陳雨貝， 孫 瑤

（上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔種植科，上海 200072）

細(xì)胞纖毛是一種突出于細(xì)胞表面的細(xì)胞器，幾乎存在于所有哺乳動物的細(xì)胞表面[1]。細(xì)胞纖毛直徑約200～300 nm，長度約幾微米。它主要由三部分構(gòu)成：延續(xù)于細(xì)胞膜特化的纖毛膜；由中心體和轉(zhuǎn)換纖維組成的纖毛基底部；延續(xù)于中心粒的微管束構(gòu)成的纖毛軸絲[2-3]。細(xì)胞纖毛可以通過介導(dǎo)Hedgehog、Wnt、PDGF等信號通路影響組織的發(fā)育及細(xì)胞功能[4]。這些信號是由細(xì)胞纖毛轉(zhuǎn)運復(fù)合體纖毛轉(zhuǎn)運蛋白（IFT）來傳遞的。纖毛轉(zhuǎn)運復(fù)合體分為IFT-A和IFT-B。IFT-B由14種IFT組成，包括IFT20、IFT22、IFT25、IFT27、IFT46、IFT52、IFT54、IFT57、IFT70、IFT74/IFT72、IFT80、IFT81、IFT88和IFT172，這些蛋白負(fù)責(zé)細(xì)胞纖毛的正向轉(zhuǎn)運。IFT-A由6種IFT組成，包括IFT144、IFT140、IFT139、IFT122、IFT121和IFT43，其中IFT144、IFT140和IFT122組成細(xì)胞纖毛的“核心”，IFT139、IFT121和IFT43組成“外圍”，負(fù)責(zé)細(xì)胞纖毛的逆向轉(zhuǎn)運[5]。IFT的突變會導(dǎo)致纖毛形態(tài)和功能的異常，從而引起多種纖毛病，主要表現(xiàn)為四肢短小、胸部輕度狹窄、失明、腎衰竭、多囊腎、視網(wǎng)膜變性等，并且會導(dǎo)致一系列骨發(fā)育不良，甚至由于骨骼發(fā)育障礙而導(dǎo)致出生后即刻死亡[6]。因此，根據(jù)纖毛病的骨骼表型，多種綜合征被歸類為短肋骨-多指畸形組，包括Verma-Naumoff綜合 征、Majewski綜 合 征、Jeune綜 合 征 及Ellis-van Creveld綜合征[7]。例如，Jeune綜合征表現(xiàn)為短肋骨、短長骨、股骨彎曲及干骺端不規(guī)則[8]。

IFT140是IFT-A的一種核心蛋白，在維持IFT-A的穩(wěn)定性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。IFT140缺失會破壞IFT-A復(fù)合體，導(dǎo)致多種纖毛病。Opitz trigonocephaly C綜合征、美因茨-薩爾迪諾綜合征、Jeune綜合征都已被確定為IFT140突變引起的纖毛病[9]。IFT140突變會導(dǎo)致骨發(fā)育不良、視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良、腎衰竭等[10-11]。因此，了解IFT140在生長發(fā)育中起到的作用對理解纖毛病至關(guān)重要。

傳統(tǒng)的免疫組織化學(xué)染色、免疫熒光染色等只能利用抗體來觀察某一特定時間點IFT140的表達(dá)，并且實驗結(jié)果受限于抗體的特異性。細(xì)胞譜系示蹤技術(shù)不需要抗體，其利用Cre/loxP系統(tǒng)標(biāo)記表達(dá)IFT140的細(xì)胞，并對其后代的增殖、遷移及分化活動進(jìn)行追蹤和動態(tài)觀察，結(jié)果可靠，且可以獲得更多的細(xì)胞遷移和分化信息。因此，建立IFT140-CreER；R26RtdTomato示蹤小鼠模型對于研究IFT140和細(xì)胞纖毛的體內(nèi)功能非常重要。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本實驗先設(shè)計能夠被tamoxifen誘導(dǎo)Cre酶表達(dá)的IFT140-CreER小鼠，由賽業(yè)生物科技有限責(zé)任公司構(gòu)建（圖1A），R26RtdTomato小鼠購買于賽業(yè)生物科技有限責(zé)任公司。對2種小鼠交配后的子代進(jìn)行基因型鑒定后，將其用于后續(xù)實驗?；蜩b定的引物 序 列 為IFT140-CreER-F：5′-CTAATGGTTCCAGTCTGCAGGCCC-3′；IFT140-CreER-R：5′-CAATAAGACCAGGCACATACCATC-3′。小鼠均飼養(yǎng)于同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院SPF級動物室內(nèi)，給予12 h光照和12 h無光飼養(yǎng)環(huán)境，室內(nèi)溫度保持在25 °C，相對濕度為55%，給予自由飲水與飲食。所有動物實驗經(jīng)同濟(jì)大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：TJLAC-017-027）。

1.2 小鼠體內(nèi)示蹤

對IFT140-CreER；R26RtdTomato小鼠行tamoxifen腹腔注射，劑量為0.15 mg/g[12]。IFT140-CreER經(jīng)tamoxifen激活后，雌激素受體 （estrogen receptor，ER）變?yōu)榛钚誀顟B(tài)，暴露出ER的核定位信號，誘導(dǎo)Cre重組酶進(jìn)入核中，行使其剪切功能[13-14]，切除tomato基因序列前2個loxP之間的stop序列。如圖1B所示，此時表達(dá)IFT140的細(xì)胞及其子代可以發(fā)出紅色的熒光。于出生后3 d（P3）的IFT140-CreER；R26RtdTomato小鼠腹腔內(nèi)注射tamoxifen，并在5 d后收樣（P3+5），觀察不同組織中IFT140陽性細(xì)胞的分布情況。于出生后4 d（P4）的IFT140-CreER；R26RtdTomato小鼠腹腔內(nèi)注射tamoxifen，并在注射后3、7、14 d時收樣，觀察在股骨生長發(fā)育過程中，IFT140陽性細(xì)胞的分布與轉(zhuǎn)歸。

圖1 IFT140-CreER;R26RtdTomato示蹤小鼠模型構(gòu)建Figure 1 Generation of IFT140-CreER;R26RtdTomato mouse model

1.3 免疫熒光染色

將IFT140-CreER；R26RtdTomato小鼠處死后用4%多聚甲醛固定24 h，將小鼠的舌、大腦、下頜骨、股骨分離，硬組織用10%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA）脫鈣1周；用15%、30%蔗糖脫水，用OCT（optimal cutting temperature compound）包埋劑對組織進(jìn)行包埋，切成10 μm切片。行4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 （4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）法染色，置熒光顯微鏡（尼康公司，日本）下觀察示蹤結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 IFT140陽性細(xì)胞示蹤小鼠模型的構(gòu)建與鑒定

通過將IFT140-CreER小鼠與R26RtdTomato小鼠交配，得到IFT140-CreER；R26RtdTomato小鼠，對其進(jìn)行基因型鑒定，結(jié)果顯示，IFT140-CreER目標(biāo)條帶為350 bp,野生型條帶為267 bp（圖2）。通過注射tamoxifen，得到IFT140陽性細(xì)胞示蹤小鼠模型。

圖2 IFT140-CreER小鼠基因型鑒定Figure 2 Genotype identification of IFT140-CreER mice

2.2 IFT140-CreER；R26RtdTomato小 鼠 體 內(nèi) 示 蹤IFT140的驗證

對出生后3 d的IFT140-CreER；R26RtdTomato小鼠進(jìn)行tamoxifen腹腔注射，標(biāo)記此時表達(dá)IFT140的細(xì)胞，并在5 d后收樣，發(fā)現(xiàn)在纖毛豐富的組織，如磨牙、切牙、毛囊、鼻腔、大腦、舌中有IFT140陽性細(xì)胞的特異性分布，說明模型構(gòu)建成功（圖3）。因此，通過IFT140-CreER；R26RtdTomato示蹤小鼠模型來觀察IFT140陽性細(xì)胞在小鼠組織中的增殖、遷移和譜系分化是可行的。

圖3 IFT140陽性細(xì)胞在體內(nèi)的分布Figure 3 Distribution of IFT140 positive cells in vivo

2.3 IFT140陽性細(xì)胞在股骨中的表達(dá)

為了動態(tài)探究IFT140陽性細(xì)胞在一次骨化中心發(fā)育過程中的分布變化，選取出生后4 d的小鼠（P4），對其腹腔注射tamoxifen，標(biāo)記此時表達(dá)IFT140的細(xì)胞，并在注射后3 d（P4+3）、7 d（P4+7）、14 d（P4+14）時收樣（圖4A）。小鼠股骨脫鈣后，免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn)，P4標(biāo)記的IFT140陽性細(xì)胞在經(jīng)過3 d的示蹤后，少量分布于骨髓腔內(nèi)及骨小梁表面（圖4B、4E）；在經(jīng)過7 d的示蹤后，骨髓腔內(nèi)及骨小梁表面的IFT140陽性細(xì)胞呈增加趨勢（圖4C、4F）；在經(jīng)過14 d的遷移分化后，骨小梁表面的IFT140陽性信號大量增加，骨皮質(zhì)內(nèi)外膜處也呈現(xiàn)出明顯的IFT140陽性信號（圖4D、4G）。利用Image J軟件對陽性細(xì)胞面積進(jìn)行定量，結(jié)果顯示，在骨發(fā)育的高峰時期，IFT140陽性細(xì)胞面積呈明顯的上升趨勢（圖4H）。

圖4 在股骨發(fā)育早期IFT140陽性細(xì)胞的分布Figure 4 Distribution of IFT140 positive cells in early femur development

3 討論

19世紀(jì)，Charles O.Whitman和他的同事及后輩開創(chuàng)了細(xì)胞譜系示蹤技術(shù)，并通過光學(xué)顯微鏡發(fā)現(xiàn)了無脊椎動物的早期分裂。而發(fā)育從最早的分裂開始，個體細(xì)胞的命運在發(fā)育時是不同的，每個細(xì)胞都會產(chǎn)生在后期發(fā)育中有特定作用的細(xì)胞[15]。同時，它們認(rèn)識到新的細(xì)胞是來源于已經(jīng)存在的細(xì)胞，而不是自發(fā)產(chǎn)生的。目前已經(jīng)發(fā)展出多種方式來對某一特定的細(xì)胞進(jìn)行譜系示蹤，包括轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)基因與基因打靶及內(nèi)源性標(biāo)記的活體示蹤[16]。自20世紀(jì)90年代以來，基因工具的快速發(fā)展徹底改變了譜系示蹤的方法。通過在細(xì)胞中引入熒光蛋白或酶（如半乳糖苷酶和堿性磷酸酶）等遺傳標(biāo)記，各種各樣的細(xì)胞譜系都可以被示蹤。Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)是目前應(yīng)用最為廣泛的譜系示蹤方法，在熒光蛋白的報告基因前插入2個LoxP位點及位點中的停止序列，Cre重組酶可以識別特異的LoxP位點；當(dāng)Cre重組酶被激活時，停止序列被切除，報告基因可以在所有表達(dá)Cre重組酶的細(xì)胞及它們的后代中表達(dá)。Cre重組酶還可以與突變的ER結(jié)合，形成定位于胞質(zhì)中的融合蛋白（Cre-ER），只有在給予tamoxifen后，Cre重組酶才能進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用，從而可以在特定的時間去激活某一類型的細(xì)胞，并使報告基因表達(dá)[17]。

已經(jīng)有許多學(xué)者利用細(xì)胞譜系示蹤技術(shù)研究某一特定分子在小鼠生長發(fā)育中的作用。例如，利用PDGFRβ-P2A-CreER小鼠探究周細(xì)胞在血管生成中的作用[18]；利用Gli1-CreER小鼠發(fā)現(xiàn)了Gli1標(biāo)記著負(fù)責(zé)骨形成與骨修復(fù)的間充質(zhì)祖細(xì)胞[12]；利用Osx-CreER小鼠發(fā)現(xiàn)了Osx標(biāo)記著骨發(fā)育中的祖細(xì)胞[19]。因此，細(xì)胞譜系示蹤技術(shù)是發(fā)現(xiàn)某種關(guān)鍵基因陽性細(xì)胞體內(nèi)功能的重要實驗技術(shù)。上述實驗已經(jīng)證實，利用IFT140-CreER；R26RtdTomato小鼠可以示蹤IFT140陽性細(xì)胞在體內(nèi)的分布。小鼠IFT140突變會導(dǎo)致肋骨側(cè)支、骨化結(jié)節(jié)[8]；而臨床研究表明，人類IFT140突變會導(dǎo)致胸廓狹窄、骨骺狹窄、股骨頸變寬[20]。IFT140突變嚴(yán)重影響了骨發(fā)育，骨發(fā)育需要IFT140的參與。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，IFT140在骨組織中有大量表達(dá)，并且年輕小鼠骨組織中的IFT140表達(dá)量明顯高于老年小鼠[21]。但是上述研究只是靜態(tài)描述某個時間點的IFT140在成骨細(xì)胞中的表達(dá)，還不能全面闡述IFT140陽性細(xì)胞在體內(nèi)的分化特征和潛在功能。

因此，本研究構(gòu)建了IFT140陽性細(xì)胞譜系示蹤小鼠模型，觀察IFT140陽性細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的分布和轉(zhuǎn)歸。結(jié)果顯示，IFT140陽性細(xì)胞在纖毛富集的器官尤其是在牙齒、骨髓腔、骨小梁處均有較明顯的分布，表明體內(nèi)示蹤IFT140陽性細(xì)胞的小鼠模型構(gòu)建成功。利用該示蹤小鼠模型不但可以觀察IFT140陽性細(xì)胞的分布位置，還可以觀察IFT140陽性細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)歸。通過對小鼠股骨發(fā)育不同時間點的示蹤，本課題組發(fā)現(xiàn)，在骨發(fā)育階段，IFT140陽性細(xì)胞的數(shù)目隨著發(fā)育逐漸增多，在骨小梁處的增加越明顯，提示IFT140陽性細(xì)胞的成骨分化傾向較明顯，可能對于骨發(fā)育具有重要意義。未來將通過更長時間的示蹤、單細(xì)胞分析及免疫熒光染色等技術(shù)，結(jié)合成骨細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞的特異性染色，探究IFT140陽性細(xì)胞在骨組織、牙齒生長發(fā)育及疾病發(fā)生過程中所起的作用，進(jìn)而研究IFT140突變導(dǎo)致骨組織和牙齒發(fā)育不良的機(jī)制。該示蹤小鼠模型的建立有利于開展細(xì)胞纖毛調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育、骨骼穩(wěn)態(tài)維持，以及纖毛相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展等的相關(guān)研究。