尹 俠，李宏玉,，朱路文，唐 強(qiáng)

(1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)是冠狀動(dòng)脈發(fā)生粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導(dǎo)致的心臟病，是人類(lèi)健康面臨的巨大挑戰(zhàn)[1-2]。目前，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)(PCI)、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)是治療冠心病的主要手術(shù)方法[3-4]，雖然這些干預(yù)措施提高了患者的存活率，但恢復(fù)血流灌注的過(guò)程誘導(dǎo)了心肌內(nèi)的各種病理變化，這種現(xiàn)象被稱為心肌缺血再灌注損傷[5]。近年來(lái)研究證實(shí)，自噬在缺血再灌注損傷中有重要作用，針刺可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬來(lái)保護(hù)心肌組織[6-8]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立離體心肌缺血再灌注損傷動(dòng)物模型，觀察自噬標(biāo)志蛋白 Beclin-1和LC3-Ⅱ的變化，探討了電針預(yù)處理對(duì)缺血再灌注心肌的保護(hù)作用機(jī)制，以為臨床應(yīng)用提供更多參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SPF級(jí)成年Sprague-Dawley大鼠36只，體重240～260 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SYXK(黑)2020002。大鼠喂養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)腦功能與神經(jīng)康復(fù)實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)條件：溫度(22±2)℃，濕度(55±5)%，自由飲食和攝水，12 h光照/12 h黑暗。本研究嚴(yán)格遵守國(guó)家愛(ài)護(hù)和使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究的相關(guān)規(guī)定，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要儀器 Langendorff離體心臟灌流實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，江蘇賽昂斯生物技術(shù)有限公司；-80 ℃超低溫冰箱，日本Panasonic公司；華佗牌SDZ-Ⅱ型電針治療儀，蘇州醫(yī)療用品有限公司；WB凝膠成像系統(tǒng)，BIO-RAD公司；一次性無(wú)菌針灸針，北京漢醫(yī)醫(yī)療器械中心。

1.3主要試劑 肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒，上海碧云天物技術(shù)公司；肝素鈉注射液，天津生物化學(xué)制藥有限公司，規(guī)格：1萬(wàn)IU/mL；BCA蛋白定量試劑盒、蛋白裂解液，上海Beyotine Biotechnology公司；Beclin-1和LC3-Ⅱ抗體，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1分組及預(yù)處理方法 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、缺血再灌注組和電針預(yù)處理組，每組12只。電針預(yù)處理組：參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[9]，結(jié)合動(dòng)物比較解剖學(xué)方法定位取雙側(cè)心俞穴和神門(mén)穴，雙側(cè)心俞穴位于雙側(cè)“內(nèi)關(guān)”第五胸椎棘突下、雙側(cè)各旁開(kāi)約7 mm處，針刺深度約5 mm；雙側(cè)“神門(mén)”位于前肢內(nèi)側(cè)腕部橫紋尺骨邊緣處，針刺深度約2 mm。連接華佗牌SDZ-Ⅱ型電針儀，取兩側(cè)心俞接負(fù)極，并在各側(cè)穴位下方2 mm刺一針作為參考電極接正極，取兩側(cè)神門(mén)穴接負(fù)極、大鼠尾部接正極。電針參數(shù)：頻率2 Hz，電壓3 V，選取連續(xù)波。電針處理20 min/次，1次/d，6 d/周，連續(xù)干預(yù)3周。正常組和缺血再灌注組在電針預(yù)處理組干預(yù)的3周內(nèi)自由飼養(yǎng)。

1.4.2Krebs-Henseleit(K-H)營(yíng)養(yǎng)液配制方法取13.79 g氯化鈉、0.70 g氯化鉀、0.33 g磷酸二氫鉀、0.51 g硫酸鎂、4.36 g葡萄糖、4.20 g碳酸氫鈉，用1 000 mL蒸餾水混勻，待完全溶解后通入95%氧氣、5%二氧化碳混合氣體30 min，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.4；最后加入0.61 g氯化鈣，待其完全溶解后，加入1 000 mL蒸餾水定容、過(guò)濾，防止產(chǎn)生沉淀。K-H營(yíng)養(yǎng)液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4.3模型制備方法 以戊巴比妥鈉溶液40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，15 min后注射抗凝液100 IU/100 g抗凝，待大鼠完全麻醉后剖胸，剪斷主動(dòng)脈，心臟離體后立即放在4 ℃ K-H營(yíng)養(yǎng)液中，用手指輕輕反復(fù)按壓心臟，擠出心臟內(nèi)殘余的血液，迅速將心臟懸掛于已調(diào)試好的離體灌流裝置上，在肺動(dòng)脈剪口使冠狀動(dòng)脈灌流液順利排出，保持體外循環(huán)完整通暢。缺血再灌注組和電針預(yù)處理組大鼠平衡灌注20 min,缺血40 min，再灌注2 h；正常組無(wú)缺血再灌注操作，全程平衡灌注180 min。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1灌流液內(nèi)CK、CK-MB、LDH含量 各組大鼠停灌注前20 min取2 mL灌流液，-80 ℃保存，按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用ELISA法檢測(cè)灌流液中CK、CK-MB、LDH含量。

1.5.2心肌組織病理形態(tài) 灌流結(jié)束后，取心肌組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定24～48 h,常規(guī)脫水、石蠟包埋，切片厚度為4 μm,于45 ℃左右溫水中展片后，撈至玻片上鋪正，65 ℃烤片10 min,65 ℃烘片2 h；二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化，蘇木精液染色8 min；水洗，1%鹽酸乙醇分化2 s；水洗，水中浸泡反藍(lán)10 min，乙醇處理后，酸化伊紅溶液染色2 min；乙醇脫水，二甲苯透明；中性樹(shù)膠封固樹(shù)脂膠封片，光鏡下觀察，照相。

1.5.3心肌組織超微結(jié)構(gòu) 切取約1 mm×1 mm×1 mm大小心肌組織，2.5%戊二醛磷酸緩沖液4 ℃固定24～48 h；漂洗、梯度丙酮脫水、浸透、包埋、切片(厚度50～70 nm)、染色,透射電鏡觀察心肌纖維、心肌細(xì)胞內(nèi)自噬小體和自噬溶酶體等結(jié)構(gòu)。

1.5.4心肌組織中Beclin-1和LC3-Ⅱ表達(dá)情況采用Western blot法檢測(cè)：剪取各組大鼠心肌相同部位組織，加入適量預(yù)冷的PBS緩沖液對(duì)心肌組織進(jìn)行反復(fù)沖洗。每0.1 g組織加入1 mL裂解液，低溫勻漿、離心,取上清,BCA法進(jìn)行蛋白定量,制備分離膠、濃縮膠,上樣,100 V恒壓電泳，200 mA恒流進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，浸于用TBST制作的5%脫脂奶封閉液中，在室溫條件下封閉1 h，一抗孵育過(guò)夜，棄掉一抗稀釋液，用TBST緩沖液沖洗10 min，重復(fù)洗4次,然后在室溫條件下加入Beclin-1和LC3二抗稀釋液(1∶5000稀釋于含5%脫脂奶粉的TBST中)孵育1 h。棄掉二抗稀釋液，將膜浸在TBST中沖洗10 min，重復(fù)洗4次。ECL反應(yīng)顯色、曝光成像，用凝膠處理系統(tǒng)進(jìn)行灰度值計(jì)算并分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠灌流液中CK、CK-MB、LDH含量比較 缺血再灌注組灌流液中CK、CK-MB、LDH含量均顯著高于正常組(P均<0.05)，電針預(yù)處理組均顯著低于缺血再灌注組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 正常組和缺血再灌注各組大鼠冠狀動(dòng)脈灌流液中CK、CK-MB、LDH 含量比較

2.2各組大鼠心肌組織HE染色表現(xiàn) 正常組大鼠心肌纖維排列整齊，無(wú)斷裂；缺血再灌注組大鼠心肌纖維出現(xiàn)溶解、斷裂，甚至壞死，細(xì)胞間質(zhì)擴(kuò)大，細(xì)胞腫脹，外膜破損、斷裂成絮狀或缺失；電針預(yù)處理組大鼠心肌纖維間隙輕度增寬，偶見(jiàn)壞死灶，細(xì)胞輕微腫脹，細(xì)胞核及細(xì)胞界限結(jié)構(gòu)基本完整。見(jiàn)圖1。

圖1 正常組和缺血再灌注各組大鼠心肌組織HE染色表現(xiàn)(×400)

2.3各組大鼠心肌組織透射電鏡下表現(xiàn) 正常組大鼠心肌組織中線粒體排列、形態(tài)和數(shù)量正常，線粒體嵴清晰、排列整齊；缺血再灌注組大鼠心肌組織中部分線粒體固縮變小、顏色加深，部分線粒體腫脹、或外膜破損、或成空泡樣病變，線粒體嵴不規(guī)則、斷裂成絮狀，自噬溶酶體數(shù)量顯著增加(箭頭所指)；電針預(yù)處理組大鼠心肌細(xì)胞核結(jié)構(gòu)基本完整，排列稍紊亂，部分線粒體水腫，自噬溶酶體數(shù)量較缺血再灌注組少。見(jiàn)圖2。

圖2 正常組和缺血再灌注各組大鼠心肌組織透射電鏡下表現(xiàn)(×5 000)

2.4各組大鼠心肌組織中Beclin-1和LC3-Ⅱ表達(dá)情況 缺血再灌注組心肌組織中Beclin-1和LC3-Ⅱ表達(dá)量均顯著高于正常組(P均<0.05)，電針預(yù)處理組均顯著低于缺血再灌注組(P均<0.05)。見(jiàn)圖3及圖4。

圖3 正常組和缺血再灌注各組大鼠心肌組織中Beclin-1和LC3-Ⅱ表達(dá)條帶

圖4 正常組和缺血再灌注各組大鼠心肌組織中Beclin-1和LC3-Ⅱ相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

缺血預(yù)適應(yīng)這一概念最早由Murry等[10]提出，其與中醫(yī)“治未病”思想相一致，為治療缺血性心臟病提供了新的治療思路。早在張仲景的《傷寒論》中就有提及“針刺治未病”的思想，電針預(yù)處理屬于“針刺治未病”的范疇，目的都在于“未病先防”。相關(guān)研究證實(shí)，針刺可以激發(fā)體內(nèi)的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，相對(duì)于其他藥物處理其不良反應(yīng)較少，不會(huì)對(duì)組織器官造成損傷[11]。目前，電針預(yù)處理常用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物缺血再灌注模型研究中，具有明確顯著的心肌保護(hù)效應(yīng)[12-14]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)“俞原配穴”的原則，選取心俞穴和神門(mén)穴配伍的電針預(yù)處理方案來(lái)觀察電針預(yù)處理對(duì)缺血再灌注損傷自噬的調(diào)控作用。

心肌酶主要指心肌細(xì)胞內(nèi)的酶類(lèi)物質(zhì),心肌細(xì)胞壞死時(shí)可釋放出多種心肌酶，心肌酶活性升高的程度可反映心肌損害的程度[15]。其中CK、CK-MB為特異性心肌酶，LDH為糖酵解酶，這些指標(biāo)可反映早期心肌受損情況。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺血再灌注組大鼠灌洗液中CK、CK-MB、LDH含量明顯升高，病理觀察顯示心肌組織受損，證實(shí)缺血再灌注可造成心肌損傷；電針預(yù)處理組大鼠灌洗液中CK、CK-MB、LDH含量均明顯低于缺血再灌注組，病理觀察顯示心肌組織損傷減輕，提示電針心俞穴和神門(mén)穴預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用。這一結(jié)果與張小蕾等[16]和石力等[17]研究結(jié)果一致。

自噬是細(xì)胞內(nèi)部“自我消化”“自我保護(hù)”的一個(gè)過(guò)程，但在缺血再灌注損傷的病理過(guò)程中，自噬可能是一把雙刃劍，適度的自噬激活可保護(hù)心肌細(xì)胞，但過(guò)度的自噬激活，最終會(huì)引起細(xì)胞自噬性凋亡[18-20]。LC3是自噬體膜上的標(biāo)志性蛋白，細(xì)胞內(nèi)有2種形式，即LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ，自噬小體形成后，LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺耦聯(lián)形成LC3-Ⅱ，其具有膜定位能力，定位于自噬體內(nèi)膜和外膜。由于LC3-Ⅱ在自噬體膜上保持穩(wěn)定，所以被用作自噬體標(biāo)記物，其表達(dá)量在一定程度上反映了自噬體個(gè)數(shù)。Beclin-1是調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的關(guān)鍵基因，在自噬啟動(dòng)過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用[21]。有研究表明，心肌缺血再灌注后，Beclin-1蛋白表達(dá)量顯著增高[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺血再灌注組大鼠心肌組織中Beclin-1、LC3-Ⅱ表達(dá)量明顯增高，說(shuō)明恢復(fù)再灌注后自噬過(guò)度激活；電針預(yù)處理組大鼠心肌組織中 Beclin-1、LC3-Ⅱ表達(dá)量明顯低于缺血再灌注組，說(shuō)明電針預(yù)處理能夠調(diào)控細(xì)胞自噬能力，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

綜上所述，電針作為一種良性刺激，能夠增加大鼠心肌缺血耐受性，可以調(diào)控缺血再灌注后相關(guān)自噬蛋白的表達(dá)，對(duì)缺血再灌注心肌組織產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)。但本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有對(duì)自噬發(fā)生的具體通路機(jī)制做進(jìn)一步探討，還有待后續(xù)研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。