苗玉迪，胡星星，李艷春*

（1陜西省人民醫(yī)院血液內科，西安 710068；2西安國際醫(yī)學中心醫(yī)院血液病醫(yī)院實驗診斷中心，西安 710018）

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種以骨髓中漿細胞異常增生為特征的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，目前已成為第2大常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。盡管化療、生物制劑、免疫制劑以及自體干細胞移植的應用使得MM的整體生存時間有所提高，但這些手段依然存在毒副作用較大且療效不盡人意的缺陷[2,3]。對MM機制的研究有助于對今后MM治療提供策略，因此，繼續(xù)對MM機制的探索仍十分必要。

近來研究表明，氯通道（chloride channel，ClC）家族蛋白在MM細胞的增殖、命運以及化療敏感性的調節(jié)中發(fā)揮重要作用[4-6]。比如，敲降ClC-3可通過抑制細胞周期運行來降低MM細胞的增殖[4,5]；ClC-5可通過促進自噬減少MM細胞對硼替佐米化療的敏感性[6]。另外，ClC-5在骨肉瘤[7]、膠質瘤[8]和白血病[9]細胞中高表達并參與它們的增殖調控，但ClC-5對MM細胞的影響和機制并不完全清楚。因此，本研究首先檢測ClC-5在MM細胞中的表達情況，并通過ClC-5 siRNA轉染敲降MM細胞中的表達，觀察其細胞活性和凋亡的變化，并分析其機制。

材料與方法

1 細胞、試劑和抗體

外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）和MM細胞系（ARH77、U266和RPMI8266）（武漢普諾賽生命科技有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（德國PAA公司）；DAPI試劑、BCA蛋白濃度檢測試劑盒和ECL化學底物發(fā)光試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）；CCK-8細胞活性檢測試劑盒和Annexin V-FITC/PI雙染色細胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；Lipofectamine 2000試劑（美國Invitrogen公司）；ClC-5 siRNA和陰性對照（NC siRNA）以及小鼠源ClC-5抗體（美國Santa Cruz公司）；Hoechst 33258試劑、RIPA試劑、兔源細胞色素c氧化酶IV亞基（cytochrome c oxidase IV，COX IV）抗體、JC-1染色試劑盒以及線粒體分離試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；Alexa Fluor?488標記的驢抗小鼠IgG（英國Abcam公司）；兔源GAPDH抗體、兔源Cleaved Caspase-3抗體和兔源細胞色素c（cytochrome c，cyt-c）抗體（萬類生物科技有限公司）；HRP標記的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG（武漢博士德生物工程公司）。

2 細胞培養(yǎng)與轉染

將PBMC、ARH77、U266和RPMI8266細胞分別接種在添加有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，按每隔3 d傳代1次的方式進行傳代培養(yǎng)。

3 免疫熒光法觀察細胞中ClC-5表達

將處于對數(shù)生長期的PBMC、ARH77、U266和RPMI8266細胞接種在載玻片上，4%多聚甲醛固定，0.2% Triton X-100透膜2 min，10%山羊血清封閉45 min，滴加1:500稀釋的抗ClC-5抗體并室溫孵育1 h，PBS漂洗2次，再次滴加1:500稀釋的Alexa Fluor?488標記的驢抗小鼠IgG并室溫孵育45 min，PBS漂洗2次，DAPI試劑染核，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

4細胞轉染

取處于對數(shù)生長期的PBMC、ARH77、U266和RPMI8266細胞重新接種于6孔板，用無血清DMEM培養(yǎng)基同步化處理6 h后，將細胞分為對照組（Control）、ClC-5 siRNA轉染組（ClC-5 siRNA）和NC siRNA轉染組（NC siRNA）；ClC-5 siRNA組和NC siRNA組分別通過Lipofectamine 2000試劑對PBMC、ARH77以及U266細胞轉染ClC-5 siRNA或NC siRNA，繼續(xù)培養(yǎng)，Control組直接培養(yǎng)不進行轉染處理。48 h后，用Western blot鑒定轉染效率后用于后續(xù)研究。

5 CCK-8法檢測細胞活性

取各組細胞接種到96孔板中，培養(yǎng)48 h，每孔加10 μL CCK-8試劑并孵育2 h。用酶標儀（德朗DR-200Bs，無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司）讀取450 nm波長處的光密度（A）值。細胞活性=各實驗組A值/對照組組A值×100%。

6 Hoechst 33258染色觀察細胞核形態(tài)

取各組細胞接種在載玻片上，培養(yǎng)48 h后，4%多聚甲醛固定，0.2% Triton X-100透膜2 min，PBS漂洗2次，Hoechst 33258試劑染核，激光掃描共聚焦顯微鏡（FV3000；日本Olympus公司）下（激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長455 nm）觀察。

7 Annexin V-FITC/PI雙染色檢測細胞凋亡

將各組細胞接種在6孔板中，培養(yǎng)48 h后收集細胞。用PBS漂洗2次后并用結合緩沖液重懸1次，混勻。滴加10 μL FITC-Annexin V試劑，室溫避光孵育15 min，再滴加10 μL PI試劑再次室溫避光孵育15 min，用流式細胞儀分析細胞凋亡。

8 JC-1染色檢測線粒體膜電位

取各組細胞接種在載玻片上，培養(yǎng)48 h后，PBS漂洗2次，加入1 mL JC-1染色液室溫避光染色20 min，用JC-1染色緩沖液漂洗1次，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。JC-1單體（monomer）用激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長530 nm觀察，綠色熒光；JC-1聚合物（aggregates）用激發(fā)波長525 nm，發(fā)射波長590 nm觀察，紅色熒光。線粒體膜電位=紅色熒光強度/綠色熒光強度。

9 Western blot檢測蛋白表達

收集PBMC、ARH77、U266和RPMI8266細胞或已處理的各組細胞，按照試劑盒方法，用RIPA提取全蛋白；用線粒體分離試劑盒分別提取線粒體以及去除線粒體后的細胞質蛋白。上述蛋白用BCA法將蛋白濃度統(tǒng)一定量后，然后將各樣品（30 mg蛋白/樣品）進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并分別轉移至聚偏二氟乙烯膜上。在室溫下，用5%牛血清蛋白封閉聚偏二氟乙烯膜上蛋白1 h，然后分別加入抗ClC-5抗體（1:1000）、抗Cleaved Caspase-3抗體（1:1000）、抗cyt-c抗體（1:1000）、抗COX IV抗體（1:10000）和抗GAPDH抗體（1:10000）在4 ℃下孵育過夜。用PBS-Tween 20漂洗3次，然后加入HRP標記山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG（1:1000）室溫下孵育1 h， PBS-Tween 20漂洗3次，加入ECL發(fā)光劑顯影，并用ChemiDoc XRS圖像系統(tǒng)拍攝圖像。用Quantity one軟件檢測各條帶A值，并以GAPDH作為細胞質蛋白或全蛋白內參，COX IV作為線粒體蛋白內參；以目的蛋白條帶與內參蛋白A值的比值為目的蛋白的相對表達水平，對照組目的蛋白相對表達水平為1，計算實驗組目的蛋白相對表達水平的變化倍數(shù)（標準化）。

10 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標準差，用SPSS 19.0軟件采用單因素方差分析事后Tukey檢驗法對所有數(shù)據(jù)進行多重比較，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。RPMI8266 cells (scale bar, 20 μm). B，Western blotting for the expression of ClC-5 in PBMC, ARH77, U266 and RPMI8266 cells; C, statistical analysis of the expression level of ClC-5 in PBMC, ARH77, U266 and RPMI8266 cells (*P<0.05 vs PBMC cell; n=3)

結 果

1 MM細胞高表達ClC-5

免疫熒光檢測顯示：ClC-5在PBMC細胞與MM細胞株（ARH77、U266和RPMI8266）中均有表達，且相對于PBMC細胞，ClC-5在MM細胞株中熒光強度更強（圖1A）。進一步通過Western blot證實，MM細胞株中ClC-5的表達水平明顯高于PBMC細胞（圖1B和圖1C）。

圖1 ClC-5在PBMC細胞與MM細胞株中的表達。A，ClC-5在PBMC、ARH77、U266和RPMI8266細胞中表達的免疫熒光染色（比例尺，20 μm）。B，ClC-5在PBMC、ARH77、U266和RPMI8266細胞中表達的Western blot檢測；C，PBMC、ARH77、U266和RPMI8266細胞中ClC-5表達水平的統(tǒng)計學分析（與PBMC細胞比較，*P<0.05，n=3）Fig. 1 Expression of ClC‐5 in PBMC cell and MM cell lines. A, immunofluorescence staining of the expression of ClC‐5 in PBMC, ARH77, U266 and

2 敲降ClC-5抑制MM細胞活性

Western blot檢測顯示，ClC-5 siRNA轉染能有效敲降PBMC細胞與MM細胞株（ARH77和U266）中ClC-5表達（圖2A、2B）。CCK-8法細胞活性檢測顯示，敲降ClC-5能抑制ARH77和U266細胞的活性，但對PBMC細胞的細胞活性無影響（圖2C）。

圖2 敲降ClC-5對MM細胞活性的影響。A，ClC-5 siRNA敲降ClC-5效率的Western blot檢測；B，ClC-5 siRNA敲降ClC-5效率的統(tǒng)計學分析。C，敲降ClC-5對MM細胞活性影響的CCK-8法檢測。與對照組比較，*P<0.05，n=3Fig. 2 Effect of ClC‐5 knockdown on the viability of MM cells. A, Western blot detection of ClC‐5 knockdown efficiency by ClC‐5 siRNA; B, statistical analysis for ClC‐5 knockdown efficiency by ClC‐5 siRNA; C, CCK‐8 assay for the effect of knocking down ClC‐5 on the activity of MM cells. *P<0.05 vs Control group, n=3

3 敲降ClC-5促進MM細胞凋亡

Hoechst 33258染色顯示，在ARH77和U266細胞中，對照組和NC siRNA組細胞核正常，而ClC-5 siRNA組細胞核的部分染色質出現(xiàn)高度凝聚的亮藍色熒光顆粒（圖3A）。Annexin V-FITC/PI雙染色流式細胞術檢測顯示，敲降ClC-5能促進ARH77和U266細胞凋亡（圖3B、C）。

圖3 敲降ClC-5對MM細胞凋亡的影響。A，細胞凋亡的Hoechst 33258染色檢測（比例尺，20 μm）。B，細胞凋亡的Annexin V-FITC/PI雙染色流式細胞術檢測；C，Annexin V-FITC/PI雙染色流式細胞術檢測細胞凋亡的統(tǒng)計學分析（與對照組比較，*P<0.05，n=3）Fig. 3 Knockdown of ClC-5 promoted MM cells apoptosis. A, the nuclear morphology of cells in each group was observed by Hoechst 33258 staining(scale bar, 20μm); B, apoptosis of cells in each group was detected by flow cytometry with Annexin V‐FITC/PI double staining; C, statistical analysis for apoptosis detected by Annexin V‐FITC/PI double staining flow cytometry (*P<0.05 vs Control group, n=3)

4 敲降ClC-5降低MM細胞的線粒體膜電位

JC-1染色顯示，在ARH77和U266細胞中，與對照組比較，ClC-5 siRNA組細胞的線粒體膜電位明顯降低（圖4）。

圖4 敲降ClC-5對MM細胞線粒體膜電位的影響。A，U266細胞線粒體膜電位JC-1染色檢測；B，敲降ClC-5對U266細胞線粒體膜電位影響的統(tǒng)計學分析。C，ARH77細胞線粒體膜電位JC-1染色；D，敲降ClC-5對ARH77細胞線粒體膜電位影響的統(tǒng)計學分析。比例尺，40 μm。與對照組比較，*P<0.05，n=3Fig. 4 The effect of knocking down ClC‐5 on the mitochondrial membrane potential of MM cells. A, detection of mitochondrial membrane potential by JC‐1 staining in U266 cells; B, statistical analysis for the effect of knocking down ClC‐5 on mitochondrial membrane potential of U266 cells; C,detection of mitochondrial membrane potential by JC‐1 staining in ARH77 cells; D, statistical analysis for the effect of knocking down ClC‐5 on mitochondrial membrane potential of ARH77 cells. Scale bar, 40 μm. *P<0.05 vs Control group, n=3.

5 敲降ClC-5促進MM細胞cyt-c釋放和Cleaved Caspase-3表達

Western blot檢 測 敲 降ClC-5對cyt-c釋 放 和Cleaved caspase-3表達的影響顯示（圖5），在MARH77和U266細胞中，與對照組比較，ClC-5 siRNA組細胞線粒體中cyt-c水平明顯降低，而細胞質中cyt-c水平明顯升高，表明敲降ClC-5能促進MM細胞的線粒體cyt-c釋放到細胞質；ClC-5 siRNA組細胞中Cleaved caspase-3水平較對照組明顯升高。

圖5 敲降ClC-5對MM細胞cyt-c釋放和Cleaved Caspase-3表達的影響。A，U266細胞cyt-c釋放和Cleaved Caspase-3表達的Western blot檢測；B，U266細胞cyt-c釋放和Cleaved Caspase-3水平的統(tǒng)計學分析。C，ARH77細胞cyt-c釋放和Cleaved Caspase-3表達的Western blot檢測；D，ARH77細胞cyt-c釋放和Cleaved Caspase-3水平的統(tǒng)計學分析。與對照組比較，*P<0.05，n=3Fig. 5 The effect of knocking down ClC‐5 on cyt‐c release and Cleaved Caspase‐3 expression in MM cells. A, Western blot detection for cyt‐c releaseand Cleaved Caspase-3 expression of U266 cells; B, statistical analysis for cyt-c release and Cleaved Caspase-3 level of U266 cells; C, Western blot detection for cyt-c release and Cleaved Caspase-3 expression of ARH77 cells; D, statistical analysis for cyt-c release and Cleaved Caspase-3 level of ARH77 cells. *P<0.05 vs Control group; n=3.

討 論

目前，MM的發(fā)病和進展機制并不完全清楚，同樣MM的治療策略也不盡人意[2,3]。闡明MM的發(fā)病與進展機制有利于今后的MM的治療策略的制定。有研究[4-6]報道，ClC通道在MM細胞的增殖和存活中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。ClC-5作為ClC氯通道的關鍵分子，其已被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤的進展中發(fā)揮重要作用[7-9]。本研究顯示，ClC-5在MM細胞中呈現(xiàn)特異性高表達，敲降ClC-5表達能抑制MM細胞的細胞活性并促進細胞凋亡，且不影響PBMC細胞的細胞活性，提示敲降ClC-5可能是潛在且有前景的MM的治療策略。

本研究進一步對敲降ClC-5抑制MM細胞存活的機制進行了探索。線粒體凋亡通路是細胞凋亡通路的主要途徑之一。線粒體膜電位降低，引起線粒體超極化，線粒體轉運孔開放，并釋放cyt-c，導致細胞中caspase-3激活，最終導致凋亡的發(fā)生[10,11]。且已有文獻[12]報道，敲降ClC-5能通過線粒體通路促進谷氨酸誘導的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡。本研究結果顯示，敲降ClC-5能導致MM細胞株（ARH77和U266）的線粒體膜電位降低，促進線粒體中cyt-c釋放到細胞質，并促進細胞中Cleaved Caspase-3升高，表明敲降ClC-5能通過線粒體凋亡途徑誘導MM細胞凋亡。

綜上所述，ClC-5在MM細胞中異常高表達，敲降ClC-5能抑制MM細胞增殖并誘導凋亡，且這一作用可能與其激活線粒體凋亡通路相關。