魏敏華,李宇虹,張佳蓉,孟靜,孟燕,王浚哲,張成林
(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津,300457)
5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid)是生物體內(nèi)合成葉綠素、血紅素和維生素B12等四氫吡咯化合物的前體物,廣泛存在于微生物及動植物細胞中[1-2]。5-氨基乙酰丙酸因具有很好的安全性、特異性和滲透性,近年來被應(yīng)用于腫瘤的定位和光動力學(xué)診斷[3]。此外,該物質(zhì)還被用作植物生長促進劑、殺蟲劑、除草劑等[4]。由此可見,5-氨基乙酰丙酸具有廣闊的市場前景。
目前工業(yè)上主要采用化學(xué)法合成5-氨基乙酰丙酸,但該方法成本較高且對環(huán)境污染嚴重[5]。近年來,隨著代謝工程和合成生物學(xué)的迅猛發(fā)展,生物法合成5-氨基乙酰丙酸倍受關(guān)注,底盤細胞主要集中于大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌。目前已發(fā)現(xiàn)C4和C5兩條5-氨基乙酰丙酸途徑[6]。前者以甘氨酸和琥珀酰輔酶A為前體經(jīng)5-氨基乙酰丙酸合成酶催化合成。利用該途徑合成5-氨基乙酰丙酸的研究較為深入,主要策略為在底盤細胞中過表達5-氨基乙酰丙酸合成酶編碼基因,并在發(fā)酵過程中添加甘氨酸和(或)琥珀酸(或琥珀酰輔酶A)[2,7-8]。但甘氨酸對細胞具有毒害作用,且底物添加增加了發(fā)酵工藝的復(fù)雜性和生產(chǎn)成本[2]。C5途徑以L-谷氨酸為前體合成,因此可利用葡萄糖直接發(fā)酵合成(圖1)。谷氨酸棒桿菌因能在天然條件下合成L-谷氨酸,被視為5-氨基乙酰丙酸的理想底盤細胞[9-11]。RAMZI等[10]首次報道了在谷氨酸棒桿菌中過表達來源于沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)的5-氨基乙酰丙酸合成關(guān)鍵酶谷氨酰-tRNA還原酶編碼基因hemAM和谷氨酸-1-半醛氨基轉(zhuǎn)移酶編碼基因hemL,重組菌株可合成457 mg/L 5-氨基乙酰丙酸,實現(xiàn)了利用C5途徑直接發(fā)酵合成5-氨基乙酰丙酸。同時期,YU等[11]在谷氨酸棒桿菌中構(gòu)建了C5途徑,并發(fā)現(xiàn)Fe2+和溶氧是影響5-氨基乙酰丙酸的關(guān)鍵因素,經(jīng)優(yōu)化可合成1.79 g/L 5-氨基乙酰丙酸。我們在前期研究中,通過強化5-氨基乙酰丙酸合成途徑、增強輔酶合成、動態(tài)調(diào)控三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環(huán)及5-氨基乙酰丙酸輸出等策略,使其產(chǎn)量提高到3.16 g/L[12]。
本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上,進一步探索影響5-氨基乙酰丙酸的關(guān)鍵因素。包括阻斷L-谷氨酸的輸出、利用脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)腳手架組裝谷氨酰-tRNA還原酶和谷氨酸-1-半醛氨基轉(zhuǎn)移酶、強化TCA循環(huán)等(圖1),以期為提升5-氨基乙酰丙酸的合成效率提供依據(jù)。
圖1 5-氨基乙酰丙酸合成途徑及本研究主要策略Fig.1 Pathway for synthesis of 5-aminolevulinic acid and the strategies used in this study注:Glc,葡萄糖;PEP,磷酸烯醇式丙酮酸;Pyr,丙酮酸;OAA,草酰乙酸;AcCoA,乙酰輔酶A;CIT,檸檬酸;ICI,異檸檬酸;α-KG,α-酮戊二酸;SUCC,琥珀酸輔酶A;SUC,琥珀酸;Glu,谷氨酸;GlutRNA,谷氨酸酰tRNA;GSA,谷氨酸-1-半醛;5-ALA,5-氨基乙酰丙酸;ADB,人工DNA結(jié)合域;B,ADB結(jié)合DNA序列
無機鹽、葡萄糖等,國藥集團試劑有限公司;5-氨基乙酰丙酸,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;DNA提取等試劑盒,美國Omega Bio-Tek公司;限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶等,寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;一步法克隆試劑盒,南京諾唯贊生物科技有限公司;三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)檢測試劑盒,普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司;NADPH檢測試劑盒,美國博世生物技術(shù)有限公司;人工DNA結(jié)合域ADB2和ADB3編碼序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。
PTC-1148型聚合酶鏈式反應(yīng)PCR儀,美國Bio-Rad公司。
本研究中使用的菌株和質(zhì)粒見表1。其中E.coliDH5α用于質(zhì)粒構(gòu)建和復(fù)制,谷氨酸棒桿菌C.glutamicumATCC13032為出發(fā)菌株。
引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成,序列見表2。
表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids
LB培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10,pH 7.0~7.5。
BHIS培養(yǎng)基(g/L):Brain-Heart Infusion 37,山梨醇91,pH 7.0~7.2。
種子培養(yǎng)基(g/L):Brain-Heart Infusion 37,葡萄糖0.5,自然pH。
CGXII培養(yǎng)基:葡萄糖50 g/L,(NH4)2SO45 g/L,尿素1 g/L,KH2PO40.5 g/L,K2HPO40.5 g/L,MgSO40.125 g/L,3-嗎啉丙磺酸42 g/L,ZnSO4·7H2O 10 mg/L,CuSO40.2 mg/L,NiCl2·6H2O 0.02 mg/L,生物素0.2 mg/L,pH 7.0~7.5。
利用引物HemA-1和HemA-2擴增ADB2序列利用一步法克隆試劑盒連接至經(jīng)PstI酶切的pAL4質(zhì)粒;獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)XbaI酶切與利用引物HemL-1和HemL-2擴增的ADB3序列連接,經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定后將重組質(zhì)粒命名為pX-AL。分別將合成的ADB2結(jié)合位點B2及ADB3結(jié)合位點B3以1∶1、2∶1及1∶2比例合成連接至經(jīng)BamH I酶切的pEC-XK99EΔlacIΔPtrc,經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定后將重組質(zhì)粒命名為pE11、pE21和pE12[13-14]。
表2 引物Table 2 Primers
利用基于自殺質(zhì)粒pK18mobsacB的基因重組方法進行基因敲除和敲入。以敲除NCgl1221為例,分別利用引物NCgl1221-1/NCgl1221-2和NCgl1221-3/NCgl1221-4擴增NCgl1221基因上下游同源臂,再利用引物NCgl1221-1/NCgl1221-4經(jīng)重疊PCR獲得融合片段ΔNCgl1221,將其連接至經(jīng)XbaI酶切的pK18mobsacB,獲得pK18mob-ΔNCgl1221。重組質(zhì)粒pK18 mob-ΔNCgl1221電轉(zhuǎn)化至C.glutamicumATCC13032,經(jīng)2輪篩選并鑒定后獲得重組菌株C.glutamicumΔNCgl1221。利用相同的方法獲得菌株ALA-5~ALA-10[15]。
將菌株在LB斜面培養(yǎng)基活化后,挑取適量菌體至種子培養(yǎng)基(根據(jù)需要添加100 mg/L氨芐青霉素或/和50 mg/L卡那霉素),32 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)10 h,即為種子培養(yǎng)物。以10%的接種量將上述每個種子培養(yǎng)物分別接種至3個30 mL CGXII培養(yǎng)基(根據(jù)需要添加100 mg/L氨芐青霉素或/和50 mg/L卡那霉素),用氨水維持pH 7.0~7.5,于32 ℃,220 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。每個實驗共重復(fù)3次。
菌體生物量以O(shè)D600值計。發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液經(jīng)13 000 r/min離心2 min后取上清液適當(dāng)稀釋。取 2 mL 上清液,加入0.5 mL乙酰丙酮和1 mL的乙酸鈉緩沖液(1 mol/L,pH 4.6),沸水浴15 min后冷卻至室溫。取上述反應(yīng)液2 mL與2 mL對二甲氨基苯甲醛顯色劑混合,反應(yīng)30 min后于554 nm下測定吸光度[15]。
如前所述,谷氨酸棒桿菌C.glutamicumATCC13032在天然條件下即可積累L-谷氨酸,而L-谷氨酸是5-氨基乙酰丙酸的前體物。NCgl1221編碼的通道蛋白MscCG是L-谷氨酸的輸出載體,可將胞內(nèi)過量的L-谷氨酸分泌至胞外[16]。研究表明,敲除NCgl1221基因可阻斷胞內(nèi)L-谷氨酸的分泌[17]。采用重疊PCR擴增NCgl1221基因同源臂同源片段,并連接至自殺質(zhì)粒pK18mobsacB,獲得重組質(zhì)粒pK18-ΔNCgl1221。將pK18-ΔNCgl1221轉(zhuǎn)化至C.glutamicumATCC13032,經(jīng)2輪重組、篩選后挑取單菌落進行菌落PCR驗證。結(jié)果如圖2所示,獲得堿基數(shù)約為1 000 bp和2 932 bp的片段,分別與敲除和未敲除的NCgl1221一致(分別為1 009 bp和2 932 bp)。表明該基因成功敲除,將其命名為C.glutamicumΔNCgl1221。
為考察C.glutamicumΔNCgl1221的特性,對其進行搖瓶培養(yǎng)。與C.glutamicumATCC13032相比,C.glutamicumΔNCgl1221的生物量未見明顯差異。但其谷氨酸分泌量減少到痕量(圖3-a)。將克隆有hemAM和hemL(分別編碼5-氨基乙酰丙酸合成關(guān)鍵酶谷氨酰-tRNA還原酶和谷氨酸-1-半醛氨基轉(zhuǎn)移酶)的重組質(zhì)粒pAL4分別轉(zhuǎn)化至C.glutamicumATCC13032和C.glutamicumΔNCgl1221(分別獲得菌株ALA-C和ALA-1),以考察敲除NCgl1221對其合成5-氨基乙酰丙酸的影響。結(jié)果如圖3-b所示,二者生長亦無差異,但C.glutamicumΔNCgl1221的5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量達到0.62 g/L,較前者提高26.5%。上述結(jié)果表明,敲除NCgl1221基因可有效阻止胞內(nèi)L-谷氨酸的外排,為5-氨基乙酰丙酸的合成提供更多前體,從而促進其合成。
M-Marker;1-C.glutamicumΔNCgl1221;2-C.glutamicumATCC13032菌圖2 C.glutamicumΔNCgl1221菌落PCR鑒定圖譜Fig.2 Map for PCR identification of C.glutamicumΔNCgl1221
a-菌株合成L-谷氨酸的特性;b-菌株合成5-氨基乙酰丙酸的特性圖3 NCgl1221敲除對工程菌株特性的影響Fig.3 Effect of NCgl1221 deletion on characteristics of engineered strains
在微生物尤其是原核生物細胞內(nèi),合成途徑中前一個酶將中間代謝產(chǎn)物傳遞給下一個酶完全依賴于該產(chǎn)物的自由擴散及與酶的碰撞,從而限制了反應(yīng)效率[18]。此外,對細胞生長和代謝有毒害作用的中間代謝產(chǎn)物不能及時消耗亦會影響其代謝速率[19-20]。DNA腳手架體系可將數(shù)種酶有序組裝在DNA腳手架上,減小了酶與酶之間中間代謝產(chǎn)物的傳遞難度并有效緩解其過量積累,從而提高代謝反應(yīng)效率。其原理是將含有人工DNA結(jié)合域(artificial DNA binding domain,ADB)的鋅指蛋白融合于關(guān)鍵酶的N端或C端;不同的ADB識別和結(jié)合的靶DNA序列B不同;將不同靶DNA序列按需求串聯(lián)到質(zhì)粒上,帶有ADB的關(guān)鍵酶則會按順序組裝到靶DNA序列上(圖4-a),從而縮小了酶與酶中間代謝產(chǎn)物傳遞的空間[21]。LIU等[22]利用該系統(tǒng)在枯草芽孢桿菌中組裝N-乙酰氨基葡萄糖合成關(guān)鍵酶氨基葡萄糖-果糖-6-磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶和氨基葡萄糖-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶,最高使得N-乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量提高2.5倍。
本研究利用DNA腳手架體系組裝5-氨基乙酰丙酸合成關(guān)鍵酶谷氨酰-tRNA還原酶和谷氨酸-1-半醛氨基轉(zhuǎn)移酶,以考察其對5-氨基乙酰丙酸合成效率的影響。如圖4-a所示,本研究構(gòu)建了3種DNA腳手架,以獲得最佳組合方式。采用搖瓶發(fā)酵實驗考察菌株發(fā)酵特性,結(jié)果如圖4-b所示。與對照菌株ALA-1相比,3株菌的生長未見明顯差異。其中ALA-2的5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量與ALA-1接近(0.61 g/L),ALA-4的產(chǎn)量明顯低于ALA-1,ALA-3產(chǎn)量達到0.84 g/L,較ALA-1提高35.5%。由此可見,以DNA腳手架B2和B3比例為2∶1時效果最佳。
a-DNA腳手架體系應(yīng)用策略;b-菌株發(fā)酵特性圖4 DNA腳手架體系及其對工程菌5-氨基乙酰丙酸合成的影響Fig.4 DNA scaffold systems and their effects on synthesis of 5-aminolevulinic acid of engineered strains
草酰乙酸是TCA循環(huán)的重要前體物。在谷氨酸棒桿菌中,草酰乙酸主要來源于丙酮酸羧化酶(由pyc編碼)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(由ppc編碼)催化的回補途徑(anaplerotic pathway)[23]。研究表明,二者均能增強草酰乙酸的供應(yīng)并促進細胞生長。此外,有研究表明來源于曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌(Mannheiemiasucciniciproducens)的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(由pckA編碼)在催化草酰乙酸合成的同時還可生成ATP[24]。為考察上述3種羧化酶對5-氨基乙酰丙酸合成的影響,分別采用將出發(fā)菌株ALA-3的pyc和ppc的啟動子替換為強啟動子Ptuf、基因組整合Ptuf-pckA的方式強化其表達。
分別將重組質(zhì)粒pK18mobsacBPpyc::Ptuf、pK18mobsacBPppc::Ptuf和pK18mobsacBPtuf-pckA電轉(zhuǎn)化至ALA-3,經(jīng)2輪篩選后挑取單菌落進行菌落PCR驗證。如圖5所示,分別獲得堿基數(shù)約為2 000、2 000 、3 000 bp的片段,與實際值一致(分別為2 100、2 040、2 920 bp),表明啟動子替換成功,分別命名為ALA-5、ALA-6和ALA-7。
M-Marker;1-ALA-3;2-ALA-5、ALA-6或ALA-7a-ALA-5的鑒定圖譜;b-ALA-6的鑒定圖譜;c-ALA-7的鑒定圖譜圖5 菌株ALA-5、ALA-6和ALA-7菌落PCR鑒定圖譜Fig.5 Map for PCR identification of ALA-5, ALA-6 and ALA-7
搖瓶發(fā)酵實驗結(jié)果表明,強化丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化的2條回補途徑均有利于5-氨基乙酰丙酸的合成,3株菌的產(chǎn)量分別達到0.96、1.07、1.12 g/L,較對照菌株ALA-3提高14.2%、27.4%和33.3%(圖6-a),可見過表達pckA效果最佳。推測原因是,5-氨基乙酰丙酸合成途徑中谷氨酸氨酰-tRNA合成酶需要ATP,來源于M.succiniciproducens的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶在催化草酰乙酸合成的同時為其提供ATP。為驗證該推測,測定了菌株的胞內(nèi)ATP濃度,結(jié)果表明ALA-7的胞內(nèi)ATP濃度顯著高于ALA-3、ALA-5和ALA-6(圖6-b)。由于過表達ppc基因的效果優(yōu)于過表達pyc基因,故為進一步提高草酰乙酸供應(yīng),將菌株ALA-7中的ppc基因啟動子替換為Ptuf,獲得菌株ALA-8。發(fā)酵實驗結(jié)果表明,該菌株的生長和5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量顯著下降(圖6-a)。推測原因是,過表達pckA后使得磷酸烯醇式丙酮酸向草酰乙酸的代謝流增強,而向丙酮酸的代謝流相對減弱;在此基礎(chǔ)上過表達ppc使得更多的磷酸烯醇式丙酮酸用于草酰乙酸合成,而非用于丙酮酸,從而使得TCA循環(huán)代謝流減弱,影響了細胞生長和5-氨基乙酰丙酸的合成。
a-菌株發(fā)酵特性;b-胞內(nèi)ATP濃度圖6 增強回補途徑對菌株5-氨基乙酰丙酸發(fā)酵性能的影響Fig.6 Effect of enhancing anaplerotic pathway on 5-aminolevulinic acid production of engineered strains
由gltA編碼的檸檬酸合成酶催化草酰乙酸和乙酰輔酶A合成檸檬酸,是TCA循環(huán)的第1個關(guān)鍵酶[25]。前期研究發(fā)現(xiàn)過表達該基因可增強TCA循環(huán)代謝流。為考察gltA過表達對5-氨基乙酰丙酸合成的影響,將其啟動子替換為強啟動子Ptuf。將重組質(zhì)粒pK18-PgltA::Ptuf電轉(zhuǎn)化至菌株ALA-7,經(jīng)2輪重組、篩選后挑取單菌落進行菌落PCR驗證。結(jié)果如圖7-a所示,獲得堿基數(shù)約為1 500 bp,與替換為Ptuf的實際值一致(1 422 bp),表明啟動子替換成功,命名為ALA-9。搖瓶發(fā)酵實驗結(jié)果表明,菌株ALA-9的生物量高于ALA-7;其5-氨基乙酰丙酸的產(chǎn)量為1.26 g/L,提高12.5%,暗示過表達gltA有利于增強TCA循環(huán)代謝流,從而為5-氨基乙酰丙酸的合成提供更多前體物L(fēng)-谷氨酸。
合成L-谷氨酸的谷氨酸脫氫酶以及谷氨酰-tRNA還原酶均需NADPH為輔酶,故推測強化NADPH供應(yīng)可能有利于5-氨基乙酰丙酸的合成。吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶(由pntAB編碼)能夠催化NAD+生成NADPH,增強NADPH的供應(yīng)[26]。與大腸桿菌不同,谷氨酸棒桿菌中未發(fā)現(xiàn)pntAB基因。異檸檬酸既可經(jīng)異檸檬酸脫氫酶催化合成α-酮戊二酸,亦可經(jīng)異檸檬酸裂解酶(由aceA編碼)裂解為乙醛酸和琥珀酸。前期研究表明,敲除aceA基因可提高α-酮戊二酸的合成。故將來源于大腸桿菌的pntAB基因連同Ptuf整合到菌株ALA-9基因組aceA基因位點,以期增強α-酮戊二酸及NADPH供應(yīng)。如圖7-b所示,對重組菌株進行菌落PCR鑒定,獲得堿基數(shù)約為1 500 bp的片段,與pntAB基因整合菌株的實際值一致(1 612 bp),表明pntAB基因成功整合,將其命名為ALA-10。
M-Marker;1-ALA-8;2-ALA-9或ALA-10a-ALA-9的鑒定圖譜;b-ALA-10的鑒定圖譜圖7 菌株ALA-9和ALA-10菌落PCR鑒定圖譜Fig.7 Map for PCR identification of ALA-9 andALA-10
搖瓶發(fā)酵實驗結(jié)果表明,菌株ALA-10與出發(fā)菌株ALA-9生長無明顯差異,但其5-氨基乙酰丙酸的產(chǎn)量提高至1.47 g/L,提升16.7%(圖8)。檢測了菌株ALA-10胞內(nèi)NADPH濃度,發(fā)現(xiàn)其水平較ALA-9提高25.9%。上述結(jié)果表明,NADPH供應(yīng)是5-氨基乙酰丙酸合成的瓶頸,過表達pntAB可有效提升NADPH 供應(yīng)從而提高5-氨基乙酰丙酸合成效率。
圖8 ALA-9和ALA-10的生長和5-氨基乙酰丙酸生產(chǎn)性能Fig.8 The 5-aminolevulinic acid production and growth of ALA-9 and ALA-10
本研究首先通過敲除L-谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因阻斷胞內(nèi)L-谷氨酸的外排,為5-氨基乙酰丙酸的合成提供了前體物質(zhì)。然后,將5-氨基乙酰丙酸合成關(guān)鍵酶谷氨酰-tRNA還原酶和谷氨酸-1-半醛氨基轉(zhuǎn)移酶按比例組裝至DNA腳手架上,以縮短二者之間中間代謝產(chǎn)物的傳遞空間,使得5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量提高35.3%。在此基礎(chǔ)上,通過過表達gltA、pckA和pntAB強化TCA循環(huán)以及ATP和NADPH的供應(yīng)。獲得的菌株經(jīng)搖瓶發(fā)酵48 h,其5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量達到1.47 g/L。上述策略可為進一步提升5-氨基乙酰丙酸的生物合成效率提供依據(jù)。