王柯尹, 魏大海, 鄒卓林, 孫丹鳳, 徐艷麗

急性肝衰竭(acute liver failure， ALF)是由病毒、藥物、飲酒等誘發(fā)的肝細(xì)胞大量變性、壞死，臨床以極度乏力、黃疸、凝血異常、肝性腦病等為主要表現(xiàn)的疾病，具有起病急、病情重和病死率高等特征，尚無特效治療藥物和方法[1]。因此，深入研究ALF的發(fā)病機(jī)制及尋找有效的治療方法顯得尤為重要。目前，免疫介導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的大量釋放是ALF發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。另有研究[2-3]表明，氧化應(yīng)激能激活相關(guān)信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞因子、趨化因子等水平，在炎癥、慢性肝病、腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。核因子E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2， Nrf2)是抗氧化應(yīng)激中參與多種蛋白表達(dá)的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄激活因子，可與血紅素氧合酶-1(heme oxygenase 1, HO-1)等抗氧化酶組成Nrf2/HO-1信號(hào)通路，在維持細(xì)胞氧化還原及內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[4]。髓過氧化物酶(myeloperoxidase， MPO)又稱過氧化物酶，屬于血紅素過氧化物酶，可催化產(chǎn)生各種有氧化作用的自由基，在調(diào)節(jié)炎癥、氧化應(yīng)激和血管內(nèi)皮損傷中起著重要作用[5]。MPO和 Nrf2/HO-1信號(hào)通路都與組織損傷過程中的氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)，但是其在ALF中的具體分子機(jī)制目前尚不明確。本研究旨在探討 MPO 和 Nrf2/HO-1 信號(hào)通路協(xié)同在ALF大鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮的作用，為ALF臨床預(yù)防和治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 選取SPF級(jí)SD雄性大鼠48只(體質(zhì)量 200～220 g)，由浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[許可證號(hào)：SCXK(浙)2019-0001]，操作符合中華人民共和國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例規(guī)定。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審核(倫理審批件文號(hào):LS2019-047)。D-GalN和LPS購自上海阿拉丁生物制品有限公司(貨號(hào): G115553、L118716)；MPO試劑盒購自南京建成生物醫(yī)學(xué)工程研究所(貨號(hào)：A044-1-1)；ELISA試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；MPO、Nrf2和HO-1抗體購自Affinity生物科學(xué)公司(貨號(hào)：22225-1-AP、AF0639、AF5393)；β-actin抗體、二抗購自上海威奧生物科技公司(貨號(hào)：WB0196、WB0176)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 SD大鼠12 h晝夜交替飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前 1 d 下午禁食，飲水不限，據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分組:對(duì)照組(n=12)，腹腔注射與ALF組等量的生理鹽水；ALF組(n=36)：D-GalN 加入生理鹽水稀釋到10%濃度，NaOH調(diào)節(jié) pH 至7.0，腹腔注射 D-GalN 800 mg/kg和LPS 8 μg/只。注射后 6、12、24 h給予10%水合氯醛麻醉，采門靜脈血3～5 mL，3000 r/min離心10 min，上清液備用，取肝臟標(biāo)本。

1.3病理檢查和相關(guān)檢測(cè)

1.3.1 病理檢查 肝臟標(biāo)本經(jīng)甲醛固定，脫水，石蠟包埋，HE染色后在顯微鏡下觀察。全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)生化指標(biāo)。ELISA法檢測(cè)血清 MPO、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和 白細(xì)胞介素-6(IL-6)水平，參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.2 mRNA檢測(cè) Trizol法提取肝組織RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。Nrf2正反向引物序列為CTGGCTGATACTACCGCTGTT和GTGGAGAGGATGCTGCTGAA;HO-1正反向引物序列為TTTCACCTTCCCGAGCATC和TTAGCCTCTT CTGTCACCCTGT；β-actin正反向引物序列為ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC和CACCTTC TACAATGAGCTGCGTGTG，以β-actin為內(nèi)參，檢測(cè) Nrf2 和 HO-1在肝組織中的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。

1.3.3 Western blot 法檢測(cè)蛋白 取肝組織 100 mg 提取蛋白，按照試劑盒說明操作，煮沸上樣液使蛋白變性后進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜放入 5%脫脂奶粉封閉 2 h，洗膜后加入MPO、Nrf2、HO-1和β-actin 抗體，于 4 ℃孵育過夜，TBST洗膜 5 min×3次，二抗(1∶2000)室溫孵育 1 h，洗膜后化學(xué)發(fā)光顯色。

1.3.4 MPO測(cè)定 取肝組織用冷生理鹽水漂洗，干燥，組織勻漿，離心取上清液，采用比色法測(cè)定，按照試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果

2.1肝組織病理 對(duì)照組肝小葉規(guī)則，肝索排列有序，未見肝細(xì)胞變性、壞死。ALF 組 6 h 時(shí)開始出現(xiàn)肝竇淤血改變，少量肝細(xì)胞輕度腫脹、壞死。可見少許炎細(xì)胞；12 h 時(shí)大鼠肝臟結(jié)構(gòu)破壞明顯，空泡化，細(xì)胞核碎裂，大片細(xì)胞壞死，幾乎見不到正常肝細(xì)胞，肝小葉形態(tài)紊亂，肝索斷裂，炎癥程度嚴(yán)重；24 h時(shí)肝細(xì)胞嚴(yán)重水泡變性，肝小葉明顯破壞，肝竇見大片充血，但相對(duì)于12 h有所緩解。見圖1。

注：A為肝組織形態(tài)；B為肝組織HE染色(×100)；ALF為急性肝衰竭

2.2血清肝功能 ALF組6、12 h血清總膽紅素(TBiL)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平顯著升高，且12 h 達(dá)到峰值，24 h 有所下降，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清TBiL、ALT及AST水平比較

2.3血清MPO和相關(guān)炎癥因子 與對(duì)照組比較，ALF組血清MPO表達(dá)于造模后12 h為最高(65.75±7.02)，24 h后相對(duì)下降(53.92±5.63)；ALF組血清TNF-α于造模后6 h達(dá)高峰(102.17±14.80)，12 h開始下降(83.33±11.22)，24 h繼續(xù)下降(64.25±9.29)，高于對(duì)照組(11.30±3.26)；IL-6于造模后6 h升高最明顯(89.25±10.86)，12 h后逐漸下降(77.33±8.02)，24 h為(65.58±7.31)，但高于對(duì)照組(10.83±2.92)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

注：ALF為急性肝衰竭；MPO為髓過氧化物酶；TNF-α為腫瘤壞死因子-α；IL-6為白細(xì)胞介素-6；與對(duì)照組比較，**P<0.01

2.4肝組織MPO活性 ALF組肝組織MPO活性明顯高于對(duì)照組，其活性程度受 D-GalN/LPS 誘導(dǎo)后的時(shí)間變量影響，且呈逐漸增高趨勢(shì)。ALF組誘導(dǎo)后12 h 達(dá)最高值，為(28.08±4.65) U/g，與對(duì)照組(12.17±1.26)U/g比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖3。

注：ALF為急性肝衰竭；MPO為髓過氧化物酶；與對(duì)照組比較，**P<0.01

2.5肝組織Nrf2和HO-1 mRNA水平 與對(duì)照組比較，ALF組肝組織Nrf2和HO-1 mRNA水平明顯增加，其中12 h為最高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖4。

注：ALF為急性肝衰竭；Nrf2為核因子E2相關(guān)因子2；HO-1為血紅素氧合酶-1；與對(duì)照組比較，**P<0.01

2.6肝組織MPO、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá) 對(duì)照組肝組織有少量 MPO、Nrf2 和 HO-1表達(dá)，ALF組 MPO、Nrf2 和 HO-1蛋白表達(dá)量在造模后 6 h 逐漸增加，于12 h達(dá)高峰，24 h開始下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖5。

注：ALF為急性肝衰竭；MPO為髓過氧化物酶；Nrf2為核因子E2相關(guān)因子2；HO-1為血紅素氧合酶-1；與對(duì)照組比較，**P<0.01

3 討論

ALF發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，炎癥刺激、內(nèi)毒素血癥和肝細(xì)胞能量代謝障礙均起重要作用[6]。近年來氧化應(yīng)激在肝臟疾病中的作用越來越受到重視。氧化應(yīng)激能夠激活一系列信號(hào)通路,引起相關(guān)連鎖反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡蛋白酶，使肝細(xì)胞大量凋亡[7]。研究氧化應(yīng)激通路及其影響因素可能對(duì)ALF的發(fā)生機(jī)制和防治具有重要意義。

MPO是介導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要蛋白酶，主要存在于中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和肝Kupffer細(xì)胞等，參與如敗血癥、脂肪肝、冠心病等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展[8-10]。正常生理狀態(tài)下，MPO具有強(qiáng)效殺滅病原微生物作用，可通過產(chǎn)生次氯酸鹽破壞病原體，保護(hù)組織器官免受侵襲。但當(dāng)機(jī)體處于炎癥反應(yīng)狀態(tài)時(shí)，中性粒細(xì)胞便會(huì)受刺激產(chǎn)生大量 MPO，誘發(fā)釋放過量活性氧(ROS)，機(jī)體氧化和抗氧化作用失去平衡，引起細(xì)胞功能和穩(wěn)態(tài)受損，ROS還可被 Toll 樣受體識(shí)別，激活相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)IL-6、TNF-α等釋放，干擾細(xì)胞正常生理功能[11]。Kremserova 等[12]在 LPS 誘導(dǎo)肺損傷的模型中，發(fā)現(xiàn)敲除 MPO 后 IL-6、干擾素-γ等水平明顯下降，炎癥反應(yīng)減輕。本研究顯示，ALF組 MPO、TNF-α、IL-6水平均高于對(duì)照組(P<0.01)，且ALF組大鼠肝組織MPO活性明顯高于對(duì)照組，至誘導(dǎo)后12 h 達(dá)最高值，提示D-GalN/LPS損傷肝細(xì)胞后代謝物激活單核巨噬細(xì)胞釋放多種補(bǔ)體、細(xì)胞因子，在炎癥介質(zhì)作用下，MPO含量及活性增加，再參與炎癥，形成氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、組織細(xì)胞損傷的惡性循環(huán)，加重肝損傷。

Nrf2 是在抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中調(diào)控多種蛋白表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄激活因子，在減輕氧化應(yīng)激及炎癥引發(fā)的機(jī)體損傷中發(fā)揮重要作用[13]。研究[14]表明，Nrf2在HSCs和Kupffer細(xì)胞及實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞中均可被激活，在肝臟炎癥、肝細(xì)胞凋亡和再生中發(fā)揮著復(fù)雜的作用。Lamle等[14]給Nrf2基因敲除小鼠酒精飲食后，發(fā)現(xiàn)小鼠死亡率上升，肝細(xì)胞脂肪變性加重，毒性產(chǎn)物增多，提示 Nrf2 在酒精性肝病中對(duì)肝細(xì)胞起保護(hù)作用。HO-1是一種在應(yīng)激狀態(tài)下可迅速激活細(xì)胞發(fā)揮抗炎、抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡等作用的重要因子[15]。Nrf2/HO-1 信號(hào)通路的激活可調(diào)控炎癥細(xì)胞的募集，在抗氧化和抗炎反應(yīng)之間提供平衡點(diǎn)，維持機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)[16]。目前，MPO是否可通過氧化應(yīng)激及炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié) Nrf2/HO-1 信號(hào)通路影響ALF的發(fā)生尚不明確。

Nrf2/HO-1作為新近發(fā)現(xiàn)的抗氧化應(yīng)激和抵抗炎癥刺激的防御性信號(hào)通路，在肝細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。MPO是參與氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵酶，可通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化應(yīng)激信號(hào)通路。研究[17]顯示，MPO與中性粒細(xì)胞膜上相關(guān)物質(zhì)結(jié)合，可能導(dǎo)致 p38 促分裂原活化蛋白激酶(MAKP)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和磷酸酰肌醇-3-激酶(PI3K)磷酸化，細(xì)胞脫顆粒增加，促使ROS產(chǎn)生。而最近的研究[18]認(rèn)為，MAKP、ERK和 PI3K/AKT 等上游激酶均可促進(jìn) Nrf2與Keap蛋白解離，誘導(dǎo)下游HO-1等多種抗氧化保護(hù)性基因，啟動(dòng)抗氧化連級(jí)反應(yīng)。Jiang等[19]的研究也發(fā)現(xiàn)，Nrf2受 PI3K/AKT信號(hào)通路的調(diào)控發(fā)揮一系列正常的生理學(xué)作用。本研究結(jié)果顯示，ALF組血清IFN-α、IL-6水平于6 h達(dá)到峰值，MPO、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)均于造模 6 h 升高，12 h 最明顯，后逐漸下降，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。TNF-α和 IL-6 水平變化趨勢(shì)與肝臟 MPO、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)一致，但時(shí)間略早，考慮為機(jī)體發(fā)生肝衰竭時(shí)TNF-α、IL-6等多種炎性介質(zhì)浸潤，促進(jìn)MPO等氧化因子釋放，相關(guān)蛋白激酶被激活，誘導(dǎo)ROS等的產(chǎn)生，刺激 Nrf2/HO-1通路，從而通過抗氧化應(yīng)激對(duì)ALF中炎癥反應(yīng)和組織損傷發(fā)揮保護(hù)作用，提示 MPO與Nrf2/HO-1信號(hào)通路在整個(gè)ALF過程中形成了多個(gè)相互影響的復(fù)雜關(guān)系，但其具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

總之，本研究建立D-GalN/LPS誘導(dǎo)大鼠ALF模型，進(jìn)一步檢測(cè)與炎癥因子密切相關(guān)的MPO、Nrf2 和 HO-1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MPO 蛋白表達(dá)和 Nrf2/HO-1信號(hào)通路激活程度可以判斷 D-GalN/LPS誘導(dǎo)ALF大鼠的肝損傷嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果不僅對(duì)氧化應(yīng)激及炎癥在ALF進(jìn)展過程中扮演的角色進(jìn)行多系統(tǒng)的研究，而且還有助于加深對(duì)ALF發(fā)病分子機(jī)制的理解，為評(píng)估ALF肝臟損傷程度及臨床治療奠定了基礎(chǔ)。