宋朝陽(yáng)，汪 月，楊曉麗，張 炎，文鵬程，喬海軍，張衛(wèi)兵,*，張忠明,*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省商業(yè)科技研究所有限公司，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

凝乳酶是干酪生產(chǎn)中重要的酶制劑，它可以水解αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白中的特定肽鍵，特別是對(duì)κ-酪蛋白中Phe105-Met106肽鍵具有高特異性的裂解作用，使酪蛋白膠束失穩(wěn)，最終聚集形成凝乳[1-2]。動(dòng)物源凝乳酶具有良好的凝乳性能、可接受性高、提取方便，是奶酪生產(chǎn)的最佳選擇，但是有限的動(dòng)物資源限制了凝乳酶的產(chǎn)量[3]，因此，尋找凝乳酶替代物是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，為了滿足凝乳酶的市場(chǎng)需求，以食用昆蟲為資源開發(fā)新型凝乳酶具有良好的前景。

黃粉蟲（Tenebrio molitor），俗稱面包蟲，屬于鞘翅目動(dòng)物。黃粉蟲幼蟲含有豐富的蛋白質(zhì)、酶類及生物活性物質(zhì)，是一種優(yōu)質(zhì)的可食性昆蟲資源。它生長(zhǎng)迅速，成本低，對(duì)環(huán)境的負(fù)擔(dān)較小，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和飼料等領(lǐng)域[4]，但是黃粉蟲幼蟲體內(nèi)含有微量的苯醌毒物，加工中必須嚴(yán)格清雜排毒保證食用的安全性[5]。目前，對(duì)于黃粉蟲的研究報(bào)道主要集中在纖溶性蛋白酶、β-葡萄糖苷酶和幾丁質(zhì)酶等方面[6-7]，而關(guān)于黃粉蟲凝乳酶（Tenebrio molitorrennet，TMR）的研究鮮有報(bào)道。

酶誘導(dǎo)凝乳的形成是干酪生產(chǎn)中的關(guān)鍵步驟，它直接影響最終產(chǎn)品的質(zhì)量。凝乳形成過程中，溫度對(duì)于凝乳酶的凝乳特性、凝乳結(jié)構(gòu)以及干酪質(zhì)量和風(fēng)味等的影響極為重要。適宜的溫度會(huì)增加酪蛋白膠束碰撞的頻率，導(dǎo)致凝乳速度加快，較低的溫度很難破壞酪蛋白膠束的穩(wěn)定性，酪蛋白的聚集度降低，溫度過高會(huì)導(dǎo)致凝乳酶失活[8]。李貽珍等[9]的研究表明凝乳溫度升高，蛋白質(zhì)之間的相互作用增強(qiáng)，顯著影響凝乳酶的凝乳性能。目前，溫度對(duì)TMR凝乳性能影響的研究鮮見報(bào)道。

因此，本實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室自制TMR為研究對(duì)象，探究凝乳溫度對(duì)其凝乳行為、水解特性及凝乳結(jié)構(gòu)的影響，旨在為新型昆蟲凝乳酶的開發(fā)及在乳品工業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

TMR凍干粉（純化倍數(shù)66.52，比活力268.09 SU/mg），本實(shí)驗(yàn)室自制；商品凝乳酶（commercial rennet，CR）北京愛多特生物技術(shù)有限公司；荷爾斯坦牛乳 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)的奶牛場(chǎng)；脫脂乳粉 內(nèi)蒙古伊利乳業(yè)有限責(zé)任公司。

三氯乙酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；茚三酮 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；異硫氰酸熒光素酯（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC） 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BS223S型電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；H/T16MM臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HH-8電熱恒溫水浴鍋 常州市億能實(shí)驗(yàn)儀器廠；PHS-3C pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；DiscoveryHR-1混合流變儀 美國(guó)TA Instruments公司；Bettersize2600激光粒度分布儀 丹東百特儀器有限公司；UV-650紫外-可見分光光度計(jì) 中科瑞捷（天津）科技有限公司；Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜儀 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；LSM 800型激光掃描共聚焦顯微鏡 德國(guó)蔡司股份公司；SCIENTZ-10ND冷凍干燥機(jī) 英國(guó)Stable Micro System公司。

1.3 方法

1.3.1 凝乳酶液的配制

凝乳酶采用離子交換層析分離純化，使用冷凍干燥機(jī)制得凝乳酶粉，貯藏在-80 ℃。然后稱取1 g凝乳酶凍干粉，加入適量磷酸鹽緩沖液（0.5 mol/L，pH 7.0）溶解配制成凝乳酶液，適當(dāng)稀釋后采用Arima法在35 ℃測(cè)定其酶活力為150 SU/mL。

1.3.2 凝乳的制備

將牛乳在3 000hg條件下離心10 min脫脂，然后分別在35、40、45、50、55、60 ℃條件下水浴10 min，加入體積分?jǐn)?shù)10%同等條件下預(yù)熱的凝乳酶液，快速混勻，凝乳1 h，排出乳清，得到凝乳。

1.3.3 凝乳持水力和乳清OD值測(cè)定

凝乳持水力的測(cè)定參照趙笑等[10]的方法進(jìn)行：將凝乳4 ℃、7 000 r/min離心10 min，取上清液稱質(zhì)量，按式（1）計(jì)算乳樣持水力：

乳清OD值測(cè)定參考吳檳等[11]的方法進(jìn)行：使用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定排出的乳清在波長(zhǎng)500 nm處的光密度OD。

1.3.4 凝乳粒徑分布的測(cè)定

采用動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定[12]，使用冷凍干燥機(jī)將凝乳樣品凍干，然后直接加到激光粒度分布儀的分散池中，以去離子水作為分散劑，分散劑和凝乳樣品的折射率分別為1.33和1.44。

1.3.5 流變學(xué)特性

1.3.5.1 凝乳表觀黏度的測(cè)定

將凝乳樣品直接轉(zhuǎn)移到流變儀上，選用夾具40 mm，0°平行板，間隙為1 000 μm，應(yīng)力為1.0 Pa，頻率范圍0.1～100 s-1，室溫下測(cè)定凝乳的表觀黏度[13]。

1.3.5.2 凝乳過程中儲(chǔ)能模量（G′）的測(cè)定

使用混合流變儀測(cè)定牛乳樣品的流變特性[14]。將脫脂牛奶分別在35、40、45、50、55、60 ℃條件下水浴10 min，取5 mL牛奶樣品，加入0.5 mL同等條件下預(yù)熱的凝乳酶，混合30 s，然后立即轉(zhuǎn)移至流變儀上，選用夾具40 mm，0°平行板，間隙為1 000 μm，頻率為1 Hz，應(yīng)力為0.1 Pa，數(shù)據(jù)采集點(diǎn)間隔為10 s。所有測(cè)試都在線性黏彈性區(qū)域進(jìn)行，測(cè)量的參數(shù)為儲(chǔ)能模量（G’），每次測(cè)試時(shí)間為1 h。

1.3.6 乳清中酪蛋白糖巨肽（casein glycomacropeptide，CGMP）含量和水解度的測(cè)定

乳清前處理：將乳清在沸水浴中滅酶后，9 000hg離心10 min去除乳清中的殘余凝乳，然后加入三氯乙酸進(jìn)一步除雜，過濾。

CGMP含量的測(cè)定[15]：取2 mL唾液酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入間苯二酚試劑工作液2 mL煮沸15 min，然后迅速冷卻，加入4 mL有機(jī)溶液乙酸丁酯和正丁醇（85∶15，V/V），搖勻，37 ℃水浴中提取5 min后，在4 ℃、2 860hg離心10 min，在波長(zhǎng)580 nm處測(cè)定上層有機(jī)物的吸光度。唾液酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=24.671x+0.064，R2=0.991。然后取2 mL前處理后的乳清樣品，按上述步驟測(cè)定吸光度。CGMP含量按式（2）計(jì)算：

式中：A為乳清樣品的吸光度；V1為乳清樣品的體積/mL；V2為脫脂牛乳的體積/mL。

水解度測(cè)定采用茚三酮比色法[16]，以甘氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品。取稀釋后的甘氨酸2 mL，然后加入2 mL茚三酮顯色劑，混合后在沸水浴中加熱15 min，迅速冷卻，加入5 mL體積分?jǐn)?shù)40%的乙醇溶液，混勻后放置15 min，然后在波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定吸光度。甘氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.054 1x+0.009 7，R2=0.998。另取2 mL同樣稀釋的乳清樣品，按上述方法測(cè)吸光度。水解度按式（3）計(jì)算：

式中：C為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（g/L）；W為蛋白質(zhì)量/g；V1為水解液的總體積/mL；V2為顯色時(shí)所用稀釋液的總體積/mL。

1.3.7 凝乳中蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

采用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行紅外分析[17]。將凍干后的凝乳樣品平鋪在采樣器附件ZnSe晶片上，設(shè)置分辨率為4 cm-1，掃描范圍為4 000～400 cm-1。

1.3.8 凝乳微觀結(jié)構(gòu)觀察

參考Koutina等[16]的方法略作修改。將5 mL脫脂乳與0.05 mL FITC（0.1 mg/mL）在10 mL離心管中混勻，2 min后加入0.5 mL凝乳酶充分混勻。然后吸取0.5 mL至帶有凹槽的載玻片上，蓋上蓋玻片在35 ℃孵育30 min，然后倒置并利用激光共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope，CLSM）對(duì)凝乳樣品進(jìn)行觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性和相關(guān)性分析，數(shù)據(jù)采用 fs表示，采用Origin 2018進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)凝乳持水力和乳清OD值的影響

持水力是反映凝乳穩(wěn)定性的重要參數(shù)，也是評(píng)價(jià)凝乳品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[9]。如圖1A所示，TMR凝乳的持水力隨溫度的升高呈增大趨勢(shì)，當(dāng)溫度由40 ℃升高至55 ℃時(shí)，TMR凝乳的持水力由82.51%增加到86.69%；CR凝乳的持水力在35～45 ℃顯著增大（P＜0.05），45～60 ℃差異不顯著（P＞0.05）；而且在不同溫度條件下，TMR凝乳的持水力均顯著大于CR凝乳。這可能是因?yàn)檩^低的凝乳溫度下，維持酪蛋白膠體狀態(tài)的疏水相互作用減弱，更多的疏水基團(tuán)暴露，導(dǎo)致持水力較低[18]；同時(shí)，由于TMR對(duì)溫度比較敏感，因而隨著溫度的升高，疏水作用力逐漸增強(qiáng)，持水力顯著增大。趙笑等[10]的研究表明溫度升高，TMR的活力提高，凝乳速度加快，包裹在凝乳結(jié)構(gòu)中的水分增多，因而持水力增大，這與本研究結(jié)果一致。

圖1 持水力和乳清OD值的變化Fig.1 Changes in water-holding capacity and whey OD value of curd with preheating temperature of milk

乳清OD值可以反映排出乳清中的蛋白含量變化，乳清OD值越大，凝乳性能越差[9]。如圖1B所示，TMR的乳清OD值隨溫度的升高顯著減小（P＜0.05），而CR的乳清OD值則隨溫度的升高變化不顯著（P＞0.05）。當(dāng)溫度由35 ℃升高至45 ℃時(shí)，TMR的乳清OD值迅速下降到0.253，繼續(xù)升高溫度，乳清OD值基本穩(wěn)定。當(dāng)溫度升高至45 ℃后，2種凝乳酶的乳清OD值差異較小，凝乳性能相近?？赡艿脑蚴荰MR的最適作用溫度低于CR，隨著溫度升高，TMR活力逐漸增強(qiáng)，參與凝乳的蛋白增多，乳清OD值降低[18]。Anema等[19]的研究發(fā)現(xiàn)凝乳溫度的升高會(huì)增加酪蛋白的聚集能力，這可能是由于空間位阻或與酪蛋白膠束相關(guān)乳清蛋白導(dǎo)致電荷減少引起的。

2.2 溫度對(duì)凝乳粒徑的影響

表示粒度特征關(guān)鍵指標(biāo)的D10、D50、D90分別代表該樣品的累積粒度分布的百分?jǐn)?shù)達(dá)到10%、50%和90%時(shí)所對(duì)應(yīng)的粒徑值，其中D50表示樣品的平均粒徑；D（4,3）表示樣本的體積平均粒徑，其更能反映微量的大直徑粒子的存在[20]。

如圖2所示，2種酶凝乳的粒徑分布隨溫度的升高均趨于正態(tài)分布。這與Brishti等[21]的研究結(jié)果一致，可能的原因是隨凝乳溫度的升高，酪蛋白膠束聚集形成穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)，粒徑增大；當(dāng)溫度高于45 ℃，TMR逐漸失活，蛋白水解活性增強(qiáng)，酪蛋白聚集形成松散的凝乳結(jié)構(gòu)，蛋白粒徑減小。從表1可以看出，隨溫度的升高，2種酶凝乳的粒徑均先增大后減小（P＜0.05），45～55 ℃ TMR凝乳的平均粒徑差異不顯著（P＞0.05）；且TMR凝乳在45 ℃的粒徑值顯著大于CR凝乳的粒徑值，凝乳性能較好。這是由于TMR的最適凝乳溫度小于CR，隨溫度的升高，TMR凝乳中蛋白質(zhì)分子間較強(qiáng)引力形成穩(wěn)定的凝聚結(jié)構(gòu)[18]。

圖2 凝乳粒徑分布的變化Fig.2 Changes in particle size distribution of curd with preheating temperature of milk

表1 凝乳粒徑值的變化Table 1 Changes in particle size distribution parameters of curd with preheating temperature of milk

2.3 凝乳溫度對(duì)流變學(xué)特性的影響

2.3.1 凝乳溫度對(duì)表觀黏度的影響

表觀黏度反映凝乳結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，表觀黏度大，蛋白質(zhì)分子之間的連接更加緊密，凝乳體系越穩(wěn)定[22]。由圖3可知，凝乳的表觀黏度均隨著剪切速率的增加逐漸降低，表現(xiàn)出剪切變稀的假塑性，符合非牛頓流體特性[23]；同一剪切速率下，不同溫度對(duì)凝乳表觀黏度的影響存在差異。而且隨溫度的升高，TMR凝乳的表觀黏度先增大后減小，45 ℃達(dá)到最大值0.51（圖3a）；CR凝乳的表觀黏度則隨溫度的升高不斷增大（圖3b）。Zhao Zhengtao等[23]的研究發(fā)現(xiàn)溫度的升高增加了體系中的疏水基團(tuán)，導(dǎo)致酪蛋白膠束間形成了穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，降低了流動(dòng)性，表觀黏度增大；相反，當(dāng)體系中的疏水基團(tuán)減少時(shí)，凝乳結(jié)構(gòu)變得松散，流動(dòng)性較強(qiáng)，表觀黏度減小，這與本研究的結(jié)果一致。45 ℃時(shí)2種酶凝乳的表觀黏度值差異最小，而且TMR凝乳的表觀黏度在45 ℃下的降幅最大，蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。這是因?yàn)樵谙嗤募羟兴俾氏?，蛋白結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定的凝乳，其表觀黏度的降幅越大[22]。

圖3 凝乳表觀黏度的變化Fig.3 Changes in apparent viscosity of curd with preheating temperature of milk

2.3.2 凝乳溫度對(duì)儲(chǔ)能模量（G’）的影響

小幅振蕩時(shí)間掃描已經(jīng)被廣泛用于研究凝乳過程中的黏彈性變化[24]，凝乳屬于黏彈性聚合物，其質(zhì)地受其流變學(xué)特性的影響很大[25]。如圖4所示，隨溫度升高，2種酶凝乳過程中的G’均先增大后減??；TMR凝乳和CR凝乳G’分別在50 ℃和40 ℃達(dá)到最大值，而且CR凝乳過程中G’顯著大于TMR?？赡艿脑蚴荰MR酪蛋白的最大水解發(fā)生在pH 6.2～6.4之間[26]，與脫脂牛乳的pH值接近；而且黃粉蟲中含有大量纖溶性蛋白酶，對(duì)于凝血塊及凝乳具有較大的溶解性[6]；Esteves等[28]的研究發(fā)現(xiàn)，溫度的升高促使凝乳酶活性顯著增加，隨凝乳時(shí)間的延長(zhǎng)，凝乳酶逐漸失活，蛋白水解活性增大，凝乳結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性被破壞，導(dǎo)致G’降低，這與本研究的結(jié)果相似。

圖4 凝乳儲(chǔ)能模量（G’）的變化Fig.4 Changes in curd storage modulus (G’) with preheating temperature of milk

2.4 凝乳溫度對(duì)酶解CGMP含量和水解度的影響

凝乳酶的水解特性表現(xiàn)為可定向水解酪蛋白產(chǎn)生CGMP，CGMP上含有豐富的支鏈氨基酸和生物活性因子，具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、促進(jìn)腸道益生菌增殖以及抗氧化等特性，可以提高乳制品的附加值[29]；水解度代表水解過程中蛋白質(zhì)肽鍵被裂解的程度[30]。由圖5A可知，在35～45 ℃，TMR酶解產(chǎn)生的CGMP含量和水解度顯著增加（P＜0.05），在45～55 ℃溫度范圍內(nèi)，兩者均變化不顯著（P＞0.05）。由圖5B可知，隨溫度升高，CR酶解產(chǎn)生的CGMP含量顯著降低，水解度顯著增大（P＜0.05）。這是因?yàn)殡S溫度升高，κ-酪蛋白的水解程度逐漸達(dá)到80%，Ca2+與酪蛋白膠束間形成了穩(wěn)定的化學(xué)鍵，使部分CGMP不能測(cè)定出來，因而CGMP含量增加緩慢，水解度下降，這與趙存朝等[12]的研究結(jié)果一致。與CR相比，當(dāng)溫度升高至45 ℃時(shí)，TMR酶解產(chǎn)生的CGMP含量變化不顯著（P＞0.05），且2種凝乳酶的水解度相近；Anema等[19]溫度的持續(xù)升高會(huì)促進(jìn)β-乳球蛋白與副-κ-酪蛋白區(qū)域形成二硫化鍵，這種復(fù)合物在CGMP被去除后仍將附著在酪蛋白膠束上，阻礙凝乳過程中酪蛋白膠束的聚集。同時(shí)，TMR來源廣泛、價(jià)格低廉、制備工藝簡(jiǎn)單，可以極大增加其在乳制品中的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

圖5 酶解CGMP含量和水解度的變化Fig.5 Changes in CGMP content and DH of curd with preheating temperature of milk

2.5 溫度對(duì)凝乳中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

小分子與生物大分子之間相互作用引起二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變[31]，因此采用傅里葉紅外光譜研究不同凝乳溫度下酶誘導(dǎo)凝乳形成過程中的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，紅外光譜圖中的峰代表不同官能團(tuán)[32]。如圖6所示，在酰胺III帶1 330～1 220 cm-1之間，TMR凝乳有2個(gè)峰，分別對(duì)應(yīng)üCH3彎曲振動(dòng)和—NO2對(duì)稱伸縮；CR凝乳有一個(gè)峰，歸屬為—NO2對(duì)稱伸縮。因此選擇酰胺III帶進(jìn)行擬合，計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量如表2所示。

表2 凝乳酪蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量Table 2 Relative contents of secondary structure in curds

α-螺旋與β-折疊含量比值可以表征蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的柔韌性，比值越小，蛋白柔韌性越大[33]。由表3可知，隨溫度升高，TMR凝乳中α-螺旋/β-折疊的比值和β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量均呈先減小后增大的趨勢(shì)，CR凝乳中的α-螺旋/β-折疊的比值和β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量隨溫度的升高呈先增大后減小的趨勢(shì)。與CR凝乳相比，TMR凝乳在45 ℃時(shí)的α-螺旋/β-折疊數(shù)值和β-轉(zhuǎn)角最小，無規(guī)卷曲含量達(dá)到最大值，說明TMR在45 ℃形成不規(guī)則的柔韌性和穩(wěn)定性良好的凝乳結(jié)構(gòu)，且凝乳的柔韌性優(yōu)于CR凝乳，這與石彥國(guó)等[17]的研究結(jié)果一致。李柳等[34]的研究發(fā)現(xiàn)甲醇芽孢桿菌凝乳酶具有較強(qiáng)的疏水作用，而且其α-螺旋結(jié)構(gòu)明顯少于β-折疊結(jié)構(gòu)，因此凝乳酶容易發(fā)生降解。因此，凝乳二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化除了與溫度有關(guān)之外，還與凝乳酶的分子結(jié)構(gòu)具有相關(guān)性。

2.6 凝乳溫度對(duì)凝乳微觀結(jié)構(gòu)的影響

如圖7a所示，隨凝乳溫度的增加，TMR凝乳中的蛋白間隙呈先減少后增多趨勢(shì)；45 ℃ TMR凝乳中的酪蛋白膠束聚集形成密集的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；由圖7b可知，CR凝乳中的蛋白間隙隨溫度的升高不斷增大，凝乳結(jié)構(gòu)逐漸疏松；35 ℃凝乳中的蛋白分布均勻，蛋白骨架也更飽滿，凝乳性能良好。這是因?yàn)樵谀檫^程中，溫度的升高使酪蛋白膠束間的疏水作用增強(qiáng)[35-36]。TMR凝乳的水解度在35～45 ℃逐漸增大，酪蛋白膠束被破壞，酪蛋白分子在疏水基團(tuán)的作用下聚集，形成穩(wěn)定的凝乳結(jié)構(gòu)，與范金波等[37]的研究結(jié)果一致。當(dāng)溫度高于45 ℃時(shí)，酪蛋白過度水解，導(dǎo)致凝乳中的蛋白間隙變大甚至發(fā)生斷裂，出現(xiàn)疏松的絮狀結(jié)構(gòu)。趙笑[10]和賀殷媛[38]等的研究也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果，即蛋白水解程度越高，蛋白聚集形成的間隙變大，凝乳結(jié)構(gòu)變得越松散。2種凝乳的蛋白結(jié)構(gòu)在45 ℃時(shí)差異最小，且TMR凝乳細(xì)膩柔軟，可塑性更強(qiáng)。

圖7 凝乳的CLSM圖像Fig.7 CLSM images of curds

3 結(jié) 論

為了開發(fā)具有良好凝乳性能的新型凝乳酶，本實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室自制TMR為研究對(duì)象，探究不同凝乳溫度對(duì)TMR凝乳行為、水解特性及凝乳結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，隨凝乳溫度的升高，TMR的蛋白水解活性被抑制，TMR的凝乳性能逐漸改善；當(dāng)溫度超過45 ℃時(shí)，凝乳酶活性降低，凝乳結(jié)構(gòu)變得疏松；與CR凝乳相比，TMR凝乳的持水力和乳清OD值在45 ℃趨于穩(wěn)定，粒徑顯著大于CR凝乳的粒徑，凝乳性能較好；同時(shí)，TMR凝乳在45 ℃形成了連續(xù)不規(guī)則且較為致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有利于在干酪中應(yīng)用。因此，TMR可作為小牛凝乳酶的替代品應(yīng)用于干酪生產(chǎn)中。