楊 旭 ，馬歌麗，王光路，胡曉龍，宋麗麗，張志平，張治剛，王永亮

（1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州 450001；2.鄭州市代謝工程和系統(tǒng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450001；3.賈湖酒業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司，河南漯河 462400）

大曲作為一種重要的發(fā)酵劑和專用原料，對(duì)中國(guó)白酒的品質(zhì)至關(guān)重要[1]。眾所周知，大曲中的豐富酶系和各種微生物是原料中大分子物質(zhì)水解和代謝的必要條件。此外，大曲還為白酒釀造提供了大量的風(fēng)味物質(zhì)和前體物質(zhì)以及有益的代謝產(chǎn)物。

大曲是在開放環(huán)境下自然發(fā)酵生產(chǎn)的。生產(chǎn)模式包括簡(jiǎn)單的手工制曲和大規(guī)模的工業(yè)制曲。到目前為止，傳統(tǒng)大曲生產(chǎn)無論采用何種模式，都主要依靠熟練技術(shù)人員對(duì)工藝參數(shù)的調(diào)節(jié)，其中大曲中微生物主要來自原料和周圍環(huán)境。近20 年來，現(xiàn)代分子生物學(xué)方法被用來研究醬香、濃香、清香等不同類型白酒大曲的微生物群落。例如，在上述3 種香型白酒大曲中，乳桿菌屬均占優(yōu)勢(shì)，而芽孢桿菌屬在濃香和醬香大曲中為優(yōu)勢(shì)菌群[2]?？勰覐?fù)膜孢酵母和橫梗霉在清香和濃香型白酒大曲中占優(yōu)勢(shì)，而疏棉狀嗜熱絲孢菌主要出現(xiàn)在醬香型白酒大曲中[3]。不同類型大曲微生物群落的差異也與環(huán)境條件有關(guān)。例如，水分和酸度脅迫導(dǎo)致了嗜熱微生物結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變[4]。大曲生產(chǎn)過程中的溫度也是微生物群落組成的重要因素[5]。

目前關(guān)于北方不同香型白酒（如原香型）大曲中微生物相關(guān)的研究較少。賈湖酒業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司地處我國(guó)北部河南省漯河市，通過改進(jìn)生產(chǎn)工藝，獨(dú)創(chuàng)生產(chǎn)出的原香型白酒具有“口感綿柔，醇香四溢”的風(fēng)格特點(diǎn)。

本研究以賈湖酒業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司所生產(chǎn)的原香型白酒高溫大曲為樣品，以南方高溫大曲為對(duì)照，比較研究了高溫大曲的理化性質(zhì)和細(xì)菌種類的不同，以期從細(xì)菌層面解析南北方白酒風(fēng)格差異的可能形成原因。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用高溫大曲原料是由河南漯河賈湖酒業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司提供的原香型白酒高溫成品大曲（北方大曲，簡(jiǎn)寫JH）和對(duì)照大曲（南方大曲，簡(jiǎn)寫MT）。原料大曲分別粉碎后迅速置于-20 ℃下保藏備用。

1.2 儀器與設(shè)備

分光光度計(jì)（Beckman Coulter）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、生化培養(yǎng)箱、電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化有限公司）；PCR 儀器（Eppendorf有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大曲水分含量測(cè)定

將兩個(gè)干凈的培養(yǎng)皿在100～105 ℃的恒溫干燥箱中烘干，當(dāng)烘干至恒重時(shí)記作W0，在天平上連同培養(yǎng)皿稱取大約10 g 的預(yù)先研磨好的大曲樣品，記作W1，將培養(yǎng)皿在100～105 ℃干燥箱中烘干，記下重量，再在干燥箱中烘干至恒重記下重量為W2。

1.3.2 大曲酸度測(cè)定

用天平稱取10 g 的粉末狀大曲樣品于燒杯中，加水100 mL，常溫下放置0.5 h，用脫脂棉對(duì)樣液過濾。將大曲浸出液用移液槍吸取1 mL 到一個(gè)干凈的錐形瓶中，由于受浸出液顏色的影響需要加入9 mL 的水對(duì)其進(jìn)行稀釋，加酚酞2～3 滴，搖勻，用氫氧化鈉溶液滴定，當(dāng)溶液的顏色變得微紅，并且10 s內(nèi)顏色不褪去就是滴定終點(diǎn)[6]。

式中：C——?dú)溲趸c溶液濃度（mol/L），V——?dú)溲趸c溶液體積（mL）。

1.3.3 大曲蛋白酶活力測(cè)定

將在40 ℃預(yù)熱的大曲浸出液1 mL 加入1 mL酪蛋白溶液（2%），保溫10 min，加入2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸溶液終止酶解反應(yīng)后離心；取1 mL 上清液分別加入5 mL 0.4 mol/L 碳酸鈉溶液、1 mL 福林試劑，在40 ℃下保溫20 min，測(cè)定680 nm波長(zhǎng)處的OD值。

1.3.4 高通量測(cè)序方法

使用DNA 提取試劑盒從樣本中提取DNA，使用Qubit? dsDNA HS Assay Kit 檢 測(cè)DNA 濃 度。以20～30 ng DNA 為模板，使用金唯智設(shè)計(jì)的一系列PCR 引物擴(kuò)增原核生物16S rDNA 上包括V3 及V4 的2 個(gè)高度可變區(qū)。采用包含“CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”序列的上游引物和包含“GGACTACNVGGGTWTCTAATCC ”序列的下游引物擴(kuò)增V3 和V4 區(qū)。另外，通過PCR 向16S rDNA 的PCR 產(chǎn)物末端加上帶有Index 的接頭，以便進(jìn)行NGS 測(cè)序。PCR 反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性參數(shù)94 ℃3 min × 1，變性參數(shù)94 ℃5 s，退火參數(shù)57 ℃90 s，延伸72 ℃10 s，終延伸參數(shù)72 ℃5 min，共進(jìn)行24 個(gè)循環(huán)。PCR 擴(kuò)增結(jié)果鑒定：PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。委托蘇州金唯智生物科技有限公司采用按Illumina MiSeq(Illumina,San Diego,CA,USA)儀器使用說明書進(jìn)行PE250/PE300 雙端測(cè)序，由MiSeq 自帶的MiSeq Control Software(MCS)讀取序列信息。

2 結(jié)果與討論

2.1 大曲理化性質(zhì)分析

衡量大曲樣品的理化性質(zhì)，可以用水分、酸度和蛋白酶活力等理化成分指標(biāo)進(jìn)行比較，結(jié)果如表1所示。根據(jù)制曲車間大曲質(zhì)量檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)規(guī)定，大曲中的水分含量不能超過13%[7]，該條件下大部分微生物都停止了生長(zhǎng)、繁殖和代謝。大曲在添加到原料中發(fā)酵生產(chǎn)白酒時(shí)，處于休眠狀態(tài)的微生物重新復(fù)蘇，參與糧食的糖化、發(fā)酵、酯化等過程。由表1 可看出，大曲JH 和MT 樣品中水分都達(dá)到要求，均為合格大曲。大曲酸度是評(píng)定大曲質(zhì)量的重要指標(biāo)，酸度主要是由產(chǎn)酸微生物在大曲中進(jìn)行有機(jī)酸代謝形成。結(jié)果表明，大曲JH 的酸度低于大曲MT，說明大曲JH 中產(chǎn)酸微生物的數(shù)量少于大曲MT（后文中高通量分析結(jié)果也證實(shí)該結(jié)論），同時(shí)也歸因于大曲JH中蛋白酶活力更高[8]。

2.2 大曲細(xì)菌組成和多樣性分析

大曲樣品運(yùn)用PCR 方法擴(kuò)增16S rRNA 的V3和V4 區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序，進(jìn)行細(xì)菌多樣性分析，結(jié)果如表2。樣本文庫覆蓋率（Coverage 指數(shù)）達(dá)到1，說明本次測(cè)序結(jié)果能代表樣本的真實(shí)情況，完全能夠反映該區(qū)域細(xì)菌群落的種類和結(jié)構(gòu)。大曲樣品微生物多樣性指數(shù)估計(jì)值的結(jié)果表明，大曲JH細(xì)菌群落多樣性略低于大曲MT，這可能是造成南北方白酒品質(zhì)差異的原因之一。

大曲樣品的細(xì)菌結(jié)構(gòu)組成（屬水平）如圖1 所示。大曲JH 中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為蛋白酶產(chǎn)生菌Virgiba-cillus，其相對(duì)豐度達(dá)到61.01%，而大曲MT 中蛋白酶產(chǎn)生菌Virgibacillus相對(duì)豐度只有17.44%，該結(jié)果同表1 中蛋白酶活力測(cè)定結(jié)果相對(duì)應(yīng)，說明大曲JH 由于蛋白酶產(chǎn)生菌為優(yōu)勢(shì)菌具有較好降解原料蛋白質(zhì)的能力。蛋白酶能分解原料中蛋白質(zhì)產(chǎn)生各種氨基酸，參與美拉德反應(yīng)有利于促進(jìn)大曲風(fēng)味前體物質(zhì)的形成，形成濃厚的曲香。

高溫放線菌屬Kroppenstedtia在大曲JH中相對(duì)豐度達(dá)到了17.66%，高于大曲MT的1.08%。耐熱高溫細(xì)菌的存在主要由于高溫大曲特殊的工藝條件有關(guān)，大曲可維持在一個(gè)高溫高濕的環(huán)境，從而形成獨(dú)特的、具有特殊香氣的高溫大曲[9]。

另外，由表2 結(jié)果可知，大曲JH 的微生物多樣性低于大曲MT，在細(xì)菌結(jié)構(gòu)上主要表現(xiàn)在大曲MT 中還含有適量不動(dòng)細(xì)菌屬Acinetobacter（相對(duì)豐度3.98%）、酵母屬Saccharopolyspora（相對(duì)豐度2.61%）、芽孢桿菌屬Scopulibacillus（相對(duì)豐度0.65%）和鏈霉菌屬Streptomyces（相對(duì)豐度0.69%），魏斯氏菌屬Weissella和乳桿菌屬Lactobacillus也均被檢測(cè)出。這些多樣性細(xì)菌在大曲JH中均未檢測(cè)到。結(jié)果表明，南北方大曲同屬于高溫細(xì)菌大曲，但細(xì)菌的多樣性不同，南方大曲中細(xì)菌種類明顯多于北方大曲，該結(jié)果同印璇的研究結(jié)果一致[10]。蔣紅軍[11]研究結(jié)果表明，細(xì)菌多樣性主要成因是環(huán)境因素，由于氣候條件的不同，南方釀造廠區(qū)因地理位置的特殊性，空氣流動(dòng)性較北方差，白酒車間附近的微生物種群經(jīng)多年篩選馴化，環(huán)境中的有益于釀酒的微生物區(qū)系基本保持一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡。

3 結(jié)論

本研究對(duì)北方高溫大曲JH 和南方高溫大曲MT 培制過程中的細(xì)菌變化情況進(jìn)行了分析，并對(duì)大曲的相關(guān)理化指標(biāo)水分、酸度和蛋白酶活力進(jìn)行了測(cè)定，簡(jiǎn)單分析了大曲中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的不同及酸度和蛋白酶活力之間的相互聯(lián)系，得出南北方高溫大曲在理化指標(biāo)和細(xì)菌組成之間的差別，是造成南北方白酒品質(zhì)差異的主要原因之一。

從分析結(jié)果來看，北方高溫大曲JH 中優(yōu)勢(shì)菌為蛋白酶產(chǎn)生菌Virgibacillus，相對(duì)豐度高于南方大曲MT，造成大曲JH 蛋白酶活力較高，有利于原料蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)生多種氨基酸參與美拉德反應(yīng)促進(jìn)大曲風(fēng)味前體物質(zhì)的形成，形成濃厚的曲香。高溫放線菌屬Kroppenstedtia在大曲JH中相對(duì)豐度達(dá)到了17.66%，高于大曲MT的1.08%。

大曲JH 微生物多樣性低于大曲MT，如大曲MT 中不動(dòng)細(xì)菌屬Acinetobacter、酵母屬Saccharopolyspora、芽孢桿菌屬Scopulibacillus、鏈霉菌屬Streptomyces、魏斯氏菌屬Weissella和乳桿菌屬Lactobacillus在大曲JH 中均未檢測(cè)到。這可能是由于南北方氣候的差異，使得南方大曲中釀酒微生物組成上更加豐富，因此有南方適于釀造醬酒的說法，而北方大曲中細(xì)菌組成稍微單一，也是能夠釀造原香型白酒的原因之一。以上結(jié)果能夠?yàn)榻沂灸媳狈桨拙破焚|(zhì)差異和大曲的生產(chǎn)工藝改良提供理論依據(jù)。