鄭博文，王斌雅，肖婉玲，孫亞娟，趙炳天，楊成

(合成與生物膠體教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

蛋白質(zhì)組是指“一個(gè)基因組所編碼表達(dá)的全部蛋白質(zhì)”，這一概念最早是由澳大利亞的WASINGER等[1]提出并加以闡釋的。通過蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，可以整體地對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的組分情況、表達(dá)情況進(jìn)行分析，從而對于蛋白之間的作用與聯(lián)系，以及蛋白質(zhì)對于生命活動的影響進(jìn)行探索，進(jìn)而揭示不同蛋白的具體潛在功能及其應(yīng)用價(jià)值[2]。隨著技術(shù)的發(fā)展，液相質(zhì)譜聯(lián)用逐漸成為蛋白組學(xué)中主要的檢測手段，然而，研究人員選取的研究策略仍存在著差異。其中，數(shù)據(jù)非依賴性采集(data independent acquisition, DIA)技術(shù)具有檢測量大，數(shù)據(jù)易得，可重復(fù)性好等優(yōu)勢[3]，近年來應(yīng)用范圍較廣。在食品領(lǐng)域，蛋白質(zhì)組學(xué)被廣泛應(yīng)用于乳制品、水產(chǎn)和肉制品的生產(chǎn)過程以及產(chǎn)品的研究中，此外，發(fā)酵用菌株及發(fā)酵過程中的蛋白質(zhì)變化過程也可以采用蛋白組學(xué)進(jìn)行研究[4-6]。

透明質(zhì)酸(hyaluronic acid, HA)是一種廣泛存在于動物組織的細(xì)胞間質(zhì)中的糖胺聚糖[7]，具有促進(jìn)傷口修復(fù)、組織再生、免疫調(diào)控、抗炎等多種生物活性[8]。根據(jù)分子質(zhì)量(molecular weight,Mw)的差異，可將透明質(zhì)酸劃分為高分子透明質(zhì)酸(Mw≥100 kDa)，低分子透明質(zhì)酸(10 kDa

本文通過蛋白組學(xué)檢測oligo-HA處理后的脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)刺激的RAW264.7細(xì)胞，從蛋白水平對其在炎癥免疫反應(yīng)中的作用進(jìn)行研究，并通過斑馬魚的十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfonate, SDS)刺激模型，驗(yàn)證其對炎癥的舒緩功效。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

透明質(zhì)酸寡聚糖發(fā)酵液，由江蘇瑞霆生物科技有限公司提供，經(jīng)冷凍干燥后低溫保存。RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞系，北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。轉(zhuǎn)基因中性粒細(xì)胞綠色熒光品系斑馬魚，杭州環(huán)特生物科技有限公司。

LPS，Sigma-Aldrich公司；SDS，上海阿拉丁生化科技有限公司；iST試劑盒，PreOmics公司；色譜級乙腈，上海泰坦公司；其余試劑均為AR級且購自國藥試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

EASY nano LC 1200液相色譜系統(tǒng)、Orbitrap FusionTMLumosTMTribridTM質(zhì)譜儀，美國Thermofisher公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及蛋白提取處理

將凍存的RAW264.7細(xì)胞復(fù)蘇后，采用DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清及1%雙抗，體積分?jǐn)?shù))，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中于37 ℃，5% CO2，飽和濕度下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至培養(yǎng)皿面積的80%以上時(shí)，進(jìn)行傳代。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于60 mm小培養(yǎng)皿中(1×106個(gè)/mL)，培養(yǎng)24 h后，棄去舊培養(yǎng)基，分為HAD組(oligo-HA及LPS處理)及HAB組(僅LPS處理)。HAD組加入用DMEM稀釋至500 μg/mL的HA溶液(HAB組改為空白DMEM培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)18 h后，棄去舊培養(yǎng)基，加入用DMEM稀釋至1 μg/mL的LPS及500 μg/mL的HA溶液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。將處理完成的細(xì)胞收集至離心管中，在1 000×g，4 ℃下離心5 min，棄去上清液，向細(xì)胞中加入裂解液，渦旋振蕩，于超聲波細(xì)胞破碎儀中超聲處理2 min后，在冰上裂解30 min，期間每10 min振蕩混勻1次。在12 000×g, 4 ℃條件下離心20 min，取上清液進(jìn)行BCA定量。采用iST樣本前處理試劑盒對所得蛋白樣品進(jìn)行前處理，經(jīng)高溫變性，酶解，肽段除鹽，洗脫過程后，將所得肽段抽真空于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 nano-HPLC-MS/MS分析

將樣品加入30 μL的0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液制成懸浮液。取9 μL樣品溶液與1 μL 10×iRT肽段混合后，采用nano-LC分離，經(jīng)在線電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析。實(shí)驗(yàn)選用Acclaim PepMap C18柱，柱溫55 ℃，進(jìn)樣流速為300 nL/min，進(jìn)樣量為2 μL。流動相A為0.1%甲酸的水溶液，流動相B為含有0.1%甲酸的80%乙腈水溶液。洗脫條件為4% B相起始，平衡5 min，在120 min升至50%后，在1 min內(nèi)升至95%，保持9 min。

質(zhì)譜儀在數(shù)據(jù)非依賴采集模式下運(yùn)行[13]。設(shè)置質(zhì)譜參數(shù)為：(1) MS：掃描范圍(m/z) 350～1 200；分辨率：120 000；Normalized AGC target 250%；最大注入時(shí)間：100 ms；(2) HCD MS/MS：分辨率：50 000；Normalized AGC target 200%；最大注入時(shí)間：86 ms；碰撞能量：33。

1.3.3 蛋白注釋與生物信息學(xué)分析

采用Spectronaut 15.0默認(rèn)參數(shù)對DIA數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。序列數(shù)據(jù)庫為 uniprot homo sapiens(version201907, 20428 entries)數(shù)據(jù)庫，設(shè)置胰蛋白酶酶解。Spectronaut 進(jìn)行自動校正，采用局部歸一化策略進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化處理。<1.0% FDR的前3個(gè)肽段的峰面積的平均值用來進(jìn)行蛋白組的定量。差異篩選標(biāo)準(zhǔn)：One way ANOVA Test分析后取P<0.05，|fold change|>1.5 的差異蛋白。對篩選得到的差異蛋白基于GO(Gene Ontology)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)進(jìn)行注釋及通路分析。

1.3.4 斑馬魚刺激試驗(yàn)

1.3.4.1 最大試驗(yàn)濃度的確定

隨機(jī)選取受精后2 d的斑馬魚，按每孔30尾置于六孔板中。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.12%、0.25%、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%將oligo-HA樣品添加到六孔板中，定容至3 mL，同時(shí)設(shè)置正常對照組。將斑馬魚置于28 ℃條件下避光孵育18 h。孵育結(jié)束后，在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)各組斑馬魚存活情況及活力，確定樣品的最大試驗(yàn)濃度。

1.3.4.2 SDS刺激舒緩功效測試

根據(jù)最大濃度試驗(yàn)結(jié)果確定樣品處理濃度，并梯度設(shè)置3個(gè)濃度。采用1%(體積分?jǐn)?shù))甘油葡糖苷作為陽性對照(positive control, PC)。隨機(jī)選取受精后2 d的斑馬魚，按每孔30尾置于六孔板中，將SDS溶液加入孔中并定容至3 mL，使得SDS終質(zhì)量濃度為60 μg/mL。

將斑馬魚置于28 ℃條件下避光孵育18 h。孵育結(jié)束后，每組隨機(jī)選擇10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下拍照保存，對皮膚中性粒細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。刺激抑制率按公式(1)進(jìn)行計(jì)算，并根據(jù)抑制率評估舒緩功效。

(1)

式中：E1，刺激抑制率，%；Nc，模型組中性粒細(xì)胞數(shù)量，個(gè)；Ns，樣品組中性粒細(xì)胞數(shù)量，個(gè)；Nb，空白對照組中性粒細(xì)胞數(shù)量，個(gè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 透明質(zhì)酸對LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞作用的蛋白組學(xué)分析

2.1.1 主成分分析

研究中采取主成分分析方法，對數(shù)據(jù)進(jìn)行降維分析，將多維數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為蛋白主成分表達(dá)量，從而評估樣品的相似及差異情況。如圖1所示，所檢測的兩組樣品中，各組內(nèi)蛋白距離較近，主成分相似，說明測定結(jié)果重復(fù)性較好。且HAD組與HAB組間存在明顯距離，區(qū)分較大，說明oligo-HA樣品處理對LPS刺激的細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)產(chǎn)生調(diào)控作用。

圖1 RAW264.7細(xì)胞蛋白的主成分分析Fig.1 PCA of proteins in RAW264.7 cells

2.1.2 差異表達(dá)蛋白的篩選及鑒定

經(jīng)過分離檢測，共鑒定到肽段48 592個(gè)，蛋白6 119個(gè)。經(jīng)過ANOVA分析后篩選出的顯著性差異蛋白共124個(gè)，其中，HAD組相對于HAB組上調(diào)的為76個(gè)，下調(diào)的為48個(gè)，如圖2所示。

2.1.3 差異表達(dá)蛋白GO富集分析

根據(jù)挑選出的差異蛋白，采用GO分析，計(jì)算出現(xiàn)富集的差異基因，從而確定不同樣品的差異基因與基因功能改變之間可能的關(guān)系。如圖3所示，富集后差異表達(dá)蛋白主要分為生物學(xué)過程、功能分子與細(xì)胞組成三類，每類中，取P值最小的10個(gè)富集結(jié)果進(jìn)行作圖。oligo-HA的作用主要包括參與細(xì)胞周期及羧酸和氨基酸的代謝過程(生物學(xué)過程)，調(diào)控組蛋白絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸激酶及轉(zhuǎn)移酶等活性，調(diào)控類視黃醇和類異戊二烯的結(jié)合(功能分子)，影響細(xì)胞內(nèi)成分與細(xì)胞器(細(xì)胞組成)等。

圖2 差異表達(dá)蛋白火山圖Fig.2 Volcano plot of differentially expressed proteins注：中部灰色點(diǎn)表示無顯著性差異表達(dá)的蛋白，上調(diào)蛋白采用紅色點(diǎn)表示，下調(diào)蛋白采用藍(lán)色點(diǎn)表示

圖3 差異表達(dá)蛋白GO富集分析主要結(jié)果Fig.3 Main results of GO analysis of differentially expressed proteins

2.1.4 差異表達(dá)蛋白KEGG富集分析

與GO分析類似，在KEGG分析中，通過對富集情況進(jìn)行計(jì)算，根據(jù)P值篩選出存在明顯差異的蛋白，從而分析oligo-HA的主要作用。計(jì)算后統(tǒng)計(jì)富集篩選中P值最小的15個(gè)蛋白條目進(jìn)行繪圖，結(jié)果如圖4所示。oligo-HA主要參與到糖胺聚糖生物合成，破骨細(xì)胞分化，泛酸和輔酶A生物合成，氨?；?tRNA生物合成，甲狀腺激素、T細(xì)胞受體和ErbB信號通路，以及多種癌癥相關(guān)通路的調(diào)控中。

圖4 差異表達(dá)蛋白KEGG富集分析主要結(jié)果Fig.4 Main results of KEGG analysis of differentially expressed proteins

2.2 oligo-HA舒緩SDS對斑馬魚的刺激功效測試

2.2.1 oligo-HA的最大耐受濃度測試

最大耐受度實(shí)驗(yàn)測試結(jié)果如表1所示，盡管在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的組中，斑馬魚死亡率為0，但其活力存在明顯降低，狀態(tài)較差，故判定2%的oligo-HA對斑馬魚的正常生存有影響，確定最大耐受質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 透明質(zhì)酸寡聚糖最大耐受濃度實(shí)驗(yàn)Table 1 The maximum tolerance dose of oligo-HA for zebra fish

2.2.2 oligo-HA的舒緩功效測試

根據(jù)確定的斑馬魚對oligo-HA樣品的最大耐受濃度，并梯度設(shè)置3個(gè)濃度，對斑馬魚進(jìn)行處理，同時(shí)采用SDS對斑馬魚進(jìn)行刺激，從而評估樣品的舒緩功效。結(jié)果如圖5所示，0.5%(P<0.05)及1%(P<0.01)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的oligo-HA處理的斑馬魚中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著性降低，刺激抑制率達(dá)25%以上，證明樣品具有明顯的舒緩功效。

SDS-僅加入刺激的模型組;PC-加入1%甘油葡糖苷的陽性對照組a-斑馬魚中性粒細(xì)胞熒光典型照片；b-中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)；c-刺激抑制率圖5 Oligo-HA樣品對斑馬魚SDS刺激舒緩功效Fig.5 Effects of oligo-HA sample on SDS-stimulated zebra fish注：#表示P<0.05與空白組相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01與SDS組相比

3 討論與結(jié)論

透明質(zhì)酸作為生命體中的一種重要成分，一直以來在美國等地被用作膳食補(bǔ)充劑使用[14]。根據(jù)日本的一項(xiàng)雙盲試驗(yàn)研究，經(jīng)過一段周期的HA口服食用，受試人員的皺紋減輕，同時(shí)皮膚的光澤和柔軟度得到了提升[15]。隨著我國衛(wèi)健委批準(zhǔn)透明質(zhì)酸鈉為“新食品原料”，對于其在食品中的功效及應(yīng)用研發(fā)值得投入更多關(guān)注。

本實(shí)驗(yàn)中，首先通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析，對oligo-HA在LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中的作用效果進(jìn)行了探究。根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果，經(jīng)過樣品處理的細(xì)胞與未處理組相比，主要存在124個(gè)差異蛋白，其中表達(dá)顯著上調(diào)的蛋白76個(gè)，顯著下調(diào)的蛋白48個(gè)。它們主要參與的生理活動包括細(xì)胞周期及羧酸和氨基酸的代謝過程等，主要影響的通路包括細(xì)胞分化，生物信號分子合成以及部分癌癥相關(guān)通路等。表2中列舉了存在顯著性差異表達(dá)，且參與到炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答調(diào)控中的主要蛋白。

oligo-HA處理組中，T細(xì)胞受體信號通路相關(guān)蛋白AKT1, PAK4表達(dá)顯著性下調(diào)：AKT/PI3K信號通路在炎癥及免疫細(xì)胞的調(diào)控起到重要作用，根據(jù)FU等[16]的研究，通過抑制AKT/PI3K信號通路，RAW264.7細(xì)胞中的炎癥因子水平顯著下降，起到了抗炎效果。這與HAN等[10]的報(bào)道中oligo-HA的下調(diào)炎癥因子的抗炎功效一致。PAK4蛋白在癌癥中常常大量表達(dá)，并進(jìn)一步誘導(dǎo)癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。一項(xiàng)研究表明，通過抑制PAK4的表達(dá)，可以阻止癌細(xì)胞在癌癥小鼠模型中的增殖，以及促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡[17]。對于PAK4的抑制效果，也為透明質(zhì)酸在食品與醫(yī)藥中的應(yīng)用提供了可能的方向。FCGR2及NAL10主要參與到免疫細(xì)胞的信號傳導(dǎo)中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果中這些蛋白的表達(dá)顯著性上調(diào)。FCGR家族是免疫細(xì)胞上分布最廣的受體，其可以主導(dǎo)免疫復(fù)合物的內(nèi)吞作用[18]。FCGR2被發(fā)現(xiàn)分布于B細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞等表面，當(dāng)FCGR被激活后，它們會磷酸化并促進(jìn)細(xì)胞對病原體及被感染的細(xì)胞做出反應(yīng)[19]。NAL蛋白參與到Th細(xì)胞的免疫應(yīng)答作用中并調(diào)控炎癥反應(yīng)。MIYAI等[20]的研究中，在特應(yīng)性皮炎的患者皮膚中，NAL10的表達(dá)可以抵御細(xì)胞凋亡刺激，并抑制其并發(fā)的炎癥小體激活，從而起到抑制炎癥的作用。oligo-HA的抗炎作用，也與這些相應(yīng)蛋白的表達(dá)上調(diào)密不可分。通過對蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果進(jìn)行深入分析，可以對oligo-HA的抗炎作用效果以及作用產(chǎn)生的機(jī)理得出更深入的了解與認(rèn)識，拓寬其應(yīng)用前景。

表2 參與炎癥及免疫調(diào)節(jié)的主要差異蛋白Table 2 Major differentially expressed proteins involved in inflammation and immune regulation

斑馬魚作為常用的模式動物之一，因其繁殖能力強(qiáng)、周期短，便于觀察且免疫細(xì)胞與人類相似等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于免疫、生理等研究中[21]。本研究中，采用SDS對斑馬魚進(jìn)行刺激，建立炎癥模型，通過對中性粒細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，體現(xiàn)炎癥反應(yīng)情況。結(jié)果表明0.5%與1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的oligo-HA處理的斑馬魚實(shí)驗(yàn)組中，中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著性降低，證明樣品能夠顯著性的抑制炎癥反應(yīng)，調(diào)控免疫細(xì)胞的作用，這與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果中體現(xiàn)的oligo-HA的抗炎效果是相一致的。

綜上所述，本研究采用oligo-HA對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，通過對細(xì)胞樣本的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，分析確認(rèn)了其參與調(diào)控的抗炎與免疫調(diào)控等多項(xiàng)生理活動及相關(guān)的信號通路，并采用SDS誘導(dǎo)的斑馬魚刺激模型，驗(yàn)證了oligo-HA的抗炎效果，為其作為“新食品原料”的應(yīng)用提供了更多潛在價(jià)值。