付寒雪，趙嘉靜，黃文玲

(1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；2. 北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院，北京 100078)

近年來由卵巢衰老而致的不孕癥已成為生殖醫(yī)學界關注的熱點問題[1]。研究表明，磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine phosphate activated protein kinases,AMPK)可以直接或間接激活其下游的過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 alpha,PGC-1α)，促進線粒體的生物合成[2]，從而參與卵泡發(fā)育、卵泡閉鎖、調(diào)控卵巢激素合成與分泌等多種途徑影響卵巢功能[3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，以補腎調(diào)肝法立法組方的烏萸湯可提高卵巢不敏感綜合征模型小鼠血清雌激素水平，降低促卵泡生成素、促黃體生成素水平；上調(diào)卵巢抑制素B及卵泡抑素水平，下調(diào)激活素水平，有效改善卵巢功能[4]。本研究在前期實驗基礎上，利用未成熟卵體外培養(yǎng)技術(shù)，以線粒體能量代謝為切入點，進一步觀察AMPK/PGC-1α通路對初老小鼠卵細胞質(zhì)量的影響，并探討烏萸湯改善卵細胞線粒體功能及卵細胞質(zhì)量的作用機制，為防治卵巢衰老提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 雌性6周齡、24周齡SPF級C57BL/6J小鼠各10只、70只，動物許可證號：斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司；SPF級雄性6周齡SD大鼠10只，動物許可證號：SCXK(京)2019-0010。動物均飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院實驗中心動物屏障系統(tǒng)內(nèi)，SPF環(huán)境，12 h明/12 h暗，動物自由飲水。實驗符合北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院倫理審查要求。

1.2藥物及試劑 烏萸湯(山茱萸10 g、烏藥10 g、菟絲子15 g、丹參10 g、雞血藤15 g、肉蓯蓉10 g、香附10 g，北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院顆粒藥房提供，康仁堂藥業(yè)生產(chǎn))，山茱萸環(huán)烯醚萜苷類提取物(上海陶素生物科技，CAS 131189-57-6)，孕馬血清促性腺激素(PMSG，寧波三生生物科技有限公司，貨號：S200808)，人絨毛膜促性腺激素(HCG，寧波三生生物科技有限公司，貨號：B200805)，AMPK激動劑AICAR(MCE，2627-69-2)，AMPK抑制劑Compound C(MCE，866405-64-3)，M2培養(yǎng)基(SIGMA，M7167)，羊抗鼠-HRP(博奧森，bs-0295G-HRP)，Super Script Ⅲ RT逆轉(zhuǎn)錄kit(ABI-invitrogen，11752050)，AMPKα(CST，5831)，p-AMPKα (Thr172)(CST，2535)，PGC-1α(Genetex，GTX31921)，Nrf1(CST，46743)，Nrf2(CST，12721)，β-actin(proteintech，20536-I-AP)，羊抗兔-HRP(博奧森，bs-0295G-HRP)，石蠟油(Sigma，M8410)。

1.3主要儀器 超凈工作臺(蘇州凈化SW-CJ-1FD，中國)，CO2培養(yǎng)箱(SANYO XD-101，日本)，生物倒置顯微鏡(OLYMPUS，IX51，德國)，體式顯微鏡(世紀科信，中國)，臺式低速離心機(上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療設備廠80-2，中國)，熒光顯微鏡(OLYMPUS-IX51，德國)，熒光定量PCR儀(Eppendorf，X226488N)，分光光度計(THERMO，Nanodrop lite)，0.45 μm PVDF膜(Millipore，IPVH00010)，脫色搖床(海門其林貝爾，TS-100)，電泳儀(Biorad，EPS 300)。

1.4實驗方法

1.4.1烏萸湯含藥血清制備及保存 參考李玲等[5]實驗最優(yōu)效劑量，烏萸湯按原藥材濃度4.8 g/mL配制，計算每日灌胃藥液1 mL/100 g。SD大鼠適應性喂養(yǎng)3 d后，連續(xù)灌胃烏萸湯7 d，第7天灌胃后1 h無菌條件下腹主動脈取血，3 000 r/min離心15 min分離血清，濾器抽濾除菌，56 ℃滅活，分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2原代細胞提取 ①培養(yǎng)液解凍24 h以上，配置M2培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，含藥培養(yǎng)基用基礎培養(yǎng)基將藥物稀釋至烏萸湯含藥血清10%、山茱萸環(huán)烯醚萜苷類提取物20 mg/L。②在35 mm培養(yǎng)皿中做好清洗液滴和培養(yǎng)液滴，每滴20 μL，覆蓋2 mL石蠟油后置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱平衡過夜，手術(shù)器械高壓滅菌。③6周齡和24周齡雌性清潔級C57BL/6J小鼠分別腹腔注射PMSG 10 IU ，48 h后注射 HCG 10 IU，16 h后頸椎脫臼處死小鼠，置于無菌超凈工作臺中，解剖取出卵巢，于清洗液滴中清洗并剝離脂肪組織，在體式顯微鏡下用1 mL注射器針頭扎破卵巢，待內(nèi)含物溢出后挑取卵丘卵母細胞復合體(COC)。將所取得COC置于培養(yǎng)液滴中培養(yǎng)，控制每個培養(yǎng)液滴的COC數(shù)量為8～10個，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.4.3實驗分組及培養(yǎng) 實驗分設8組：對照組將6周齡小鼠COC培養(yǎng)于基礎培養(yǎng)基，初老組將24周齡小鼠COC培養(yǎng)于基礎培養(yǎng)基，初老+AICAR組加入AICAR預處理24周齡小鼠COC 2 h后培養(yǎng)于基礎培養(yǎng)基，初老+Compound C組加入Compound C預處理24周齡小鼠COC 2 h后培養(yǎng)于基礎培養(yǎng)基，初老+烏萸湯含藥血清組將24周齡小鼠COC培養(yǎng)于烏萸湯含藥血清培養(yǎng)基，初老+烏萸湯含藥血清+AICAR組加入AICAR預處理24周齡小鼠COC 2 h后培養(yǎng)于烏萸湯含藥血清培養(yǎng)基，初老+烏萸湯含藥血清+Compound C組加入Compound C預處理24周齡小鼠COC 2 h后培養(yǎng)于烏萸湯含藥血清培養(yǎng)基，初老+山茱萸環(huán)烯醚萜苷類提取物組將24周齡小鼠COC培養(yǎng)于山茱萸環(huán)烯醚萜苷類提取物培養(yǎng)基。各組均培養(yǎng)24 h。

1.5檢測指標及方法

1.5.1細胞中AMPKα、PGC-1α、Nrf1、Nrf2基因表達情況 采用Real-Time PCR方法檢測：各組分別取等量卵母細胞，應用Trizol法提取總RNA，1%瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測RNA的完整性。反轉(zhuǎn)錄試劑盒superscript Ⅲ反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，對cDNA樣本進行擴增，配置實時定量PCR反應體系，于熒光定量PCR儀上檢測細胞中AMPK、PGC-1α、Nrf1、Nrf2基因表達情況。引物序列 ：ACTB上游5’-CCATGTACGTAGCCATCCAG-3’,下游5’-TCATGAGGTAGTCTGTCAGG-3’；AMPKa上游5’-GTTGGACGAAAAGGAAAGC-3’,下游5’-TTCTGGTGCGGCATAATTGG-3’；PGC-1α上游5’- TTCCACAGATTCAGGCCAGT-3’,下游5’-CTGAAGTCGCCATCCCTTAG-3’；NRF1上游5’-CATCCAGACGACGCAAGCAT-3’,下游5’-ATCTGTCCCCCACCTTGTAA-3’；NRF2上游5’-GGCATTTCACTGAACACGAG-3’,下游5’-GATGACCAGGACTCACGGGA-3’。PCR反應體系50 μL，反應條件：95 ℃變性3 min進入循環(huán)，95℃ 30s、55 ℃ 20 s共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計算相對表達量。

1.5.2細胞中AMPKα及p-AMPKα(Thr172)、PGC-1α、NRF1、NRF2蛋白表達情況 采用Western blot法檢測：應用RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白，BCA法蛋白濃度定量，根據(jù)濃度測定結(jié)果用5×loading buffer對蛋白濃度進行調(diào)整，保證各組別蛋白濃度一致。配置適宜濃度的濃縮膠和分離膠，測得每孔上樣量為50 μg，80 V 濃縮膠，120 V 分離膠，恒壓電泳分離蛋白，電泳至目的蛋白位于分離膠面的下1/3的最佳分辨位置時停止電泳。4 ℃下110 V/120 mA轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫搖床封閉2 h，加一抗AMPKα、p-AMPKα(Thr172)、PGC-1α、NRF1、NRF2及β-actin，4 ℃孵育過夜，洗去多余的一抗，而后加入相應二抗，37 ℃搖床孵育1 h，TBSB洗膜3次，每次10 min后顯色曝光，應用Image J軟件分析灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計算出各個指標的相對灰度值。

2 結(jié) 果

2.1各組卵母細胞中AMPKα、PGC-1α、Nrf1、Nrf2基因表達情況 初老組、初老+AICAR組、初老+Compound C組、初老+烏萸湯含藥血清+Compound C組、初老+山茱萸環(huán)烯醚萜苷類提取物組卵母細胞中AMPKα、PGC-1α、Nrf1、Nrf2基因相對表達量及初老+烏萸湯含藥血清+AICAR組Nrf2基因相對表達量均明顯低于對照組(P均<0.05)；初老+AICAR組、初老+烏萸湯含藥血清組、初老+烏萸湯含藥血清+AICAR組卵母細胞中AMPKα、PGC-1α、Nrf1基因相對表達量均明顯高于初老組(P均<0.05)，初老+AICAR組、初老+烏萸湯含藥血清組、初老+烏萸湯含藥血清+AICAR組卵母細胞中Nrf2基因相對表達量及初老+Compound C組卵母細胞中AMPKα、PGC-1α、Nrf1、Nrf2基因相對表達量均明顯低于初老組(P均<0.05)；初老+烏萸湯含藥血清+Compound C組卵母細胞中AMPKα、PGC-1α、Nrf1、Nrf2基因相對表達量均明顯低于初老+烏萸湯含藥血清組(P均<0.05)；初老+烏萸湯含藥血清組、初老+烏萸湯含藥血清+AICAR組各指標比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠卵母細胞中AMPKα、PGC-1α、Nrf1、Nrf2基因表達情況

2.2各組卵母細胞中AMPKα、p-AMPKα(Thr172)、PGC-1α、Nrf1、Nrf2蛋白表達情況 初老組、初老+Compound C組卵母細胞中AMPKα、p-AMPKα(Thr172)、PGC-1α、Nrf1蛋白相對表達量及初老+AICAR組p-AMPKα(Thr172)、Nrf1蛋白相對表達量均明顯低于對照組(P均<0.05)；初老+AICAR組、初老+烏萸湯含藥血清組卵母細胞中AMPKα、p-AMPKα(Thr172)、PGC-1α、Nrf1蛋白相對表達量及初老+烏萸湯含藥血清+AICAR組卵母細胞中AMPKα、p-AMPKα(Thr172)、PGC-1α蛋白相對表達量均明顯高于初老組(P均<0.05)，初老+烏萸湯含藥血清+Compound C組卵母細胞中p-AMPKα(Thr172)、PGC-1α、Nrf1蛋白相對表達量均明顯低于初老+烏萸湯含藥血清組(P均<0.05)。見圖1及表2。

表2 各組小鼠卵母細胞中AMPKα、p-AMPKα (Thr172)、PGC-1α、Nrf1、Nrf2蛋白相對表達量比較

3 討 論

線粒體能量代謝是關乎卵細胞質(zhì)量的重要因素。線粒體是卵細胞中數(shù)量最多的細胞器，其通過氧化磷酸化和電子呼吸鏈產(chǎn)生三磷酸腺苷(ATP)，是細胞的能量工廠[6-7]。線粒體保持正常的數(shù)量和活性對于卵泡發(fā)育至關重要，線粒體功能障礙可誘導卵巢衰老[8]。AMPK是一種絲、蘇氨酸蛋白激酶，是調(diào)節(jié)細胞能量代謝的關鍵分子，被稱為細胞能量調(diào)節(jié)器[9]。相關研究發(fā)現(xiàn)，α1AMPK基因敲除的小鼠，其卵細胞線粒體結(jié)構(gòu)異常，ATP含量減少，受精卵發(fā)育潛能下降[10]，提示AMPK能夠調(diào)節(jié)卵細胞線粒體的能量代謝，繼而影響卵細胞質(zhì)量。PGC-1α是一個重要的轉(zhuǎn)錄共活化物，可通過調(diào)節(jié)線粒體合成參與生物體的能量代謝過程, 還可調(diào)控核呼吸因子(NRFs)的轉(zhuǎn)錄[11-12]。而NRFs是調(diào)節(jié)線粒體氧化磷酸化和線粒體合成的重要轉(zhuǎn)錄因子，通過直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控或間接調(diào)控參與與線粒體氧化磷酸化有關的呼吸酶鏈亞單位基因表達。因此，PGC-1α能通過調(diào)控 NRFs 的基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)線粒體氧化磷酸化功能，從而參與生物體的能量代謝[13-14]。中醫(yī)理論中將卵巢的功能統(tǒng)歸于胞宮，以“經(jīng)血”來判斷卵巢功能正常與否[15]。月經(jīng)的產(chǎn)生與肝、腎關系最為密切?！澳I藏精，主生殖”，精血同源，腎精是產(chǎn)生月經(jīng)的物質(zhì)基礎。腎精不足，精虧血少，沖任血虛，胞宮胞脈失養(yǎng)，經(jīng)水漸斷。腎精衰少是卵巢功能減退的根本原因?，F(xiàn)代女性生活、工作壓力大，求子不得，情緒不能有效宣泄，久而致郁。肝郁氣滯，疏泄無權(quán)，氣滯日久，而成血瘀，阻塞胞宮胞絡，故經(jīng)水難下，胎孕難成。據(jù)此，認為腎虛肝郁是卵巢功能衰退的基本病機，臨床中以補腎調(diào)肝為基本治法[16]。烏萸湯是北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院金哲教授改善卵巢功能的經(jīng)驗效方，可補腎以助先天，調(diào)肝以暢氣血，而達調(diào)經(jīng)種子目的。動物實驗證實烏萸湯可通過調(diào)控卵巢局部因子、增強FSHR mRNA的表達從而提高卵巢對促性腺激素的反應性,改善下丘腦-垂體-卵巢軸,刺激雌二醇分泌,以促進卵泡發(fā)育成熟及排出[17]。

1為對照組；2為初老組；3為初老+AICAR組；4為初老+Compound C組；5為初老+烏萸湯含藥血清組；6為初老+烏萸湯含藥血清+AICAR組；7為初老+烏萸湯含藥血清+Compound C組；8為初老+山茱萸環(huán)烯醚萜苷類提取物組

本研究中通過對照組、初老組、初老+AICAR組、初老+Compound C組的對比發(fā)現(xiàn)，激活劑AICAR促進了AMPKα轉(zhuǎn)錄及p-AMPKα(Thr172)的表達，加強了AMPK的活化，導致其下游分子PGC-1α表達增加，并主要影響核呼吸因子Nrf1的蛋白表達，使得通路被激活，進而改善卵細胞線粒體功能；抑制劑Compound C加入后抑制了AMPKα的表達及活化，下調(diào)了其下游分子PGC-1α、Nrf1的蛋白表達。提示卵巢衰老過程中出現(xiàn)的卵細胞質(zhì)量下降與AMPK/PGC-1α通路對線粒體能量代謝的調(diào)控有關。加入烏萸湯含藥血清培養(yǎng)的研究證實，烏萸湯可以促進AMPKα、PGC-1α、Nrf1的轉(zhuǎn)錄及AMPKα、PGC-1α、Nrf1蛋白表達，可增強初老小鼠卵巢線粒體代謝，改善小鼠卵巢功能；Compound C可以抑制AMPKα、PGC-1α、Nrf1、Nrf2的轉(zhuǎn)錄，下調(diào)p-AMPKα(Thr172)、PGC-1α、Nrf1蛋白表達，說明抑制AMPK/PCG-1α通路能減弱烏萸湯對初老小鼠線粒體代謝和卵巢功能的改善作用；AICAR的轉(zhuǎn)錄激活作用不明顯，由此猜測，烏萸湯和AICAR作用可能相近，也可能烏萸湯抑制了AICAR的激活作用。

綜上所述，烏萸湯可能通過AMPK/PCG-1α通路增強線粒體能量代謝及氧化應激狀態(tài)，從而促進卵細胞成熟，改善卵細胞質(zhì)量，為臨床應用補腎調(diào)肝法治療卵巢衰老相關疾病提供了理論依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。