楊祥，喬海軍，楊曉麗，文鵬程，汪月，張衛(wèi)兵,*，張忠明,*

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)2(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)3(甘肅省商業(yè)科技研究所有限公司，甘肅 蘭州，730000)

凝乳酶是干酪生產(chǎn)過(guò)程中的關(guān)鍵酶，能夠使牛奶凝固并在干酪成熟過(guò)程中起著不可替代的作用[1]。凝乳酶的凝乳過(guò)程包括2個(gè)階段：第一階段是對(duì)κ-酪蛋白Phe105-Met106連接的肽鍵進(jìn)行水解，暴露出內(nèi)部的α-酪蛋白和β-酪蛋白；第二階段是在Ca2+作用下，酪蛋白分子間形成化學(xué)鍵，并聚集形成三維網(wǎng)狀凝膠[2]。小牛凝乳酶是最早應(yīng)用于干酪制作的，然而隨著干酪的市場(chǎng)需求不斷增加，小牛凝乳酶逐漸供不應(yīng)求，人們不得不尋找其替代品[1,3]。駱駝凝乳酶、羔羊凝乳酶、豬胃蛋白酶等動(dòng)物源凝乳酶都具有較好的凝乳活力，它們的蛋白水解力較小，制作的干酪苦味小，風(fēng)味和品質(zhì)也較好。帕爾瑪奶酪、高山奶酪、埃門(mén)塔爾奶酪等很多高品質(zhì)的干酪都使用動(dòng)物源凝乳酶進(jìn)行制作[4]。動(dòng)物源凝乳酶替代品中，駱駝凝乳酶與小牛凝乳酶分子結(jié)構(gòu)差異很小，但其凝乳活力要高于小牛凝乳酶，且蛋白水解力只有小牛凝乳酶的30%[5]。羔羊凝乳酶的凝乳活力低于小牛凝乳酶，但具有更高的pH穩(wěn)定性[6]；水牛皺胃酶的凝乳活力較低，其穩(wěn)定性和蛋白水解力與小牛凝乳酶差別不大[7]；此外，從甲殼類昆蟲(chóng)Munida中提取出的凝乳酶也可應(yīng)用于奶酪制作[8]。昆蟲(chóng)的物種豐富，數(shù)量眾多，是凝乳酶開(kāi)發(fā)的良好資源，然而，在現(xiàn)有動(dòng)物源凝乳酶中，昆蟲(chóng)凝乳酶少有報(bào)道。

黃粉蟲(chóng)(Tenebriomolitor)，是鞘翅目擬步行蟲(chóng)科粉甲屬的昆蟲(chóng)，常被用作動(dòng)物飼料。近年來(lái)，將昆蟲(chóng)尤其是黃粉蟲(chóng)作為動(dòng)物蛋白納入食品行業(yè)受到歐洲重點(diǎn)關(guān)注[9]。與其他動(dòng)物一樣，在黃粉蟲(chóng)的腸道中也存在很多蛋白酶。ELPIDINA等[10]在黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)的后中腸中提取出胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶，并測(cè)定了其酶學(xué)性質(zhì)和N端序列；CRISTOFOLETTI等[11]在黃粉蟲(chóng)中腸中提取出組織蛋白酶L樣蛋白酶(calpain,CAL)，測(cè)定了其氨基酸序列并預(yù)測(cè)了其活性位點(diǎn)和功能；BETON等[12]在中腸中也提取得到CAL，進(jìn)一步模擬出了酶的3D結(jié)構(gòu)模型；馬勇等[13]研究發(fā)現(xiàn)將黃粉蟲(chóng)漿加入牛奶后，很快會(huì)發(fā)生凝乳現(xiàn)象，但對(duì)其凝乳機(jī)理未做進(jìn)一步的研究。本研究從黃粉蟲(chóng)體中提取和分離純化出凝乳蛋白酶，鑒定出該酶的氨基酸序列，并對(duì)其結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行預(yù)測(cè)，以期為黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶在的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃粉蟲(chóng)，山東省德州市平原十號(hào)路市場(chǎng)；DEAE-Sepharose FF、Sephadex G75，上海源葉生物科技有限公司；0.45 μm濾膜，上海光譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司；蛋白Marker，上海索萊寶生物科技有限公司；玻璃勻漿器，上海澤葉生物科技有限公司；丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)，北京酷來(lái)搏科技有限公司；甲叉雙丙烯酰胺，上海中泰化學(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)G250、考馬斯亮藍(lán)R250，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；其他常用生化試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TD5A-WS高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HL-2B恒流泵、BSZ-160自動(dòng)部分收集器，上海滬西分析儀器廠；SCIENTZ-10 ND真空冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司；質(zhì)譜儀Q Exactive HF、液相Easy nLC/ Ultimate 3000、色譜柱C18(1.9 mm，150 μm×120 mm)、色譜預(yù)柱C18(3 mm,100 μm×20 mm)， 美國(guó)Thermo Scientific公司；電泳儀、電泳自動(dòng)成像儀，美國(guó)Bio-Rad公司；PPSQ-33A島津全自動(dòng)蛋白質(zhì)多肽測(cè)序儀，日本SHIMADZU公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 黃粉蟲(chóng)腸道蛋白組分析

將四齡的黃粉蟲(chóng)置于一塊含0.9% NaCl的冰上切去其頭和尾，從任意一端取出腸道，與pH 6.5的Tris-HCl緩沖液充分混合后，加入玻璃勻漿器中勻漿；將得到的勻漿液4 ℃、10 000×g離心20 min，收集上清液并用0.45 μm濾膜進(jìn)行微濾，收集濾液[14]；將濾液送往北京市百邁客生物科技有限公司進(jìn)行LC-MS/MS分析，并對(duì)得到的碎片肽段序列進(jìn)行定性和定量分析以及功能注釋，建立黃粉蟲(chóng)腸道蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3.2 黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶提取與分離純化

將黃粉蟲(chóng)腸道經(jīng)勻漿、離心、微濾后得到濾液，然后對(duì)其進(jìn)行純化。首先，使用弱陰離子交換柱DEAE-Sepharose FF進(jìn)行離子交換層析[15]：用pH 6.5的0.02 mol/L Tris-HCl作為平衡緩沖液平衡3～5個(gè)柱體積，平衡流速為1 mL/min；用0～0.6 mol/L NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫液用平衡緩沖液配制，洗脫流速為0.5 mL/min[16]。收集具有凝乳活力的洗脫液并用3 kDa超濾離心管進(jìn)行濃縮，將濃縮液作為上樣樣品，使用葡聚糖凝膠Sephadex G75色譜柱(1.6 cm×20 cm)進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析：用pH 6.0的0.02 mol/L Tris-HCl作為平衡緩沖液平衡4～5個(gè)柱體積，平衡流速為1 mL/min；用平衡緩沖液進(jìn)行洗脫分離，洗脫流速為0.25 mL/min；收集具有高凝乳活力的洗脫液，得到純化的凝乳酶，冷凍干燥后保存在-80 ℃下。通過(guò)SDS-PAGE驗(yàn)證凝乳酶的純度，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量。

1.3.3 N端15個(gè)氨基酸序列測(cè)定

采用Edman降解法測(cè)定該酶的N端15個(gè)氨基酸[10]；。將凍干的樣品用pH 6.0的Tris-HCl緩沖液溶解，取20 μL溶液樣品進(jìn)行12% SDS-PAGE后，將SDS-PAGE膠電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，并用麗春紅染色。剪取相應(yīng)膜放置到反應(yīng)器中，組裝好反應(yīng)器后將其放置于儀器固定位置，通過(guò)島津全自動(dòng)蛋白質(zhì)多肽測(cè)序儀(PPSQ-33A)對(duì)樣品N端序列進(jìn)行分析。通過(guò)軟件PPSQ-30 Analysis設(shè)置：樣品名稱、樣品號(hào)、測(cè)試循環(huán)數(shù)、選擇方法文件，設(shè)置完成后開(kāi)始測(cè)試，最終確定該酶N端15個(gè)氨基酸。利用該酶的N端15個(gè)氨基酸序列與黃粉蟲(chóng)腸道蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)搜索出同源蛋白。

1.3.4 凝乳酶活力測(cè)定

參照ARIMA等[17]的方法，將含有10 mmol/L CaCl2的10%脫脂乳于35 ℃水浴中孵育15 min，再按質(zhì)量比1∶10加入黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶，充分混勻后，記錄下容器壁出現(xiàn)絮狀顆粒所需要的時(shí)間，即為凝乳時(shí)間。凝乳活力的單位為索氏單位，1個(gè)索氏單位表示在35 ℃下，40 min內(nèi)凝結(jié)1 mL底物所需要的酶量。凝乳活力計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：MCA為凝乳活力(milk clotting activity)，t為凝乳時(shí)間，s。

1.3.5 蛋白水解力測(cè)定

參照Z(yǔ)HAO等[18]的方法進(jìn)行測(cè)定并略作修改。樣品的測(cè)定方法為：取1 mL樣品在40 ℃水浴2 min，然后加入1 mL 1%酪蛋白溶液反應(yīng)10 min，再加入2 mL 0.4 mmol/L三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，靜置10 min后過(guò)濾溶液并取1 mL濾液在660 nm處測(cè)定吸光值。蛋白水解力的單位為U，1 U表示1 mL酶在1 min內(nèi)水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需要的酶量。樣品的蛋白水解力(proteolytic activity，PA)計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：A660為樣品在660 nm處的吸光值，4為反應(yīng)試劑總體積，1/10為反應(yīng)時(shí)間10 min，以1 min計(jì)算，K為吸光常數(shù)，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上，吸光值為1時(shí)對(duì)應(yīng)的酪氨酸濃度，n為稀釋倍數(shù)。

1.3.6 黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)采用 BLAST 程序查找與其相似的蛋白酶序列，并與黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶進(jìn)行比較分析。

1.3.7 黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

參考 SOLEYMANZADEH等[19]的方法計(jì)算和預(yù)測(cè)黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶的理化特性。利用肽特性計(jì)算器(https://pepcalc.com/)確定酶的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)(isoelectric point，PI)和凈電荷；利用ExPASy ProtParam工具(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam /protparam)預(yù)測(cè)酶的不穩(wěn)定性指數(shù)(不穩(wěn)定性指數(shù)<40預(yù)示該肽可能是穩(wěn)定的，不穩(wěn)定性指數(shù)>40則預(yù)示蛋白質(zhì)或肽可能不穩(wěn)定)[20]；使用肽工具(https://www.peptide2.com)確定酶的疏水性氨基酸比例。

1.3.8 黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

以黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶的一級(jí)序列為基礎(chǔ)，使用PSSFinder工具預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)(http://linux1.softberry.com/ berry)[21]。

1.3.9 凝乳酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

以黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，運(yùn)用I-TASSER On-line Server預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)和B-factor(http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER)。利用COACH服務(wù)器和預(yù)測(cè)到的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)該酶的活性位點(diǎn)，并以TM-score和Cov作為置信度的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃粉蟲(chóng)腸道蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

從樣品中共鑒定到1 207種黃粉蟲(chóng)腸道蛋白質(zhì)及其完整氨基酸序列，其中發(fā)掘出98種新蛋白。建立了黃粉蟲(chóng)腸道蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，將測(cè)序數(shù)據(jù)上傳至ProteomeXchange數(shù)據(jù)庫(kù)，存儲(chǔ)編號(hào)為PXD029111。鑒定到的蛋白涉及的主要代謝通路為碳代謝(ko01200)、氧化磷酸化(ko00190)、糖酵解/糖異生(ko00010)、半乳糖代謝(ko00052)以及多種氨基酸代謝；主要功能包括轉(zhuǎn)移酶活性(GO:0016740)、催化活性(GO:0003824)、單體碳水化合物代謝過(guò)程(GO:0044723)、酶調(diào)節(jié)器活性(GO:0030234)等。

2.2 黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶提取與分離純化

如圖1-a所示，粗酶液經(jīng)離子交換層析后，共洗脫出6個(gè)蛋白峰，其中第1、第2和第3個(gè)峰沒(méi)有肩峰，表明雜蛋白很少，而后面3個(gè)峰都有肩峰，說(shuō)明存在較多的雜蛋白，蛋白并沒(méi)有徹底被分開(kāi)。在第一個(gè)蛋白峰的位置出現(xiàn)了具有高凝乳活力的蛋白，而這個(gè)位置是采用0 mmol/L NaCl的洗脫液洗脫的，說(shuō)明該酶無(wú)法被陰離子交換柱吸附。將高凝乳活力的蛋白收集、濃縮，得到了部分純化的凝乳酶，其凝乳活力達(dá)到26.81 SU/mg，C/P(clotting activity/proteolytic activity)值為4.83，純化倍數(shù)為6.65。與粗酶液相比，其蛋白水解力明顯下降，凝乳活力有一定提高。

將該提取物進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，結(jié)果如圖1-b所示,經(jīng)凝膠過(guò)濾層析后，共洗脫出了2個(gè)蛋白峰，第2個(gè)峰相較于第1個(gè)峰要大很多，且這2個(gè)峰都沒(méi)有肩峰，說(shuō)明蛋白純度較高，分離效果較好。在第二個(gè)峰的位置附近出現(xiàn)了具有高凝乳活力的蛋白，將其收集并進(jìn)行了SDS-PAGE以測(cè)定其純度(圖1-c)，發(fā)現(xiàn)黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶已達(dá)到電泳純，分子質(zhì)量約為29 kDa。該值在目前所研究的黃粉蟲(chóng)腸道蛋白分子質(zhì)量范圍之內(nèi)，并且偏小一些[22]；其分子質(zhì)量與小牛凝乳酶、山羊凝乳酶和豬胃蛋白酶相比較小，與羔羊凝乳酶[5]接近。相比于TERESHCHENKOVA等[23]只使用1種層析柱進(jìn)行純化，本研究采用2種層析柱和微濾組合的純化方法能達(dá)到更好的純化效果。

經(jīng)測(cè)定該酶的凝乳活力達(dá)到173.8 SU/mg，C/P值為104.70，純化倍數(shù)為43.13，蛋白水解力僅有1.66 U/mL (表1)。其C/P值要高于雞胃蛋白酶、金槍魚(yú)凝乳酶和成年的綿羊皺胃酶[24]。C/P值越高則表明在干酪的制作和成熟過(guò)程中產(chǎn)生的苦味越少，很多植物源和微生物源凝乳酶[18]做出的干酪質(zhì)地柔軟，苦味重就是由于蛋白水解力太大，C/P值不大導(dǎo)致的。這些都表明該酶在干酪生產(chǎn)上具有一定的潛力。

a-DEAE Sepharose Fast Flow；b-Sephadex G75；c- SDS-PAGE(M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1-純化的黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶)圖1 黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶的柱層析純化及SDS-PAGEFig.1 Column chromatography purification and SDS-PAGE pattern of milk-clitting protease from T.molitor larvae

表1 黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶純化過(guò)程Table 1 Purification procedure of milk clotting protease from T.molitor larvae

2.3 黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶序列鑒定

經(jīng)測(cè)定黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶的N端15個(gè)氨基酸序列為MKLLVFSLVAISLAQ，與建立的黃粉蟲(chóng)腸道蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)其與同源蛋白(g18990)的N端序列完全匹配(表2)；該蛋白鑒定方法被許多研究學(xué)者運(yùn)用[10,12]，是一種經(jīng)典有效的鑒定手段。該酶的氨基酸序列如圖2所示，其總氨基酸殘基數(shù)為279，與小牛皺胃酶和駱駝凝乳酶的N端序列都只有13.3%的相似度[21]。

表2 黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶的序列信息Table 2 Sequence information of milk-clotting protease from T.molitor larvae

另外，該酶序列與NCBI中的幾種蛋白水解酶有50%以上的相似度(表3)，其中最高的1種是PREDICTED:brachyurin(XP_969640.1)，相似度達(dá)到75.27%，這種蛋白水解酶來(lái)自同屬鞘翅目的紅面甲蟲(chóng)(Triboliumcastaneum)，但其功能尚未證實(shí)。

圖2 黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶的氨基酸序列Fig.2 The amino acid sequence of milk-clotting protease from T.molitor larvae

表3 黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶與其他相似蛋白水解酶氨基酸序列比對(duì)Table 3 Amino acid sequence alignment of milk-clotting protease from T.molitor larvae with other similar proteases

2.4 黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶結(jié)構(gòu)研究

2.4.1 黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶的理化性質(zhì)

對(duì)黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶和幾種序列相似的蛋白酶進(jìn)行了理化性質(zhì)預(yù)測(cè)，結(jié)果如表4所示。黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶的分子質(zhì)量相比表中其余幾種偏小，但是其不穩(wěn)定性指數(shù)<40，這表明該酶性質(zhì)穩(wěn)定。凈電荷是在中性環(huán)境下預(yù)測(cè)的凝乳酶表面總體靜電荷，均為負(fù)，黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶與小牛皺胃酶的很接近，但比駱駝凝乳酶小很多，3種酶所帶負(fù)電荷殘基數(shù)相差很小，而黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶的正電荷殘基少于駱駝凝乳酶。該酶等電點(diǎn)與表中兩種已知凝乳酶相近，幾種酶的等電點(diǎn)都<7，均為酸性蛋白酶；該結(jié)果符合黃粉蟲(chóng)腸道蛋白的研究范圍，黃粉蟲(chóng)腸道中存在酸性和堿性的蛋白酶，而且主要的消化蛋白酶為酸性蛋白酶[12,25]。幾種酶的疏水性氨基酸比例都在40%左右，黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶偏高，這表明其三級(jí)結(jié)構(gòu)可能保持較高穩(wěn)定性[26]。另外，疏水性氨基酸在酶與反應(yīng)底物相互作用涉及到的一些非共價(jià)鍵的結(jié)合上起著不可替代的作用，這也預(yù)示著該酶與κ-酪蛋白的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)可能更為穩(wěn)定。

表4 黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶及其他相似蛋白水解酶理化性質(zhì)及部分氨基酸殘基對(duì)比分析Table 4 Comparison of physicochemical properties and partial amino acid residues of milk-clotting protease from T.molitor larvae and other similar proteases

2.4.2 黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)

二級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈中主鏈原子的局部空間排布構(gòu)象，主要包括α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲，其中α-螺旋在二級(jí)結(jié)構(gòu)中起主要的穩(wěn)定作用[27]。利用黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶的完整氨基酸序列預(yù)測(cè)出其二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示其β-折疊的占比要略多于α-螺旋，而小牛皺胃酶和駱駝凝乳酶的β-折疊要明顯多于α-螺旋[21]，這表明黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶可能具有更穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖3)。3種酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的分布位置有很大差別，黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶在N端和C端都各有1個(gè)α-螺旋，后接幾個(gè)β-折疊，而其他兩種酶的N端和C段則是先排列出幾個(gè)β-折疊，后接1個(gè)α-螺旋。然而，與黃粉蟲(chóng)腸道中的主要消化蛋白酶系具有一些相似之處[12]：它們?cè)贜端都有1個(gè)α-螺旋, 其中1種組織蛋白酶L樣蛋白酶 (pCAL2C25S)的C端也具有α-螺旋。

圖3 黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 The secondary structure prediction of the milk-clotting protease from T.molitor larvae注：PredSS是預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu);AA seq是氨基酸序列;H或是α-螺旋;S或是β-折疊;C是無(wú)規(guī)則卷曲

2.4.3 黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶三級(jí)結(jié)構(gòu)

黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖4-a所示，不同的顏色代表不同的結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)模型的C-score為-1.24，擁有最高的置信度。該結(jié)構(gòu)與小牛皺胃酶和駱駝凝乳酶結(jié)構(gòu)相差甚遠(yuǎn)[28]，這可能是分子質(zhì)量和物種上的巨大差異造成的，也表明這是1種全新的凝乳蛋白酶。使用COACH服務(wù)器預(yù)測(cè)到了黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶可能的4個(gè)催化位點(diǎn)，分別是His87、Gly227、Ser229、Gly230(圖4-b)。預(yù)測(cè)結(jié)果的TM-score為0.821，Cov值0.864，預(yù)測(cè)結(jié)果也擁有很高的置信度。該酶的外層大多是α-螺旋和一些無(wú)規(guī)則卷曲，而酶分子的β-折疊結(jié)構(gòu)占據(jù)了內(nèi)部的大部分位置，并構(gòu)成了1個(gè)夾層，夾層的夾角不大，其中卻包裹著該酶的活性位點(diǎn)，使其呈隱藏狀態(tài)，并沒(méi)有暴露在外層，正因存在這樣的位阻影響，底物難以接近和進(jìn)入酶的反應(yīng)中心，導(dǎo)致酶的催化效率偏低，酶活力不如小牛皺胃酶、駱駝凝乳酶等。

a-黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶三級(jí)結(jié)構(gòu);b-黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶活性位點(diǎn);c-黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶的BFP值圖4 黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶三級(jí)結(jié)構(gòu)、活性位點(diǎn)及BFP值預(yù)測(cè)Fig.4 The prediction of tertiary structure, active sites and normalized B-factor of milk-clotting protease from T.molitor larvae注：粉紅色代表α-螺旋，黃色代表β-折疊，藍(lán)白相間的表示無(wú)規(guī)則卷曲，紫色代表活性位點(diǎn)

I-TASSER 還預(yù)測(cè)了該酶中每個(gè)氨基酸的歸一化B因子(normalized B-factor,BFP)值(圖4-c)，BFP 值>0的氨基酸殘基是在實(shí)驗(yàn)中不太穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。如圖所示，64.8%的氨基酸殘基的BFP值<0，其中又有64.4%的殘基參與構(gòu)成蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，這表明黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較高。

3 結(jié)論

從黃粉蟲(chóng)腸中提取和分離純化出了黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶，通過(guò)LC-MS/MS等技術(shù)鑒定出該酶完整的279個(gè)氨基酸序列；經(jīng)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該酶為酸性蛋白酶，理化性質(zhì)穩(wěn)定，二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；與小牛皺胃酶和駱駝凝乳酶比較發(fā)現(xiàn)三者在N端序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)等方面有較大差異；通過(guò)同源建模預(yù)測(cè)出該酶的三維結(jié)構(gòu)以及可能的活性位點(diǎn)Ser229等。本研究可為黃粉蟲(chóng)凝乳蛋白酶的跨膜蛋白分析、與κ-酪蛋白復(fù)合物的構(gòu)建等進(jìn)一步的研究提供科學(xué)依據(jù)。