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基于非靶向代謝組學(xué)分析醬香型大曲中抑菌黑曲的功能成分

2022-08-04 06:44羅帥張巧玲楊帆盧建軍蒲秀鑫張娟王莉
食品與發(fā)酵工業(yè) 2022年14期
關(guān)鍵詞:呋喃醬香型大曲

羅帥,張巧玲,楊帆,盧建軍,蒲秀鑫,張娟,王莉*

1(江南大學(xué),工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無錫,214122)2(江南大學(xué),未來食品科學(xué)中心,江蘇 無錫,214122)3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)4(貴州茅臺(tái)股份有限公司,貴州 遵義,564501)

白酒按照風(fēng)味特征可分為醬香型白酒、濃香型白酒和清香型白酒。醬香型白酒酒體醇厚、回味悠長、空杯持久留香,深受消費(fèi)者的喜愛[1]。醬香型白酒釀造歷史悠久,生產(chǎn)工藝獨(dú)特,包括高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵和高溫餾酒。其中,高溫制曲是一個(gè)十分重要的環(huán)節(jié),大曲為釀造過程中的糖化、發(fā)酵、香氣產(chǎn)生提供酶和風(fēng)味物質(zhì)前體,高溫度高濕度的大曲發(fā)酵條件造就了大曲獨(dú)特的微生物群落結(jié)構(gòu)和豐富的酶體系[2]。但是,由于發(fā)酵倉的不同部位溫濕度差異導(dǎo)致了大曲菌群及代謝成分的差異。因此,一批大曲發(fā)酵完成拆倉后,大曲一般按感官評估分為三類,命名為白曲、黃曲和黑曲(blackDaqu,BQ)[3]。

降酸問題一直是醬香型白酒釀造的核心問題之一。醬香型大曲發(fā)酵較高的溫度使細(xì)菌利用小麥中的蛋白質(zhì)和糖,產(chǎn)生大量的有機(jī)酸和氨基酸,使大曲的酸度升高,酸度過高不僅導(dǎo)致大曲糖化力降低,發(fā)酵力減弱。而且還會(huì)使雜菌生長繁殖,對生產(chǎn)設(shè)備產(chǎn)生腐蝕性,加快窖泥老化,最終導(dǎo)致出酒率降低,增加生產(chǎn)成本[4-6]。我們前期偶然發(fā)現(xiàn),有些黑曲能夠抑制乳酸菌的生長,并對100多份樣品進(jìn)行了抑菌性試驗(yàn),從中獲得了2份能夠抑制乳酸菌的黑曲,稱為抑菌黑曲(antibacterial blackDaqu,BBQ)。其特征較之普通黑曲顏色更黑,風(fēng)味更加濃郁。

近年來,代謝組學(xué)方法已廣泛應(yīng)用于大曲代謝物的研究[7-8]。因此,我們基于代謝組學(xué)方法研究了黑曲和抑菌黑曲的代謝物,分析了抑菌黑曲中顯著上調(diào)的差異代謝物,明確了抑菌黑曲和黑曲的代謝功能差異,研究了目標(biāo)代謝物香蘭素、萘啶酸、2-甲基呋喃和黑色素的體外抑制乳酸菌的能力,并對它們的代謝途徑進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

醬香型高溫大曲來自貴州茅臺(tái)酒股份有限公司,在大曲拆倉時(shí)從曲倉不同部位隨機(jī)取樣,經(jīng)液氮處理后放于無菌自封袋中,保存于-40 ℃?zhèn)溆?。其?14份樣品為不同輪次黑曲樣品,任取10份黑曲樣品,碾碎后充分混合,BQ 1-1、BQ 1-2、BQ 1-3為混合黑曲樣品的3個(gè)平行樣,BBQ 1-1、BBQ 1-2、BBQ 1-3為抑菌黑曲1的3個(gè)平行樣,BBQ 2-1、BBQ 2-2、BBQ 2-3為抑菌黑曲2的3個(gè)平行樣,2株乳酸菌面包乳桿菌和耐酸片球菌由醬香型大曲中篩選獲得。

MRS培養(yǎng)基,青島海博生物技術(shù)有限公司;針頭式過濾器,生工生物工程(上海)股份有限公司;分析純香蘭素、萘啶酸、2-甲基呋喃,阿拉??;黑色素,默克;色譜級甲醇、乙腈、乙酸銨、氨水,上海佰曄生物科技中心。

1.2 儀器與設(shè)備

HDPF-256電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;ZQZY-88BH振蕩培養(yǎng)箱,上海知楚儀器有限公司;ZX-LGJ-2冷凍干燥機(jī),上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司;RE-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海愛朗儀器有限公司;UVmini-1285紫外可見分光光度計(jì),島津儀器有限公司;HVS-1000(-U)高級型潔凈工作臺(tái),蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;Vanquish超高效液相色譜儀、Q Exactive HFX高分辨質(zhì)譜儀,賽默飛世爾科技公司;JXFSTPRP-24研磨儀,上海凈信科技有限公司;PS-60AL超聲儀,深圳市雷德邦電子有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 抑菌黑曲的篩選及其抑菌性研究

取9批共114份黑曲樣品進(jìn)行抑菌性試驗(yàn),從中篩選具有抑制乳酸菌的樣品,大曲樣品粉碎后,稱取10 g大曲加入30 mL蒸餾水4 ℃浸泡過夜,低溫離心獲得大曲樣品的浸提液,真空冷凍干燥將浸提液濃縮10倍,過濾除菌獲得無菌的大曲樣品浸提液。將活化的乳酸菌菌液以1%接種量接種到等量添加大曲浸提液的MRS培養(yǎng)基中,對照用等量的無菌水替換,37 ℃培養(yǎng)12 h后,稀釋不同梯度,平板培養(yǎng),24 h后對平板菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.2 大曲代謝物提取

取100 mg樣品至EP管中。加入1 mL甲醇(含1 μg/mL內(nèi)標(biāo))后渦旋30 s,樣品在35 Hz下均質(zhì)4 min,然后在冰上超聲5 min。均質(zhì)化和超聲處理重復(fù)3次。然后將樣品在-40 ℃下孵育1 h,并在4 ℃下以12 000 r/min離心15 min。將獲得的上清液貯存用于LC/MS分析[9]。

1.3.3 LC-MS/MS分析

使用UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)與Q Exactive質(zhì)譜儀聯(lián)用的超高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行LC-MS/MS分析。液相色譜A相為水相,含25 mmol/L乙酸銨和25 mmol/L氨水,B相為乙腈。采用如下洗脫梯度:0~1.0 min,1% B;1.0~8.0 min,1%~99% B;8.0~10.0 min,99% B;10.0~10.1 min,99%~1% B;10.1~12 min,1% B。柱溫30 ℃。自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為4 ℃,進(jìn)樣量為2 μL。QE HFX質(zhì)譜儀能夠在控制軟件(Xcalibur,Thermo)控制下進(jìn)行一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。以下為ESI離子源條件:鞘氣流速為45 Arb,輔助氣流速為15 Arb,離子傳輸管溫度400 ℃,全掃描分辨率為70 000,MS/MS分辨率為17 500,碰撞能量為NCE模式下20/40/60 eV,電離電壓分別為4.0 kV(正)或-3.6 kV(負(fù))。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

使用ProteoWizard將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為mzXML格式。使用R并基于XCMS的內(nèi)部程序用于峰檢測、提取、對齊和積分[10]。XCMS包可以通過Bioconductor安裝。具體信息請參考https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html。然后與BiotreeDB(V2.1)自建二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配進(jìn)行物質(zhì)注釋。以下所有的代謝物數(shù)據(jù)分析選擇MS質(zhì)譜得分>0.6的代謝物進(jìn)行。

1.3.5 主成分分析(principal component analysis,PCA)

使用SIMCA軟件,對數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換加Par格式化處理,然后進(jìn)行自動(dòng)建模分析[11]。

1.3.6 正交偏最小二乘法-判別分析(orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis,OPLS-DA)

SIMCA軟件(V15.0.2)用于對數(shù)轉(zhuǎn)換和UV格式化處理,以可靠地篩選組間的差異代謝物。通過OPLS-DA建模和第一主成分分析來評估模型的質(zhì)量。使用7-flod交叉驗(yàn)證進(jìn)行測試。然后,通過R2Y(模型對分類變量Y的可解釋性)和Q2(模型的可預(yù)測性)來估計(jì)模型的準(zhǔn)確性。最后采用置換檢驗(yàn)隨機(jī)多次改變分類變量Y的排列順序得到不同的隨機(jī)Q2值,進(jìn)一步檢驗(yàn)?zāi)P陀行訹12]。

1.3.7 差異代謝物篩選和火山圖

t檢驗(yàn)和方差分析等是單變量統(tǒng)計(jì)分析的方法,它們更關(guān)注代謝物的獨(dú)立變化,為了防止使用單一數(shù)據(jù)分析方法造成的假陽性或模型過擬合,我們使用多元統(tǒng)計(jì)分析,P值<0.05和OPLS-DA模型中第一主成分(PC 1)的投影中的變量投影重要度(variable importance in the projection,VIP)>1作為差異代謝物的篩選標(biāo)準(zhǔn)并繪制火山圖[13]。

1.3.8 抑菌物質(zhì)對乳酸菌抑制效果驗(yàn)證

將上述數(shù)據(jù)分析得到香蘭素、萘啶酸、黑色素和2-甲基呋喃4種抑菌物質(zhì)設(shè)置不同濃度梯度過濾除菌,將活化的乳酸菌以1%接種量接入加入抑菌物質(zhì)的培養(yǎng)基中,220 r/min搖床培養(yǎng)24 h,以不加抑菌物質(zhì)的培養(yǎng)基作為對照,隔2 h測600 nm處的OD值。由于黑色素加入培養(yǎng)基后顏色深,測量誤差較大,采用平板計(jì)數(shù)法測定抑菌效果,將黑色素溶解于1 mol/L氨水,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至黑色素溶液pH為7.0~7.5,過濾除菌后加入,以無菌水代替黑色素溶液作為對照,培養(yǎng)12 h后將加入黑色素的乳酸菌培養(yǎng)液稀釋不同梯度,吸取15 μL點(diǎn)接在平板上,37 ℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。

1.3.9 抑菌黑曲和黑曲KEGG通路差異豐度分析

從大量的注釋通路中找到有價(jià)值的代謝通路是代謝組學(xué)數(shù)據(jù)挖掘的一大難題。差異豐度得分是一種基于通路的代謝變化分析方法,可以直觀清晰的展示相關(guān)代謝通路的在抑菌黑曲和黑曲上下調(diào)情況以及所屬代謝類型[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌黑曲的篩選及其抑菌性研究

如圖1-A所示,對9批共114份黑曲樣品做了抑菌性試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)黑曲都不存在抑制乳酸菌的作用,僅3%黑曲樣品存在顯著抑制作用,取2份抑菌黑曲樣品和1份黑曲樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)。如圖1-B、圖1-C所示,與對照組及黑曲浸提液相比,抑菌黑曲浸提液加入培養(yǎng)基后,對乳酸菌有顯著的抑制效果,對照組及加入黑曲浸提液后,菌落存活數(shù)為加入抑菌黑曲浸提液的1 000倍左右,抑菌黑曲1的抑制效果更強(qiáng)些,我們推測抑菌黑曲的抑菌作用可能與某些抑菌素有關(guān),因此接下來對其代謝物進(jìn)行了研究。

A-抑菌黑曲樣品占比;B-樣品及對照平板菌落生長情況;C-樣品及對照平板菌落計(jì)數(shù)圖1 不同大曲浸提液對乳酸菌生長的影響Fig.1 Effects of different Daqu extracts on the growth of lactic acid bacteria

2.2 抑菌黑曲和黑曲代謝物PCA

在不同樣品中共檢測到1 290種代謝物。所有樣本的PCA得分散點(diǎn)圖如圖2所示,其中橫坐標(biāo)(PC1)和縱坐標(biāo)(PC2)分別代表第一主成分和第二主成分的得分。不同顏色的散點(diǎn)代表不同的樣本,散點(diǎn)分布越近,樣本的代謝物種類和豐度越類似,如果樣本距離越遠(yuǎn),表示差異越大。如圖2所示,所有樣本都在95%置信區(qū)間內(nèi)(Hotelling的T方橢圓)。該結(jié)果表明不同類型大曲的代謝物存在顯著差異,但組內(nèi)平行樣品間無明顯偏差。

圖2 所有樣本的PCA 模型的分?jǐn)?shù)散點(diǎn)圖Fig.2 Score scatter plot for PCA model total

2.3 抑菌黑曲和黑曲OPLS-DA

在OPLS-DA中,在篩選出與分類變量無關(guān)的正交變量后,通過分析非正交變量和正交變量獲得樣品之間代謝物的差異和相關(guān)性。如圖3-A和圖3-B所示,PC 1的預(yù)測主成分得分以橫坐標(biāo)t[1]P顯示,正交主成分得分以縱坐標(biāo)t[1]O顯示,不同形狀和顏色的散點(diǎn)表示不同的樣本。OPLS-DA評分結(jié)果顯示抑菌黑曲的代謝物與黑曲有顯著差異。

圖3-C和圖3-D中,橫坐標(biāo)代表置換檢驗(yàn)的置換保留(與原模型的Y變量序列一致的比例,置換保留等于1的點(diǎn)就是R2Y和Q2的值),縱坐標(biāo)分別代表R2Y和Q2的回歸線。圖中R2Y值足夠接近1,說明模型充分反映了樣品代謝物的真實(shí)情況。另外,Q2值與R2Y值相近,說明樣本量足夠,不會(huì)造成較大誤差。因此,模型可以解釋樣本之間的差異。隨機(jī)模型置換檢驗(yàn)的Q2值低于原模型,Q2回歸線與縱軸截距均<0。而且,Y變量的比例隨著排列保留率的降低而增加,隨機(jī)模型的Q2值與排列保留率的變化一致。這表明原始模型能夠準(zhǔn)確地反映樣本的差異。

A-抑菌黑曲1與黑曲的OPLS-DA模型的分?jǐn)?shù)散點(diǎn)圖;B-抑菌黑曲2與黑曲的OPLS-DA模型的分?jǐn)?shù)散點(diǎn)圖;C-抑菌黑曲1與黑曲的OPLS-DA模型的置換檢驗(yàn);D-抑菌黑曲2與黑曲的OPLS-DA模型的置換檢驗(yàn)圖3 OPLS-DA的分析結(jié)果Fig.3 Score scatter plot of OPLS-DA model

2.4 差異代謝物篩選和火山圖

如圖4所示,火山圖中不同顏色的點(diǎn)是不同的代謝物。橫坐標(biāo)是兩組之間每種代謝物的相對豐度倍數(shù)(以2為底的對數(shù)),縱坐標(biāo)是指t檢驗(yàn)的P值(以10為底的對數(shù))。每種代謝物的VIP值以散點(diǎn)面積表示。散點(diǎn)越大,表示代謝物的VIP值越大。在本研究中,不同樣品共檢測到1 290種代謝物,抑菌黑曲1與黑曲相比有348種上調(diào)的差異代謝物,抑菌黑曲2與黑曲相比有445種上調(diào)的差異代謝物(P<0.05,VIP>1)。其中,抑菌黑曲1和抑菌黑曲2共同上調(diào)的差異代謝物259種,包括79種有機(jī)雜環(huán)化合物、65種有機(jī)酸及其衍生物、35種有機(jī)氧化合物、26種苯類、22種脂質(zhì)和類脂分子、12種苯丙烷和聚酮化合物、5種生物堿及其衍生物、15種其他化合物。

通過以上篩選條件得到了259種在抑菌黑曲中顯著上調(diào)的差異代謝物,由于數(shù)量過多,無法一一進(jìn)行研究,因此,我們添加篩選條件,篩選259種物質(zhì)中在抑菌黑曲和黑曲的相對豐度差異倍數(shù)在2倍以上的代謝物,獲得81種P值<0.05,VIP值>1及差異倍數(shù)(fold change,F(xiàn)C)>2的物質(zhì),然后對81種物質(zhì)按照相對豐度的高低進(jìn)行排序。最后對相對豐度排名前20的物質(zhì)進(jìn)行深入研究(表1),根據(jù)相關(guān)研究報(bào)道,豐度排名前20的物質(zhì)中,香蘭素、萘啶酸和2-甲基呋喃對某些微生物存在抑制作用,趙建芬等[15]的研究表明,香蘭素對大腸埃希氏菌和枯草芽孢桿菌有較強(qiáng)的抑制作用。萘啶酸是喹諾酮類抗菌藥,對引起腹瀉病的彎曲桿菌屬有一定的抑菌作用[16]。2-甲基呋喃是美拉德反應(yīng)的典型中間產(chǎn)物,許多美拉德反應(yīng)都存在抑菌活性[17]。此外,我們發(fā)現(xiàn)豐度排名前20的物質(zhì)中,包括酪氨酸和多巴,二者是黑色素合成的前體,同時(shí),黑色素也是抑菌黑曲中顯著上調(diào)的差異代謝物。研究表明,黑色素是酶促褐變的產(chǎn)物,對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有很強(qiáng)的抑菌活性[18]。香蘭素和黑色素是苯類化合物,2-甲基呋喃和萘啶酸是有機(jī)雜環(huán)類化合物。因此,接下來我們對這4種物質(zhì)體外抑制乳酸菌的活性進(jìn)行研究。

2.5 抑菌物質(zhì)對乳酸菌的抑制效果驗(yàn)證

將4種抑菌物質(zhì)根據(jù)上述報(bào)道的抑菌特性,根據(jù)其最低抑菌活性及抑菌性能,設(shè)置不同濃度梯度培養(yǎng)乳酸菌,以大曲中篩選得到的面包乳桿菌和耐酸片球菌為指示菌,如圖5所示,香蘭素和2-甲基呋喃對乳酸菌有較強(qiáng)的抑菌作用,隨著它們的濃度升高,其抑菌效果增強(qiáng)。萘啶酸對乳酸菌的抑制作用稍弱,當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.1 g/L時(shí),出現(xiàn)抑制作用。

A-抑菌黑曲1與黑曲中差異代謝物的火山圖;B-抑菌黑曲2與黑曲中差異代謝物的火山圖;C-抑菌黑曲中上調(diào)的差異代謝物分類及數(shù)量;D-抑菌物質(zhì)相對豐度熱圖圖4 抑菌黑曲與黑曲的差異代謝物篩選Fig.4 Screening of differential metabolites of BBQ vs BQ注:圖A,B中散點(diǎn)的不同顏色表示代謝物在抑菌黑曲中是否上調(diào);抑菌黑曲中上調(diào)的代謝物是紅色的;抑菌黑曲中下調(diào)的代謝物是藍(lán)色的;灰色表示抑菌黑曲與黑曲沒有顯著差異

A-香蘭素對面包乳桿菌生長的影響;B-香蘭素對耐酸片球菌生長的影響;C-萘啶酸對面包乳桿菌生長的影響;D-萘啶酸對耐酸片球菌生長的影響;E-2-甲基呋喃對面包乳桿菌生長的影響;F-2-甲基呋喃對耐酸片球菌生長的影響圖5 抑菌物質(zhì)對乳酸菌生長的影響Fig.5 The effect of bacteriostatic substances on the growth of lactic acid bacteria

如圖6所示,黑色素隨著濃度的升高,平板上生長的菌落數(shù)明顯減少,抑制作用明顯增強(qiáng)。大曲發(fā)酵是混菌發(fā)酵的過程,有成千上萬種微生物發(fā)揮作用,產(chǎn)生數(shù)千種代謝物,香蘭素、萘啶酸、2-甲基呋喃等代謝物在黑曲中積累,使其具有抑制乳酸菌的作用,形成抑菌黑曲。

表1 抑菌黑曲中顯著上調(diào)的20種代謝物在不同樣本中相對豐度Table 1 Relative abundances in different samples of 20 metabolites significantly up-regulated in BBQ

2.6 抑菌黑曲和黑曲KEGG通路差異豐度分析

如圖7所示,氨基酸代謝中,只有酪氨酸代謝在抑菌黑曲中上調(diào),說明抑菌黑曲的代謝方向主要為風(fēng)味物質(zhì)轉(zhuǎn)換,該代謝途徑的起始物質(zhì)為酪氨酸,酪氨酸在一種多酚氧化酶-酪氨酸酶的催化下,經(jīng)過氧化聚合作用,形成黑色素[19],黑色素在抑菌黑曲中上調(diào),產(chǎn)生抑制乳酸菌的作用,這也解釋了抑菌黑曲外觀比黑曲更黑的原因。

A-平板圖;B-菌落個(gè)數(shù)圖6 黑色素對乳酸菌生長的影響平板計(jì)數(shù)Fig.6 Effect of melanin on the growth of lactic acid bacteria

圖7 抑菌黑曲和黑曲KEGG通路差異豐度圖Fig.7 The KEGG pathway differential abundance map of BBQ vs BQ注:圖中通路的不同顏色表示通路所屬不同的代謝分類,線段表示該通路的上下調(diào)情況,線段數(shù)值為正則表示該通路整體上調(diào),反之,表示通路整體下調(diào);線段端點(diǎn)的大小表示該通路中被注釋的物質(zhì)數(shù)量

此外,大多數(shù)氨基酸代謝都在抑菌黑曲中下調(diào),在黑曲中上調(diào),說明抑菌黑曲中的氨基酸更傾向于與小麥中還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng),形成很多有機(jī)雜環(huán)類代謝物,使得抑菌黑曲中存在極多的顯著上調(diào)的有機(jī)雜環(huán)類差異代謝物,包括存在抑制乳酸菌活性的2-甲基呋喃和萘啶酸。而黑曲中氨基酸更傾向于代謝成小分子。

2.7 抑菌黑曲抑菌成分代謝網(wǎng)絡(luò)分析

大曲發(fā)酵是固態(tài)發(fā)酵過程,大量微生物產(chǎn)生豐富的酶系,包括多種淀粉酶和蛋白酶,淀粉酶和蛋白酶水解原料小麥產(chǎn)生氨基酸和還原糖[20],醬香型大曲高溫高濕的發(fā)酵環(huán)境及豐富的氨基酸和還原糖為美拉德反應(yīng)提供了條件[21],氨基酸和還原糖經(jīng)過聚合、縮合等反應(yīng),產(chǎn)生吡啶、吡咯、呋喃、吡嗪等有機(jī)雜環(huán)類物質(zhì),包括2-甲基呋喃和萘啶酸,2-甲基呋喃是由典型美拉德反應(yīng)產(chǎn)物糠醛轉(zhuǎn)化而來,各種有機(jī)雜環(huán)類物質(zhì)經(jīng)過復(fù)雜的轉(zhuǎn)化最終生成棕色甚至是棕黑色的大分子物質(zhì)類黑素。

如圖8所示,制曲原料小麥中的氨基酸還能被微生物利用進(jìn)入氨基酸代謝,苯丙氨酸代謝途徑中,苯丙氨酸、肉桂酸和對香豆酸等在抑菌黑曲中顯著下調(diào),用于合成香蘭素。下調(diào)的苯丙氨酸還用于形成酪氨酸進(jìn)入酪氨酸代謝,該代謝通路上的酪氨酸、L-多巴、多巴色素和黑色素均在抑菌黑曲中上調(diào),使黑色素在抑菌黑曲中積累,產(chǎn)生抑制乳酸菌作用。

圖8 抑菌物質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)Fig.8 Metabolism network of antibacterial substances注:紅色表示在抑菌黑曲中顯著上調(diào)的代謝物,藍(lán)色表示在抑菌黑曲中顯著下調(diào)的代謝物

3 結(jié)論

利用非靶向代謝組學(xué)對抑菌黑曲和黑曲的代謝物進(jìn)行解析,明確了抑菌黑曲中抑制乳酸菌的代謝物,并對抑菌物質(zhì)的代謝過程進(jìn)行了解析,為醬香型白酒的降酸問題提供理論依據(jù)從而達(dá)到提高白酒品質(zhì)的目的。研究表明,抑菌黑曲和黑曲的代謝表型存在顯著差異,抑菌黑曲中存在259種顯著上調(diào)的差異代謝物,經(jīng)過分析和體外抑菌性試驗(yàn)明確了香蘭素,萘啶酸,2-甲基呋喃和黑色素4種具有抑制乳酸菌作用的代謝物。抑菌黑曲中各種氨基酸代謝顯著下調(diào),表明抑菌黑曲中氨基酸用于美拉德反應(yīng),產(chǎn)生大量雜環(huán)類物質(zhì)包括2-甲基呋喃和萘啶酸,抑菌黑曲中酪氨酸代謝上調(diào),產(chǎn)生具有抑菌效果的黑色素,香蘭素是苯丙氨酸代謝的產(chǎn)物。以上的分析對于醬香型白酒降酸問題的解決提供理論基礎(chǔ),對白酒釀造提供優(yōu)質(zhì)大曲和白酒質(zhì)量的提升有一定貢獻(xiàn)。后期工作可以通過蛋白組學(xué)和宏基因組學(xué)對抑菌黑曲中抑菌成分的來源微生物和代謝途徑做進(jìn)一步解析。

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