎng)膜光損傷可能與氧化應(yīng)激損傷相關(guān)[4,5]，流行病學(xué)調(diào)查也揭示了其與視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa, RP)和老年性黃斑變性（age-related macular degeneration, AMD）的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，后者是視力永久性喪失的主要原因，在老年人中非常常見[6,7]。核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid-2-related factor 2, Nrf2）是重要的內(nèi)源性抗氧化通路，可調(diào)節(jié)下游因子血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1, HO-1），中和自由基，防止和修復(fù)ROS造成的損害，從而增強(qiáng)免疫防御，降低患某些疾病的風(fēng)險(xiǎn)，從而發(fā)揮抗氧化作用[2,4]?；谏鲜隼碚?，本實(shí)驗(yàn)選用短波藍(lán)光光源作為氧化應(yīng)激源，設(shè)置同一波長(zhǎng)強(qiáng)度、不同照射時(shí)長(zhǎng)的藍(lán)光實(shí)驗(yàn)組，觀察藍(lán)光損傷大鼠視網(wǎng)膜組織中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)變化，從而進(jìn)一步探討藍(lán)光損傷視網(wǎng)膜的機(jī)制。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只7周齡清潔級(jí)雄性SD雄性大鼠購(gòu)自福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 [許可證號(hào)：SCXK（閩）2016-0002]，體重200~250 g，于通氣、通風(fēng)良好的動(dòng)物房中給與正常飲食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批。

2 主要儀器與試劑

自制570 mm×490 mm×625 mm藍(lán)光照射箱；TL-D18W/52藍(lán)光燈管（波長(zhǎng)：400～500 nm，峰值450 nm）；數(shù)字光照度計(jì)（深圳聚茂源科技有限公司）；酶標(biāo)儀（Labsystems Multiskan MS 公司，芬蘭）；洗板機(jī)（Thermo Labsystems公司，芬蘭）；脫水機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）；病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；顯微鏡（Nikon，E100）。FAS眼球固定液（Servicebio，貨號(hào)：G1109-100ML）；蘇木素染色液（Servicebio，貨號(hào)：G1004）；環(huán)保型脫蠟液（武漢賽維爾生物，貨號(hào)：G1128）；蛋白酶K（Servicebio，貨號(hào)：G1205）；破膜液（Servicebio，貨號(hào)：G1204）；DAPI（Servicebio，貨號(hào)：G1012）；抗熒光淬滅封片劑（Servicebio，貨號(hào)：G1401）；TUNEL試劑盒試劑盒（Servicebio，貨號(hào)：G1501）；3%過氧化氫（Servicebio，貨號(hào)：G0115）；免疫組織化學(xué)試劑盒DAB顯色劑（Servicebio，貨號(hào)：G1211）；EDTA（pH8.0）抗原修復(fù)液（Servicebio，貨號(hào)：G1206）；EDTA（pH9.0）抗原修復(fù)液（Servicebio，貨號(hào)：G1203）；檸檬酸（pH6.0）抗原修復(fù)液（Servicebio，貨號(hào)：G1202）；兔抗大鼠Nrf2抗體（Servicebio，貨號(hào)：GB11549）；兔抗大鼠HO-1抗體（Servicebio，貨號(hào)：AF7066）；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（Servicebio，貨號(hào)：GB23303）；正常兔血清封閉液（Servicebio，貨號(hào)：G1209）；PBS（Servicebio，貨號(hào)：G0002）；蘇木素染色液（Servicebio，貨號(hào)：G1004）；眼球固定液（武漢塞維爾生物科技有限公司）。

3 自制藍(lán)光照射箱

根據(jù)劉維烊等[8]對(duì)大鼠的照射方法進(jìn)行改良，自制藍(lán)光照射箱。鐵絲網(wǎng)制成底面（600 mm×500 mm），并在其上固定6個(gè)等距長(zhǎng)方體鐵絲籠（170 mm×80 mm×90 mm），頂蓋可拆卸。另制作無底紙箱（570 mm×490 mm×625 mm），以鐵絲網(wǎng)格為底，于箱子頂部安裝3根藍(lán)光燈管，使每個(gè)網(wǎng)籠內(nèi)數(shù)字式光照強(qiáng)度計(jì)測(cè)得的藍(lán)光強(qiáng)度約為2500 Lux。藍(lán)光從大鼠頭部的前上方照射，以盡量減少眼瞼的遮蓋。

4 分組及干預(yù)方法

按照隨機(jī)數(shù)字表法將40只健康SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照（Control）組、實(shí)驗(yàn)A（ExpA）組、實(shí)驗(yàn)B（ExpB）組、實(shí)驗(yàn)C（ExpC）組，每組10只。對(duì)照組正常飼養(yǎng)，不予以藍(lán)光照射；實(shí)驗(yàn)組每天接受2500 Lux的藍(lán)光（峰值450 nm）照射12 h，分別照射10 d（ExpA組）、20 d（ExpB組）、30 d（ExpC組），照射時(shí)間于當(dāng)日19:00至次日的7:00共12 h。37 d后處死取材。

5 HE染色

新鮮大鼠眼組織用FAS眼球固定液固定24 h后，放于脫水盒內(nèi)脫水、浸蠟，將浸好蠟的組織于包埋機(jī)內(nèi)進(jìn)行包埋。將冷卻后的蠟塊置于石蠟切片機(jī)切片，切片厚度約為4 μm。然后進(jìn)行蘇HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)變化。

6 TUNEL法檢測(cè)視網(wǎng)膜組織凋亡指數(shù)

切片常規(guī)脫蠟、水化后滴加蛋白酶K工作液于37 °C恒溫箱孵育22 min，洗滌待切片稍干后滴加破膜工作液覆蓋組織常溫孵育20 min，室溫平衡后取TUNEL試劑盒內(nèi)TdT酶、FITC-dUTP、緩沖液按照1:5:50比例混合，覆蓋組織于37 °C恒溫箱孵育2 h，DAPI復(fù)染細(xì)胞核后使用抗熒光淬滅封片劑進(jìn)行封片，切片于熒光顯微鏡下觀察（FITC激發(fā)波長(zhǎng)465~495 nm，發(fā)射波長(zhǎng)515~555 nm；DAPI紫外激發(fā)波長(zhǎng)330~380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)420 nm）并采集圖像。視網(wǎng)膜組織凋亡結(jié)果判斷：每張切片隨機(jī)取5個(gè)200倍視野，計(jì)數(shù)TUNEL染色陽性（凋亡）細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡指數(shù)（凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%）。

7 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)視網(wǎng)膜組織Nrf2和HO-1表達(dá)

將視網(wǎng)膜標(biāo)本脫蠟、水化后置于EDTA抗原修復(fù)緩沖液（pH9.0）中，于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，3%過氧化氫溶液室溫孵育25 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加3%BSA均勻覆蓋組織后室溫封閉30 min，加入兔抗大鼠Nrf2抗體（1:100）或兔抗大鼠HO-1抗體（1:500）于濕盒內(nèi)4 °C孵育過夜，第2 d滴加HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:200）室溫孵育50 min，隨后DAB顯色液孵育，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，自來水沖洗切片終止染色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，脫水封片后于顯微鏡下觀察。判斷標(biāo)準(zhǔn)為免疫組化反應(yīng)后陽性標(biāo)記的細(xì)胞胞漿著色呈棕色或深棕色。隨機(jī)選取5個(gè)200倍視野，使用Image J軟件分析、測(cè)定光密度值（optical density，OD）值，以代表Nrf2和HO-1免疫反應(yīng)性。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件，各觀察數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），用Graphpad prism 9.3.0作圖，以雙側(cè)P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 藍(lán)光暴露使視網(wǎng)膜厚度下降

HE染色顯示（圖1）：對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊；實(shí)驗(yàn)A組大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰、排列整齊，個(gè)別細(xì)胞輕度水腫；實(shí)驗(yàn)B組大鼠視網(wǎng)膜組織排列基本整齊，外核層（outer nuclear layer, ONL）厚度顯著降低；實(shí)驗(yàn)C組大鼠視網(wǎng)膜組織排列基本整齊，視網(wǎng)膜厚度、感光細(xì)胞層（photoreceptor cell layer, PCL）厚度和ONL厚度均下降。

圖1 HE染色檢測(cè)藍(lán)光暴露對(duì)視網(wǎng)膜組織學(xué)影響。A，各組視網(wǎng)膜代表性HE染色結(jié)果；GCL，節(jié)細(xì)胞層；ONL，外核層；INL，內(nèi)核層；PCL，感光細(xì)胞層；比例尺，40 μm。B，視網(wǎng)膜厚度、ONL厚度、PCL厚度的定量分析；與Control組比較：*P<0.05；與ExpA組比較：#P<0.05；與ExpB組比較：$P<0.05Fig.1 HE staining of the effects of blue light exposure on retinal histology. A, representative HE staining results of the retinal tissue of each group; GCL,ganglion cell layer; ONL, outer nuclear layer; INL, inner nuclear layer; PCL, photoreceptor cell layer; scale bar, 40 μm. B, quantitative analysis of the thickness of the retina, ONL and PCL; *P<0.05, compared with Control group; #P<0.05, compared with ExpA group; $P<0.05, compared with ExpB group

2 藍(lán)光暴露誘導(dǎo)視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡

TUNEL染色顯示：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)A組視網(wǎng)膜內(nèi)未見凋亡細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)B組視網(wǎng)膜內(nèi)較多凋亡細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)C組視網(wǎng)膜內(nèi)可見大量凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞主要存在于ONL層。取實(shí)驗(yàn)B組和C組各5個(gè)視野計(jì)算視網(wǎng)膜凋亡指數(shù)，分別為（20.724±0.824）%和（40.607±0.896）%。

3藍(lán)光暴露上調(diào)視網(wǎng)膜Nrf2和HO-1表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色顯示：與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組的Nrf2免疫反應(yīng)性均顯著增強(qiáng)，且隨著照射時(shí)間的增加而逐漸增強(qiáng)；實(shí)驗(yàn)B組的HO-1免疫反應(yīng)性顯著增強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)A組和C組有增強(qiáng)趨勢(shì)，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。

圖3 藍(lán)光暴露對(duì)視網(wǎng)膜組織中Nrf2、HO-1表達(dá)影響的免疫組織化學(xué)檢測(cè)。A，視網(wǎng)膜Nrf2和HO-1免疫組織化學(xué)染色；ONL，外核層；INL，內(nèi)核層；GCL，節(jié)細(xì)胞層；比例尺，40 μm。B，Nrf2免疫反應(yīng)性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析； C，HO-1免疫反應(yīng)性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；與Control組比較：*P<0.05；與ExpA組比較：#P<0.05；與ExpB組比較：$P<0.05Fig. 3 Immunohistochemical detection of the effect of blue light exposure on the expression of Nrf2 and HO‐1 in the retinal tissue. A, immunohistochemical staining of Nrf2 and HO-1 in the retina; ONL, outer nuclear layer; INL, inner nuclear layer; GCL, ganglion cell layer; scale bar, 40 μm. B,statistical analysis of Nrf2 immunoreactivity; C, statistical analysis of HO-1 immunoreacxtivity; *P<0.05, compared with Control group; #P<0.05,compared with ExpA group; $P<0.05, compared with ExpB group

討 論

早在1966年就有人提出，長(zhǎng)時(shí)間暴露于低強(qiáng)度的短波長(zhǎng)光下會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜損傷，其中波長(zhǎng)范圍在415~455 nm的藍(lán)光屬于有害藍(lán)光[9,10]，這一范圍的短波藍(lán)光又可稱為短波高能藍(lán)光，可透過晶狀體直達(dá)視網(wǎng)膜，觸發(fā)或加重黃斑和視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷。眼睛吸收光線的主要部位是視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（RPE）和視錐、視桿細(xì)胞[11]，因此 LEDs誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷主要發(fā)生在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和視錐、視桿細(xì)胞[11-13]。視錐細(xì)胞和視桿細(xì)胞也稱為光感受器細(xì)胞，作為視網(wǎng)膜主要的感光細(xì)胞，具有較高的能量需求和代謝活性，其主要功能是通過視網(wǎng)膜內(nèi)的感光色素向大腦傳輸視覺色素刺激[14]。藍(lán)光的光毒性可能與老年性黃斑變性和視力喪失的進(jìn)展和嚴(yán)重程度有關(guān)[1]，過度暴露于藍(lán)光下會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織內(nèi)ROS顯著增加，光感受器喪失、脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞凋亡[15]。在一項(xiàng)藍(lán)光對(duì)小鼠視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，藍(lán)光LED暴露3 d后，眼底檢查發(fā)現(xiàn)白斑，組織學(xué)檢查顯示光感受器內(nèi)短和外段連接處有大量物質(zhì)堆積[16]。不僅如此，Lin[17]等人證實(shí)藍(lán)光暴露可刺激視錐、視桿細(xì)胞啟動(dòng)氧化機(jī)制，產(chǎn)生大量自由基，破壞機(jī)體正常氧化還原狀態(tài)的動(dòng)態(tài)平衡，引起線粒體功能障礙和干擾蛋白質(zhì)的正確折疊，最終引起細(xì)胞死亡。本研究借鑒Lin[17]，F(xiàn)eng[18]，Moon[19]等團(tuán)隊(duì)的經(jīng)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組選定波長(zhǎng)峰值450 nm的藍(lán)光燈管，照射強(qiáng)度為2500 lux，每日照射時(shí)間定為12 h，分別照射10 d、20 d、30 d，成功復(fù)制光損傷大鼠視網(wǎng)膜模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藍(lán)光暴露10 d后大鼠視網(wǎng)膜ONL層厚度下降，細(xì)胞凋亡指數(shù)隨時(shí)間增加而增加，證實(shí)了藍(lán)光暴露主要損傷部位為視錐、視桿細(xì)胞[20]。有研究認(rèn)為是先損傷視桿細(xì)胞繼而損傷視錐細(xì)胞[21]，但從本文中無法證實(shí)，還需進(jìn)一步的研究。

圖2 藍(lán)光暴露對(duì)視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡影響的TUNEL法檢測(cè)。比例尺，40μm；ONL，外核層；INL，內(nèi)核層；GCL，節(jié)細(xì)胞層Fig. 2 Detection by TUNEL staining of effect of blue light exposure on apoptosis in retinal tissue. Scale bar, 40 μm; ONL, outer nuclear layer; INL, inner nuclear layer; GCL, ganglion cell layer

氧化應(yīng)激與腎病[21]、血管功能障礙[22]和糖尿病視網(wǎng)膜病變[23]的發(fā)病機(jī)制均有關(guān)，此前也有報(bào)道稱氧化應(yīng)激與光誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性。過量ROS破壞細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，引起DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和碳水化合物的過氧化，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和組織損傷[17]。Nrf2通路是保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的最重要途徑之一，在沒有受到外界氧化應(yīng)激的情況下，Nrf2處于非活性狀態(tài)，存在于細(xì)胞質(zhì)中[25]。當(dāng)細(xì)胞暴露在氧化壓力下時(shí)，Nrf2從Keap1中釋放出來，并移動(dòng)到細(xì)胞核，與位于核內(nèi)的ARE結(jié)合，繼而調(diào)控下游II相解毒酶、抗氧化物酶及抗炎癥蛋白等表達(dá)，如醌氧化還原酶1（NAD（P）H:quinone oxidoreductase l, NQO1)、環(huán)氧化物水解酶、乙醛還原酶、血紅素加氧酶 1 (Heine oxygenase-1, HO-1)、γ‐谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ‐glutamyl cysteinesynthetase, γ‐GCS)，從而發(fā)揮其抗氧化作用。HO-1蛋白聯(lián)合NADPH及細(xì)胞色素P450，通過膽綠素還原酶(biliverdin reductase,BVR)降解血紅素并生成膽綠素、CO和Fe2+，構(gòu)成內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)來調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化、凋亡等多種細(xì)胞的生化活動(dòng)[26]。Yang[27]等發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素可以激活Nrf2的核轉(zhuǎn)位，增加HO-1基因的表達(dá)和谷胱甘肽（glutathione, GSH）的產(chǎn)生，從而減輕藍(lán)光暴露引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，而使用Nrf2抑制劑則阻斷蘿卜硫素的保護(hù)作用，證實(shí)了蘿卜硫素是通過激活Nrf2通路起到保護(hù)作用。本研究中發(fā)現(xiàn)在Nrf2隨著照射時(shí)長(zhǎng)的增加而增多，而其下游因子HO-1含量升高，但與對(duì)照組相比，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并未隨著Nrf2的增加而增加。我們推測(cè)在強(qiáng)度恒定的情況下，藍(lán)光照射要累積達(dá)到一定的照射量才會(huì)引起視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成細(xì)胞凋亡，其中損傷主要發(fā)生在光感受器細(xì)胞層，且損傷程度與照射時(shí)長(zhǎng)成正比，即隨著照射時(shí)間的增加，細(xì)胞凋亡的數(shù)量增多。在這一過程中，視網(wǎng)膜組織內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS促進(jìn)Nrf2活化，使其進(jìn)入細(xì)胞核，發(fā)揮其抗氧化損傷作用從而減少視網(wǎng)膜損傷，但若暴露時(shí)間過長(zhǎng)，可能導(dǎo)致Nrf2/HO-1通路失效，激活其他信號(hào)通路造成損傷，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以證明。

盡管本研究已經(jīng)證實(shí)了藍(lán)光暴露破壞視網(wǎng)膜組織內(nèi)氧化還原的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致視網(wǎng)膜視錐、視桿細(xì)胞損傷、凋亡，激活Nrf2通路以清除自由基，但下游因子HO-1的變化與他人研究不一致，下一步將測(cè)量Nrf2通路其他下游蛋白加以證明光化學(xué)損傷時(shí)是通過何下游蛋白發(fā)揮作用。另外本研究的數(shù)據(jù)皆為半定量，本課題組將以此為基礎(chǔ)，構(gòu)建661W細(xì)胞光化學(xué)損傷模型和大鼠視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷模型，定性測(cè)量細(xì)胞和視網(wǎng)膜組織內(nèi)氧化指標(biāo)，如8-羥基-2-脫氧鳥苷（8-OhdG）、硝基酪氨酸、丙烯醛，ROS含量以及Nrf2通路相關(guān)因子來確定藍(lán)光暴露損傷視網(wǎng)膜的具體機(jī)制。

綜上所述，長(zhǎng)時(shí)間暴露于短波藍(lán)光中使大鼠視網(wǎng)膜厚度下降，ONL厚度下降，主要誘導(dǎo)視錐、視桿細(xì)胞凋亡，激活視網(wǎng)膜組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，使Nrf2、HO-1表達(dá)增加，從而發(fā)揮抗氧化作用以減輕視網(wǎng)膜損傷。