薛蓓，于佳俊，楊帆,，盧灝澤,，石俊，張曉蒙，馬文瑞，張晶晶,3，陳璐,3，王妍凌,3，薛潔*

1(西藏農(nóng)牧學(xué)院 食品科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝，860000)2(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015)3(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830052)

寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)是我國(guó)最適宜葡萄種植的產(chǎn)區(qū)之一，具有發(fā)展葡萄產(chǎn)業(yè)得天獨(dú)厚的資源稟賦和區(qū)位優(yōu)勢(shì)，自古以來(lái)是中國(guó)主要的釀酒葡萄及葡萄酒產(chǎn)地，近兩年由于葡萄產(chǎn)業(yè)化及龍頭企業(yè)的發(fā)展，寧夏葡萄酒產(chǎn)量逐年提高，工業(yè)水平有了明顯的發(fā)展，葡萄酒已經(jīng)成為自治區(qū)經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)型和支柱性優(yōu)勢(shì)特色產(chǎn)業(yè)。

葡萄酒的釀造是由多種微生物共同作用完成的。NICHOLAS等[1]首次提出葡萄酒的“微生物風(fēng)土”概念，即葡萄酒微生物的群落結(jié)構(gòu)特征可以表現(xiàn)出產(chǎn)區(qū)特異性的特點(diǎn)。通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)區(qū)、不同葡萄品種、不同年份葡萄酒微生物多樣性的檢測(cè)，以及相對(duì)應(yīng)的葡萄酒風(fēng)格之間的比較，越來(lái)越多的研究認(rèn)為微生物是葡萄酒產(chǎn)區(qū)質(zhì)量和感官風(fēng)格的決定性因素之一。

目前分析釀酒葡萄中微生物多樣性的方法主要有PCR技術(shù)，其中包括限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析(random amplified polymorphic DNA，RAPD)，但是這些方法不僅耗時(shí)，而且結(jié)果也不太準(zhǔn)確。高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)完全避開(kāi)了這些缺點(diǎn)，該技術(shù)不僅測(cè)序周期短，測(cè)出的數(shù)據(jù)量大，而且結(jié)果準(zhǔn)確率高、成本低，所以該方法是目前最適合分析微生物多樣性的技術(shù)。張二豪等[2]利用高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)西藏芒康和林芝地區(qū)葡萄果皮上優(yōu)勢(shì)菌屬分別為有孢漢遜酵母屬(Hanseniaspora)和枝孢屬(Cladosporium)。張俊杰等[3]利用高通量測(cè)序技術(shù)在市售夏黑無(wú)核葡萄果皮上檢測(cè)出致病菌志賀氏菌屬(ShigellaCastellani)，對(duì)市場(chǎng)售賣果蔬前的檢疫工作有一定的借鑒意義。BOKULICH等[4]利用高通量技術(shù)發(fā)現(xiàn)美國(guó)加利福尼亞兩個(gè)不同產(chǎn)區(qū)的霞多麗中的葡糖桿菌屬(Gluconobacter)，在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中可以促進(jìn)合成脂類物質(zhì)，從而提升葡萄酒的品質(zhì)。

本文利用高通量測(cè)序技術(shù)分析賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)中西夏區(qū)、永寧縣、青銅峽，石嘴山4個(gè)葡萄園區(qū)中釀酒葡萄果皮上的微生物組成，揭示產(chǎn)區(qū)微生物的多樣性，為篩選產(chǎn)區(qū)優(yōu)質(zhì)的微生物以及釀酒微生物菌庫(kù)的建立提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品來(lái)自中國(guó)寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)中西夏區(qū)(XXQ)、永寧縣(YNX)、青銅峽(QTX)和石嘴山(SZS)4個(gè)產(chǎn)區(qū)中的葡萄，各產(chǎn)區(qū)地址如圖1所示，于2019年9月采樣，樣品如表1 所示。

瓊脂糖，西班牙Biowest Agarose公司；NGS-ITS1 copy1 Barcode1-70、NGS-16s V4 copy1 Barcode1-70，生工生物工程(上海)股份有限公司；Gold View I核酸染料，北京中生瑞泰科技有限公司；DL 2000 Marker，美國(guó)Axygen公司；所有提取用無(wú)機(jī)、有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

圖1 產(chǎn)區(qū)地圖Fig.1 Production area map

表1 實(shí)驗(yàn)樣品Table 1 Experimental samples

1.2 儀器與設(shè)備

Illumina Misq測(cè)序平臺(tái)，美國(guó)Illumina公司；5810R離心機(jī)，德國(guó) Eppendorf 公司；PCR儀，美國(guó)伯樂(lè)公司；立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 采樣方法

選擇各葡萄園中有代表性的葡萄樹(shù)，用消毒后的剪刀從葡萄樹(shù)的上、中、下3個(gè)地方采集果實(shí)，采集后放入無(wú)菌采樣袋中，再將采樣袋放入裝有液氮的采樣箱中帶回實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃低溫保藏。將同產(chǎn)區(qū)同品種樣品混合制成聚合樣本后用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 葡萄細(xì)菌和真菌的分離[5-6]

(1)取適量葡萄，在無(wú)菌條件進(jìn)行果皮分離，分離后在液氮條件下研磨果皮，稱取4 g果皮粉放入無(wú)菌的50 mL離心管A1中。

(2)加入6 mL TE Buffer緩沖溶液，配平后5 000×g離心6 min，然后將上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)無(wú)菌的50 mL離心管A2中。

(3)重復(fù)步驟2兩次。

(4)向A1管中加入6 mL PBS Buffer 緩沖溶液，振蕩混勻后進(jìn)行離心，5 000×g離心6 min，將上清液在無(wú)菌條件下加入到A2管中。

(5)配平后進(jìn)行離心，9 000×g離心10 min后舍棄上清液，沉淀物放于-20 ℃進(jìn)行保存。

1.5 DNA的提取

采用Fast DNA SPIN Kit for Soil試劑盒(MP)進(jìn)行提取。

1.6 樣品分析

細(xì)菌PCR所用的引物為16S rDNA V4：16S 515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)；16S 806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。真菌PCR所用的引物為引物ITS1：ITS 1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAGTAA-3′)；ITS 1R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。PCR反應(yīng)體系為：dNTP Mixture 4 μL，10×PCR Buffer(Mg2+plus)5 μL，正反向引物各1 μL，樣品DNA 5 μL，ExTaq酶0.25 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL，充分混勻。真菌PCR擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性45 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，反應(yīng) 35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。-20 ℃保存。細(xì)菌PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性45 s， 50 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。-20 ℃保存[7]。

取PCR產(chǎn)物10 μL用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)合格樣品送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行進(jìn)行真菌ITS ITS1、細(xì)菌16S rDNA V4區(qū)域文庫(kù)構(gòu)建，最后用Illumina Misq 進(jìn)行測(cè)序分析[8]。

1.7 數(shù)據(jù)預(yù)處理

將測(cè)序完成后的數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，過(guò)濾去除引物和接頭序列、非特異性擴(kuò)增序列及嵌合體，使得最后用于操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)分析的數(shù)據(jù)有效可靠。

1.8 數(shù)據(jù)分析

1.8.1 OTU聚類分析

OTU是指通過(guò)一定的距離度量方法計(jì)算兩兩不同序列之間的距離度量或相似性，繼而設(shè)置特定的分類閾值，獲得同一閾值下的距離矩陣，進(jìn)行聚類操作，形成不同的分類單元。用Qiime軟件對(duì)4個(gè)不同產(chǎn)區(qū)的釀酒葡萄進(jìn)行OTU分析，將相似度≥97%的聚為一類，采用貝葉斯算法獲得每個(gè)OTU的分類學(xué)信息，利用R軟件繪制韋恩圖后進(jìn)行分析。

1.8.2 Alpha分析

Alpha分析能夠反映微生物群落的豐度和多樣性，主要包括 Chao1、多樣性指數(shù)Shannon 和 Coverage?？梢酝ㄟ^(guò)Coverage值檢測(cè)出測(cè)序結(jié)果有無(wú)代表性，其數(shù)值越高，結(jié)果越具代表性。

1.8.3 微生物多樣性分析

通過(guò)對(duì)OTU數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用柱狀圖對(duì)樣品中的細(xì)菌和真菌進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并確定優(yōu)勢(shì)菌屬；利用主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis，PCoA)和非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means, UPGMA)聚類樹(shù)分析樣本間相似度；利用韋恩圖來(lái)觀察4個(gè)不同產(chǎn)區(qū)中釀酒葡萄樣品中所具有的相同的菌屬，通過(guò)上述分析方法來(lái)綜合分析樣品中微生物的多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物群落多樣性分析

微生物的Alpha多樣性指數(shù)有Shannon和Simpson兩種。Shannon值越大，群落多樣性越高；Coverage指各樣本文庫(kù)的覆蓋率，其數(shù)值越高，則樣本中序列被測(cè)出的概率越高，而沒(méi)有被測(cè)出的概率越低。從表2中得出，在細(xì)菌方面，4個(gè)不同產(chǎn)區(qū)微生物多樣性不僅受釀酒葡萄品種的影響，而且也受小產(chǎn)區(qū)氣候、土壤條件的影響，從細(xì)菌多樣性來(lái)講，4個(gè)產(chǎn)區(qū)多樣性指數(shù)從高到低依次為SZS、YNX、XXQ、QTX；品種間細(xì)菌多樣性指數(shù)從高到低依次為霞多麗、貴人香、馬瑟蘭和赤霞珠。

從圖2-b可以看出，在真菌屬水平上，XXQ產(chǎn)區(qū)的樣品中真菌最為豐富的菌屬為擬點(diǎn)霉屬(Phomopsis)、未鑒定出的菌屬(unidentified)，較為豐富的菌屬為Rhodosporidiobolus；在YNX產(chǎn)區(qū)的樣品中最為豐富的菌屬為曲霉菌屬(Aspergillus)、鏈格孢屬(Alternaria)，其次較為豐富的是短梗霉屬(Aureobasidium)和Naganishia；在QTX產(chǎn)區(qū)的樣品中最為豐富的菌屬為Papiliotrema、有孢漢遜酵母屬(Hanseniaspora)、Curvibasidium，其次較為豐富的是線黑粉酵母屬(Filobasidium)；在SZS產(chǎn)區(qū)的樣品中最為豐富的菌屬赤霉菌屬(Gibberella)、附球霉屬(Epicoccum)，其次較為豐富的是Cladosporium和亞隔孢殼屬(Didymella)。

因此，在屬水平上，無(wú)論是細(xì)菌多樣性，還是真菌多樣性，4個(gè)產(chǎn)區(qū)間都存在明顯差異，這或許就是不同產(chǎn)區(qū)葡萄酒風(fēng)格差異的原因所在。

表2 樣品Alpha多樣性指數(shù)表Table 2 Sample Alpha diversity indexes table

a-樣品細(xì)菌相對(duì)豐度熱圖;b-樣品真菌相對(duì)豐度熱圖圖2 樣品相對(duì)豐度熱度圖Fig.2 Heat map of samples relative abundance

2.2 微生物豐度分析

由于檢測(cè)出樣品中含有多種微生物，有些微生物含量很少，與豐度高的微生物在同一圖中不能明顯的突出，所以把豐度>1%的物種作為劃分依據(jù)，選擇排名前15的優(yōu)勢(shì)菌屬，以相對(duì)豐度為縱坐標(biāo)，繪制柱形圖。

2.2.1 不同產(chǎn)區(qū)赤霞珠樣品真菌豐度分析

從圖3可以看出，在屬水平上，赤霞珠樣品中最為豐富的菌屬為Alternaria、Cladosporium、鐮刀菌屬(Fusarium)、毛殼菌屬(Chaetomium)、Didymella。不同產(chǎn)區(qū)微生物多樣性有差異，但也有相似之處。XXQ和SZS產(chǎn)區(qū)雖然豐度最高的是Cladosporium，但是在SZS產(chǎn)區(qū)，豐度較高的Chaetomium、Fusarium和Alternaria所占比較非常接近，而XXQ產(chǎn)區(qū)Alternaria微生物含量相對(duì)較多，而Chaetomium、Fusarium微生物含量甚微。YNX和QTX產(chǎn)區(qū)微生物豐度比較相似，豐度最高的Alternaria，其次是Cladosporium。

從圖4可以看出，XXQ、QTX、SZS、YNX葡萄園中赤霞珠樣品所含的真菌OTU分別為280個(gè)、218個(gè)、208個(gè)、388個(gè)。XXQ和YNX產(chǎn)區(qū)擁有219種相同的微生物種類，這與兩個(gè)產(chǎn)區(qū)在賀蘭山葡萄酒產(chǎn)區(qū)的地理位置相近有關(guān)；石嘴山產(chǎn)區(qū)由于位于整個(gè)產(chǎn)區(qū)的最北端，因此這或許是產(chǎn)區(qū)赤霞珠果皮上所含的真菌OUT值最小的原因所在；在4個(gè)小產(chǎn)區(qū)中，QTX產(chǎn)區(qū)由于位于賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)的南端，距離SZS產(chǎn)區(qū)較遠(yuǎn)，兩個(gè)產(chǎn)區(qū)的微生物的相似度較低，這也說(shuō)明了不同產(chǎn)區(qū)微生物的多樣性受地理?xiàng)l件的影響。

圖3 真菌屬水平相對(duì)豐度柱狀圖Fig.3 Histogram of relative abundance of fungi

圖4 真菌群落維恩圖Fig.4 Venn diagram of fungal community

2.2.2 不同產(chǎn)區(qū)赤霞珠樣品細(xì)菌豐度分析

在減少腐敗存量、遏制腐敗增量的努力中，我國(guó)多年來(lái)經(jīng)歷了“運(yùn)動(dòng)反腐”、“權(quán)力反腐”、“制度反腐”、“體系反腐”等多種模式，[1]卻陷入了腐敗存量與增量此起彼伏的怪圈。我們要承認(rèn)腐敗存在的歷史必然性及腐敗難以徹底消失的事實(shí)、最大限度提高“減存遏增”的效率，要在保證公共治理的必要權(quán)力和維持經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展前進(jìn)的前提下，尋找腐敗存量與增量的平衡點(diǎn)，將腐敗存量與增量控制在符合經(jīng)濟(jì)和社會(huì)可接受的最低水平。為達(dá)到這一目的，本文試圖探索一種有效控制腐敗存量與增量的平衡機(jī)制，以期為腐敗存量與增量問(wèn)題的解決提供方向。

從圖5可以看出，在屬水平上，赤霞珠樣品中的優(yōu)勢(shì)菌屬為羅爾斯通氏菌屬(Ralstonia)、unidentified_Chloroplast、Massilia、Gluconobacter、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)。在XXQ、YNX、SZS樣品里豐度最高的菌屬是Ralstonia，其次都是unidentified_Chloroplast；Ralstonia是重要的植物致病菌，可在營(yíng)養(yǎng)缺乏的環(huán)境中生存。而在QXT樣品里豐度最高的菌屬是unidentified_Chloroplast，其次是Ralstonia。Massilia在XXQ、QTX、SZS樣品里含量很低甚至沒(méi)有檢測(cè)出來(lái)；Gluconobacter在XXQ、YNX、SZS樣品里含量很低甚至沒(méi)有檢測(cè)出來(lái)；Sphingomonas只在YNX中存在，在其他3個(gè)樣品中含量很少甚至沒(méi)有檢測(cè)出來(lái)，Sphingomonas對(duì)芳香化合物有極為廣泛的代謝能力，并且該菌屬某些菌種能夠合成有價(jià)值的胞外生物高聚物，可帶給葡萄酒特殊的風(fēng)味。

4個(gè)不同產(chǎn)區(qū)在屬水平上優(yōu)勢(shì)菌屬不僅存在差異，而且微生物種類間也存在差異，圖6結(jié)果顯示，XXQ、QTX、SZS、YNX葡萄園中赤霞珠樣品所含的細(xì)菌OTU分別為138個(gè)、311個(gè)、225個(gè)、148個(gè)。但是與真菌不同的是，雖然QTX和SZS相聚較遠(yuǎn)，但兩個(gè)產(chǎn)區(qū)擁有相同的細(xì)菌種類卻最多，達(dá)到了82種，說(shuō)明與真菌相比，赤霞珠品種中細(xì)菌的分布受地理位置的影響較小。

圖5 細(xì)菌屬水平相對(duì)豐度柱狀圖Fig.5 Histogram of relative abundance of bacteria

圖6 細(xì)菌群落維恩圖Fig.6 Venn diagram of bacterial community

2.2.3 不同產(chǎn)區(qū)霞多麗樣品真菌豐度分析

與赤霞珠品種相比，霞多麗品種真菌的分布既有差異，也有相同之處。圖7結(jié)果顯示，在屬水平上，霞多麗樣品中最為豐富的菌屬為Alternaria、Cladosporium、Naganshia、Hanseniaspora、Aspergillus、Filobasidium和Didymella。在XXQ、YNX、SZS樣品里豐度最高的菌屬是Aspergillus，其次都是Cladosporium；在SZS樣品里豐度最高的菌屬是Cladosporium，其次是Aspergillus。Hanseniaspora在QYX樣品里豐富度較高，但是在其他3個(gè)樣品里含量很少甚至沒(méi)有檢測(cè)出來(lái)，Hanseniaspora對(duì)葡萄采后病害具有防治作用，可抑制灰霉病、炭疽病等病害[9]；而Didymella出現(xiàn)在所有樣品中，但在YNX中豐度較小，Didymella中有許多植物致病菌，所以推測(cè)QYX產(chǎn)區(qū)在本年份病害會(huì)比較輕。

從圖8可以看出，XXQ、QTX、SZS、YNX葡萄園中霞多麗樣品所含的真菌OTU分別為267、152、98、325個(gè)。其中XXQ和YNX產(chǎn)區(qū)距離最近，擁有相同的種類也最多，達(dá)到了113種；QTX和SZS產(chǎn)區(qū)相聚較遠(yuǎn)，相同的真菌種類也較小，為47種；YNX產(chǎn)區(qū)的霞多麗果皮上所含的真菌OTU值最大，而SZS產(chǎn)區(qū)的霞多麗果皮上所含的真菌OUT值最小，該結(jié)果與赤霞珠品種分析結(jié)果完全一致。

圖7 真菌屬水平相對(duì)豐度柱狀圖Fig.7 Histogram of relative abundance of fungi

圖8 真菌群落維恩圖Fig.8 Venn diagram of fungal community

2.2.4 不同產(chǎn)區(qū)霞多麗樣品細(xì)菌豐度分析

從圖9可以看出，在屬水平上，霞多麗樣品中最為豐富的菌屬為Serratia、Ralstonia、Pantoea、unidentified_Chloroplast、假單胞菌屬(Pseudomonas)。所有產(chǎn)區(qū)中都表現(xiàn)出較高的微生物多樣性。XXQ中豐度最高的菌屬是Serratia；YNX中豐度最高的菌屬是Ralstonia；QYX中豐度最高的菌屬是Ralstonia；SZS中豐度最高的菌屬是unidentified_Chloroplast。雖然最為豐富的5種菌屬在所有樣品中都存在，但是在每個(gè)產(chǎn)區(qū)中的豐度卻存在差異。

4個(gè)產(chǎn)區(qū)不僅細(xì)菌豐度存在差異，而且微生物的種類也不同，圖10結(jié)果顯示，XXQ、QTX、SZS、YNX葡萄園中霞多麗樣品所含的細(xì)菌OTU分別為700、472、600、892個(gè)，產(chǎn)區(qū)間差異非常顯著，YNX產(chǎn)區(qū)的霞多麗果皮上所含的細(xì)菌OTU值最大，而SZS產(chǎn)區(qū)的霞多麗果皮上所含的細(xì)菌OUT值最小。而且與真菌種類分布具有相同的規(guī)律，產(chǎn)區(qū)距離越近，相同的微生物種類也最多，XXQ和YNX產(chǎn)區(qū)有相同種類516種，而QTX和SZS產(chǎn)區(qū)有相同種類只有209種。

圖9 細(xì)菌屬水平相對(duì)豐度柱狀圖Fig.9 Histogram of relative abundance of bacteria

2.2.5 同產(chǎn)區(qū)不同釀酒葡萄品種真菌豐度分析

為了比較同產(chǎn)區(qū)不同釀酒葡萄品種微生物多樣性的差異，本研究比較了西夏區(qū)4個(gè)品種間微生物多樣性差異，結(jié)果如圖11、圖13所示。

從圖11可以看出，4個(gè)不同品種，由于采收期存在差異，所以在屬水平上的真菌豐度也不同。霞多麗品種最為豐富的真菌是Cladosporium、Alternaria、Naganishia、Didymella和Filobasidium，而貴人香品種最為豐富的真菌是Alternaria、Cladosporium、unidentified、Megnaporthe和Didymella；赤霞珠和馬瑟蘭品種優(yōu)勢(shì)菌屬一致，為Cladosporium、Alternaria，但除優(yōu)勢(shì)菌屬外，赤霞珠中占比較高的是Naganishia、Didymella和Epicoccum，馬瑟蘭中占比較高的是unidentified、Epicoccum和Rhodosporidiobolus。

圖11 真菌屬水平相對(duì)豐度柱狀圖Fig.11 Histogram of relative abundance of fungi

對(duì)比分析4個(gè)不同釀酒葡萄品種真菌的種類，結(jié)果如圖12所示，釀酒葡萄采收期越晚，葡萄果皮上的微生物種類也越多，GRX、XDL、CXZ、MSL 4個(gè)品種中所含的真菌OTU分別為210、267、280、366個(gè)。XDL和GRX有相同種類91種，CXZ和MSL有相同種類210種，而紅葡萄品種和白葡萄品種間擁有相同類別的真菌種類也較小，XDL和CXZ、XDL和MSL有相同種類均為56種。

圖12 真菌群落維恩圖Fig.12 Venn diagram of fungal community

細(xì)菌的豐度分布4個(gè)品種間差異較大，如圖13所示。在屬水平上，霞多麗中最豐富的是Serratia，貴人香中最豐富的是Bacteroides，而赤霞珠和馬瑟蘭中最為豐富的都是羅爾斯通氏菌屬(Ralstonia)。白葡萄品種間差異較大，除優(yōu)勢(shì)菌種外，在霞多麗中占主要比例的還有產(chǎn)堿菌屬 (Alcaligenes)、Brevundimonas、Citrobacter和Stenotrophomonas。而在貴人香中占主要比例為羅爾斯通氏菌屬(Ralstonia)、Alcaligenes、unidentified_Chloroplast和Acinetobacter。紅葡萄品種中微生物的多樣性差異相對(duì)較小，除了優(yōu)勢(shì)菌種外，在兩種葡萄中占主要比例的還有unidentified_Chloroplast、Acinetobacter和Pseudomonas。

圖14結(jié)果表明，隨著采收期的推遲，葡萄果皮上細(xì)菌的種類逐漸減少，XDL、GRX、MSL、CXZ樣品中所含的細(xì)菌OTU分別為700、567、201、138個(gè)，因此細(xì)菌的分布雖然與地理位置關(guān)系較小，但是與葡萄采收期卻密切相關(guān)，這也是白葡萄果皮上所含的細(xì)菌OTU值比紅葡萄品種大的原因所在。

圖13 細(xì)菌屬水平相對(duì)豐度柱狀圖Fig.13 Histogram of relative abundance of bacteria

圖14 細(xì)菌群落維恩圖Fig.14 Venn diagram of bacterial community

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)相似性分析

從圖15-a可以看出，當(dāng)PC1為41.07%，PC2為18.4%時(shí)，XXQ馬瑟蘭與XXQ赤霞珠樣品在PCA圖中的位置集中，距離緊密，表示這兩種樣品間微生物相似度較高。SZS赤霞珠樣品在PCA圖中比較分散，距離較遠(yuǎn)，表示樣品間微生物相似度較低，其原因可能是SZS地區(qū)的氣候夏天熱而短促、天氣經(jīng)常變化導(dǎo)致樣品間真菌微生物的不同。從圖15-b中可以看出在0.68時(shí)SZS霞多麗樣品出現(xiàn)分支，說(shuō)明此葡萄樣品間的微生物差異性較?。籗ZS赤霞珠在0.04時(shí)出現(xiàn)分支，說(shuō)明此葡萄樣品間的微生物差異性較大。

從圖16-a可以看出，當(dāng)PC1為46.27%，PC2為18.85%時(shí)，XXQ霞多麗和QTX霞多麗樣品在PCA圖中的位置集中，距離緊密，表示這兩種樣品間微生物相似度較高，其他樣品在PCA圖中比較分散，距離較遠(yuǎn)，表示樣品間微生物相似度較低。從圖16-b 中可以看出在0.32時(shí)XXQ和SZS產(chǎn)區(qū)霞多麗樣品出現(xiàn)分支，說(shuō)明此葡萄樣品間的微生物差異性較小。樣品間微生物相似度較低，可能與產(chǎn)區(qū)的空間距離、氣候特征有直接關(guān)系。

a-樣品真菌群落PCoA;b-UPGMA聚類分析圖圖15 樣品真菌β多樣性分析Fig.15 Fungal β diversity analysis of samples注：XXQC(西夏區(qū)霞多麗)、YNXC(永寧縣霞多麗)、QTXC(青銅峽霞多麗)、SZSC(石嘴山霞多麗)、XXQCS(西夏區(qū)赤霞珠)、YNXCS(永寧縣赤霞珠)、QTXCS(青銅峽赤霞珠)、SZSCS(石嘴山赤霞珠)、XXQG(西夏區(qū)貴人香)、XXQM(西夏區(qū)馬瑟蘭)(下同)

a-樣品細(xì)菌群落PCoA;b-UPGMA聚類分析圖圖16 樣品細(xì)菌β多樣性分析Fig.16 Bacterial β diversity analysis of samples

3 討論

葡萄酒釀造是一個(gè)由不同微生物參與，相互作用的復(fù)雜過(guò)程。目前產(chǎn)區(qū)所面臨的問(wèn)題主要是產(chǎn)品同質(zhì)化嚴(yán)重，缺少產(chǎn)區(qū)風(fēng)格，葡萄酒釀造多依賴進(jìn)口的商業(yè)菌株，所以研究葡萄中微生物的多樣性對(duì)提高葡萄酒質(zhì)量有舉足輕重的作用。張世偉等[10]研究發(fā)現(xiàn)，不同釀酒葡萄果皮上的優(yōu)勢(shì)真菌菌屬有Alternaria、Cladosporium、Phoma、Fusarium等。趙昱等[11]研究發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)釀酒葡萄果皮上的優(yōu)勢(shì)真菌為Phenylobacterium、Ralstonia、Aureobasidium、Rhodotorula。本研究利用高通量測(cè)序分析了XXQ、YNX、QTX、SZS產(chǎn)區(qū)赤霞珠和霞多麗果皮上微生物多樣性，檢測(cè)到的優(yōu)勢(shì)真菌屬有Alternaria、Cladosporium、Fusarium、Chaetomium、Didymella、Naganishia，Hanseniaspora、Aspergillus、Filobasidium。通過(guò)文獻(xiàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，葡萄果皮的優(yōu)勢(shì)菌屬既有相同之處也有區(qū)別，結(jié)果造成差別的原因可能是因?yàn)槠贩N、產(chǎn)區(qū)以及環(huán)境的不同。其中鏈格孢屬大多數(shù)是有害菌，會(huì)引起很多植物疾病，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)鏈格孢屬會(huì)產(chǎn)生鏈格孢醇等多種有毒的代謝產(chǎn)物，這些毒素可使人慢性或急性中毒，有些還有致癌作用[12-13]。枝孢屬和鐮刀菌屬也是有害菌，其中枝孢菌屬會(huì)使植物產(chǎn)生葉斑，從而影響其光合作用，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)使果實(shí)顏色變得暗淡[14]；鐮刀菌屬可以感染很多植物，會(huì)引起植物根莖的腐敗等多種病害，在代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生毒素，造成植物死亡，而且目前防治工作也是非常艱難的[15]。鏈格孢屬在4產(chǎn)區(qū)中都大量存在，鐮刀菌屬在SZS產(chǎn)區(qū)大量存在，建議產(chǎn)區(qū)提前防治。

魏玉潔等[16]研究發(fā)現(xiàn)，新疆葡萄產(chǎn)區(qū)中釀酒葡萄果皮上優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌菌屬有Pseudomonas、Sphingomonas和Adhaeribacter。PARK等[17]和HIRANO等[18]研究發(fā)現(xiàn)，Pseudomonas、Acinetobacter和Kaistobacter是葡萄和葉片中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌屬。LEVEAU等[19]研究發(fā)現(xiàn)Pseudomonas是霞多麗葡萄上的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌屬。本研究發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌屬有：Ralstonia、unidentified_Chloroplast、Massilia、Gluconobacter、Sphingomonas、Serratia、Pantoea、Pseudomonas。通過(guò)文獻(xiàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，葡萄果皮的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬既有相同也有區(qū)別。其中Ralstonia具有吸附水體鎘的作用[20]；Massilia具有消除環(huán)境中的多環(huán)芳烴菲、抗重金屬、產(chǎn)酶溶磷等功能[21-22]；Gluconobacter具有產(chǎn)葡糖酸鹽、參與維生素C合成等功能[23]；Serratia具有降解油脂的功能[24]；Pantoea具有抑制黑曲霉的功能[25]。檢測(cè)到的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬有些可能不是葡萄酒中常見(jiàn)的菌屬，但大多數(shù)是有益菌，對(duì)提高葡萄酒的質(zhì)量有間接作用。

4 結(jié)論

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)寧夏賀蘭山東麓XXQ、YNX、QTX、SZS 4個(gè)產(chǎn)區(qū)的30份葡萄果皮樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明：

(1)在屬水平上，無(wú)論是細(xì)菌多樣性，還是真菌多樣性，產(chǎn)區(qū)間都存在明顯差異；

(2)不同產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄樣品中最為豐富的真菌屬為鏈格孢屬、枝孢屬、鐮刀菌屬、毛殼菌屬、亞隔孢殼屬。產(chǎn)區(qū)微生物多樣性有差異，但也有相似之處，產(chǎn)區(qū)距離相距越遠(yuǎn)，微生物相似度也越低；而在細(xì)菌屬水平上，優(yōu)勢(shì)菌屬為羅爾斯通氏菌屬、unidentified_Chloroplast、馬賽菌屬、葡糖桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬，細(xì)菌的分布與產(chǎn)區(qū)地理位置相關(guān)性較?。?/p>

(3)不同產(chǎn)區(qū)霞多麗葡萄樣品中最為豐富的真菌屬為鏈格孢屬、枝孢屬、Naganshia、有孢漢遜酵母屬和曲霉屬，產(chǎn)區(qū)距離相距越遠(yuǎn)，微生物相似度也越低；而在細(xì)菌屬水平上，優(yōu)勢(shì)菌屬為沙雷氏菌屬、羅爾斯通氏菌屬、泛菌屬、unidentified_Chloroplast和假單胞菌屬，產(chǎn)區(qū)距離越近，相同的微生物種類也最多。

(4)同產(chǎn)區(qū)不同釀酒葡萄品種微生物的分布與采收期密切相關(guān)，釀酒葡萄采收期越晚，葡萄果皮上的真菌微生物種類也越多；而細(xì)菌的多樣性卻越低。

本研究對(duì)賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)的微生物多樣性進(jìn)行了詳細(xì)的分析，可為寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)微生物資源庫(kù)的構(gòu)建、優(yōu)良菌種的篩選、產(chǎn)區(qū)葡萄酒風(fēng)格的確定以及提高產(chǎn)區(qū)葡萄酒質(zhì)量提供理論基礎(chǔ)。