劉佳慧，姜希卿，張琪，王博琳，張吉龍，金君學(xué)*，孫婧陶*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.黑龍江省動物細胞與遺傳工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030）

多精受精是指受精過程中，有2個或2個以上精子進入卵母細胞的現(xiàn)象。與體內(nèi)受精相比，體外受精時多精受精的發(fā)生率增高，導(dǎo)致早期胚胎死亡、發(fā)育異常/阻滯等現(xiàn)象發(fā)生。豬物種在體外環(huán)境下多精受精發(fā)生率高達50%～90%，是研究多精受精的理想模型。卵母細胞成熟包括核成熟和質(zhì)成熟。第二次減數(shù)分裂中期第一極體排出是核成熟的標志。胞質(zhì)成熟是指各種細胞內(nèi)事件，如能量調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)累積、細胞器（皮質(zhì)顆粒、高爾基體）重排等。然而，在卵母細胞體外成熟過程中，細胞核率先成熟，卵母細胞質(zhì)成熟的延遲使皮質(zhì)顆粒的遷移及胞吐受到抑制，導(dǎo)致多精受精發(fā)生。因此，通過改善卵母細胞的質(zhì)成熟將有效地抑制多精受精。

褪黑素作為一種強抗氧化劑，在卵母細胞體外成熟過程中可降低活性氧水平，保護卵母細胞免受氧化損傷的侵害；同時，還可以促進卵母細胞脂質(zhì)代謝、改善線粒體功能，從而有效改善卵母細胞體外成熟的效率。然而，迄今為止，關(guān)于褪黑素在豬卵母細胞多精受精中的作用鮮有報道。本研究擬通過在豬卵母細胞成熟培養(yǎng)液中添加褪黑素，檢測卵母細胞體外成熟率、多精受精發(fā)生率及與多精受精相關(guān)的細胞器分布情況，以期探討褪黑素對豬卵母細胞多精受精的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本研究所有實驗試劑均購置于Sigma（美國）公司，特殊說明的除外。

1.2 實驗方法

1.2.1 豬卵母細胞的收集與體外培養(yǎng) 從華欣眾貿(mào)肉業(yè)有限公司屠宰場獲得豬卵巢，置于25～30℃含青霉素和鏈霉素的生理鹽水中，2 h 內(nèi)運回實驗室。用18 號針頭抽取直徑為3～6 mm 卵泡內(nèi)的卵丘卵母細胞復(fù)合體（Cumulus-oocyte Complexs，COCs）。經(jīng)洗卵液洗滌3次，在體式顯微鏡下挑取卵母細胞胞質(zhì)均勻且周圍包裹多層致密卵丘細胞的COCs，移入覆蓋礦物油的500 μL卵母細胞體外成熟（In vitro Maturation，IVM）培養(yǎng)液中培養(yǎng)21 h，再轉(zhuǎn)移至無激素（PMSG 和hCG）的IVM 培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)21 h，培養(yǎng)條件為38.5℃、5%CO飽和濕度環(huán)境。

IVM 培養(yǎng)液采用TCM-199（Invitrogen）作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，添加0.6 mmol/L 半胱氨酸，0.91 mmol/L丙酮酸鈉，10 ng/mL EGF，10% 豬卵泡液，10 IU/mL PMSG，10 IU/mL hCG，1%青鏈霉素（Invitrogen）。在IVM 培養(yǎng)液中，褪黑素組、褪黑素+Luzindole 組分別添加1 nmol/L 褪黑素、1 nmol/L 褪黑素+1 nmol/L Luzindole（選擇性褪黑素受體拮抗劑），不添加褪黑素及Luzindole 組作為對照組，進行后續(xù)實驗。

1.2.2 卵母細胞體外受精及胚胎培養(yǎng) COCs 經(jīng)42 h 體外成熟后，使用0.05%透明質(zhì)酸酶去除卵母細胞周圍包裹的卵丘細胞，將成熟卵母細胞每15 枚置于25 μL 受精滴中。取1 mL 精液（精液由哈爾濱市雙城區(qū)富泉種豬廠提供）置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育15 min，2 000 r/min離心4 min；棄上清，加入1 mL DPBS，2000 r/min 離心4 min；棄上清，加入1 mL mTBM，重懸；按照500:1的精卵比稀釋精液。在受精進行之前，要確保精子活力>80%。取25 μL 精液加入受精滴中，置于38.5℃、5%CO飽和濕度環(huán)境下孵育6 h 后，轉(zhuǎn)移至PZM3 胚胎培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h 觀察卵裂率，168 h 觀察囊胚率。

1.2.3 體外多精受精發(fā)生率的檢測 受精卵于PZM3 胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)10 h 后，移入0.2% PVA-PBS 中洗滌3 次，每次1～2 min；將受精卵移入0.1%濃鹽酸中，停留2～3 s，去除透明帶；置于0.2% PVA-PBS 中洗滌3 次，每次1～2 min；使用10 μg/mL Hoechst 33342 將無透明帶的受精卵室溫下染色5 min，0.2% PVA-PBS 中洗滌3 次，每次1～2 min；凡士林封片，于熒光顯微鏡（Nikon，80i）下觀察豬卵母細胞原核形成情況，統(tǒng)計多精受精發(fā)生率：雙原核為正常受精；3個以上原核為多精受精。

1.2.4 皮質(zhì)顆粒染色 將成熟卵母細胞置于4% 多聚甲醛中固定30 min；用含0.3% BSA+1 mol/L 甘氨酸的PBS（封閉液）清洗3 次，每次5 min；卵母細胞移入含0.1% Triton-X100 的PBS 中通透5 min，使用封閉液清洗3 次，每次5 min；卵母細胞放置到100 μg/mL 的FITC-PNA（Sigma，L7381）中室溫避光染色30 min；凡士林封片，使用激光共聚焦顯微鏡（Leica，TCS SP8）觀察皮質(zhì)顆粒分布情況。皮質(zhì)顆粒正常分布率計算方法：各組正常分布的卵母細胞個數(shù)/各組卵母細胞總數(shù)。

1.2.5 高爾基體染色 將成熟卵母細胞置于4%多聚甲醛中固定10 min，使用預(yù)冷的0.2% PVA-PBS 清洗3 次，每次1～2 min；卵母細胞移入5 mmol/L NBD C6-Ceramide（GeneCopoeia,C049）中，4℃ 避光染色30 min，使用預(yù)冷的0.2% PVA-PBS 清洗3 次，每次1～2 min；移入2%BSA-PBS 中室溫孵育60 min，使用預(yù)冷的0.2% PVAPBS 清洗3 次，每次1～2 min；凡士林封片，使用熒光顯微鏡觀察高爾基體分布情況。高爾基體正常分布率計算方法：各組正常分布的卵母細胞個數(shù)/各組卵母細胞總數(shù)。

1.3 統(tǒng)計分析 每組實驗至少重復(fù)3 次。實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0 通過單因素方差分析（ANOVA）和Duncan's檢驗進行分析，結(jié)果使用平均值± 標準誤差表示。<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 褪黑素對豬卵母細胞體外成熟的影響 由表1 可知，3 組之間卵母細胞成熟率無顯著性差異，即褪黑素處理未對豬卵母細胞核成熟率產(chǎn)生顯著影響。

表1 褪黑素對豬卵母細胞體外成熟率的影響

2.2 褪黑素對豬體外受精胚胎發(fā)育能力的影響 表2 顯示，各處理組卵裂率無顯著差異，但在培養(yǎng)168 h 后，褪黑素組的囊胚率顯著高于對照組和褪黑素+Luzindole組，后2 組間差異不顯著。

表2 褪黑素對豬體外受精胚胎發(fā)育能力的影響

2.3 褪黑素對豬卵母細胞多精受精發(fā)生率的影響 在胚胎培養(yǎng)10 h 后，檢測豬卵母細胞多精受精發(fā)生情況，如表3 所示，褪黑素組的多精受精率低于對照組及褪黑素+Luzindole 組（<0.05），雙原核胚胎形成率高于其他2 組（<0.05）。

表3 褪黑素對豬卵母細胞多精受精發(fā)生率的影響

2.4 褪黑素對成熟豬卵母細胞皮質(zhì)顆粒分布情況的影響由圖1 可知，褪黑素組皮質(zhì)顆粒正常分布率高于對照組和褪黑素+Luzindole 組（<0.05）。

圖1 褪黑素對成熟豬卵母細胞皮質(zhì)顆粒分布情況的影響

2.5 褪黑素對成熟豬卵母細胞高爾基體分布情況的影響由圖2 可知，褪黑素組高爾基體正常分布率高于對照組和褪黑素+Luzindole 組 （<0.05）。

圖2 褪黑素對成熟豬卵母細胞高爾基體分布情況的影響

3 討 論

本研究于豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液中添加褪黑素或褪黑素+Luzindole，檢測褪黑素對豬卵母細胞體外成熟及多精受精中的影響，結(jié)果顯示，各組間卵母細胞核成熟率無顯著差異，而褪黑素組多精受精率顯著下降，體外受精后囊胚形成率顯著提高，同時，卵母細胞皮質(zhì)顆粒、高爾基體正常分布率顯著增加。

3.1 褪黑素對豬卵母細胞體外成熟及胚胎發(fā)育的影響褪黑素作為重要的抗氧化劑，在卵母細胞體外成熟過程中發(fā)揮著極為重要的作用。有研究表明，在小鼠、牛卵母細胞體外成熟過程中添加褪黑素可以明顯改善卵母細胞的胞質(zhì)成熟能力，如改善線粒體功能，提高GSH、ATP 水平及抗氧化基因的表達，改善DNA 損傷，調(diào)節(jié)卵母細胞脂質(zhì)代謝，改善卵母細胞成熟質(zhì)量等。本研究中，卵母細胞核成熟數(shù)據(jù)顯示，各組間核成熟率并無顯著性差異。在此前的研究中，He和Yaacobi-Artzi 等分別在小鼠和牛中也發(fā)現(xiàn)了同樣的結(jié)果。而后，將成熟卵母細胞進行體外受精，發(fā)現(xiàn)褪黑素可顯著提高囊胚形成率，而在褪黑素及其拮抗劑Luzindole 共培養(yǎng)時，該現(xiàn)象被明顯抑制。據(jù)此推測，在豬卵母細胞體外成熟過程中，添加外源褪黑素盡管未能提高核成熟率，但很有可能提高卵母細胞的胞質(zhì)成熟能力，進而改善體外受精胚胎的發(fā)育能力。

3.2 褪黑素對豬卵母細胞多精受精的影響 據(jù)報道，卵母細胞的體外受精及胚胎發(fā)育能力與卵母細胞的成熟質(zhì)量密切相關(guān)，但在體外成熟過程中，卵母細胞常常受到氧化應(yīng)激影響，導(dǎo)致核質(zhì)成熟不同步，即當(dāng)卵母細胞內(nèi)的胞質(zhì)成熟相關(guān)因子如細胞器分布等積累到成熟標準之前，細胞核會率先成熟，致使卵母細胞成熟質(zhì)量較差。當(dāng)質(zhì)量較差的卵母細胞進行體外受精時，阻止多精受精的屏障尚未建立完全，即皮質(zhì)反應(yīng)或透明帶反應(yīng)不充分。本研究發(fā)現(xiàn)褪黑素可顯著提高豬卵母細胞體外受精后的雙原核胚胎率，同時顯著降低多精受精的發(fā)生率。本研究結(jié)果證實褪黑素可顯著降低豬卵母細胞多精受精的發(fā)生。

3.3 褪黑素對豬卵母細胞皮質(zhì)顆粒及高爾基體分布的影響 皮質(zhì)顆粒是受精前存在于卵母細胞質(zhì)膜下的皮質(zhì)層中的分泌小泡。在卵母細胞成熟過程中，皮質(zhì)顆粒數(shù)量不斷增加并逐漸向質(zhì)膜遷移，呈線狀排列，這是卵母細胞質(zhì)成熟的標志之一。卵母細胞受精時，當(dāng)?shù)?個精子與卵母細胞融合，皮質(zhì)顆粒會發(fā)生胞吐作用，以防止其余精子與卵母細胞融合。卵母細胞體外受精過程中的多精受精率較高，一部分原因是由于皮質(zhì)顆粒未遷移至質(zhì)膜區(qū)域或皮質(zhì)顆粒數(shù)量較少，致使皮質(zhì)反應(yīng)不充分，從而導(dǎo)致卵母細胞不能有效阻止多精入卵。本研究通過檢測皮質(zhì)顆粒在成熟卵母細胞中的分布情況，發(fā)現(xiàn)在卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液中添加褪黑素可以顯著提高皮質(zhì)顆粒正常分布率。皮質(zhì)顆粒在卵母細胞的高爾基體中產(chǎn)生，同時，高爾基體作為蛋白質(zhì)合成及運輸?shù)募毎?，在卵母細胞成熟過程中發(fā)揮著重要作用。Cui 等研究表明，在卵母細胞成熟過程中添加高爾基體特異性抑制劑會導(dǎo)致減數(shù)分裂進程的損害，同時卵母細胞的胞質(zhì)成熟指標如線粒體分布及皮質(zhì)顆粒分布出現(xiàn)異常。本研究通過檢測卵母細胞中高爾基體分布情況，發(fā)現(xiàn)在豬卵母細胞成熟過程中添加褪黑素可以顯著提高高爾基體的正常分布率。由此表明，褪黑素可以明顯提高與多精受精相關(guān)的細胞器，即皮質(zhì)顆粒和高爾基體在成熟豬卵母細胞中的正常分布情況。

4 結(jié) 論

本實驗結(jié)果顯示，在豬卵母細胞體外成熟過程中添加1nmol/L 的褪黑素雖然沒有提高豬卵母細胞的核成熟率，但可明顯提高豬卵母細胞體外受精后囊胚形成率，同時提高了豬卵母細胞成熟時期的皮質(zhì)顆粒、高爾基體的正常分布率，進而抑制了豬卵母細胞的多精受精發(fā)生